Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden.

Zusammenfassung

Die Analyse von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und ihre Interaktion in vaskulären biology beteiligt Liganden ist oft eine Herausforderung aufgrund der konstitutiven Expression von Familien von verwandten Rezeptoren, ein breites Spektrum von verwandten Liganden und der Schwierigkeit, mit primären Kulturen von spezialisierten Endothelzellen handelt. Hier beschreiben wir einen Bioassay zum Nachweis von Liganden an den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (VEGFR-2), einem Schlüssel Wandler von Signalen, die Angiogenese und Lymphangiogenese fördern. Eine cDNA, die eine Fusion des extrazellulären (Liganden-bindenden) -Region von VEGFR-2 mit der Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen des Erythropoietin-Rezeptor (EpoR) ist in der faktorabhängigen Zelllinie Ba / F3 ausgedrückt. Diese Zellinie wächst in Gegenwart von Interleukin-3 (IL-3) und Entnahme dieses Faktors führt zu dem Tod der Zellen innerhalb von 24 Std. Die Expression des VEGFR-2 / EpoR-Rezeptor-Fusions stellt einen alternativen Mechanismus Überleben und Potentia zu fördernlly Proliferation von stabil transfizierten Ba / F3 - Zellen in Gegenwart eines Liganden, die zur Bindung und Vernetzung der extrazellulären Teil des Fusionsproteins (dh eine , die kann vernetzen die VEGFR-2 extrazellulären Region). Der Test kann in zwei Arten durchgeführt werden: eine semi-quantitative Ansatz, bei dem kleine Mengen von Ligand und die Zellen in 24 Stunden ein schnelles Ergebnis ermöglichen und eine quantitative Ansatz, der Surrogatmarker einer Lebendzellzahl. Der Test ist relativ einfach durchzuführen, ist in hohem Maße reaktions bekannten VEGFR-2-Liganden und extrazellulären Inhibitoren der VEGFR-2-Signalisierungs wie monoklonale Antikörper gegen den Rezeptor oder Liganden und lösliche Ligandenfallen aufnehmen kann.

Einleitung

Die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) -Familie von sekretierten Protein Wachstumsfaktoren und ihre verwandten Zelloberflächenrezeptoren eine wichtige und vielfältige Gruppe von löslichen Liganden und Membran eingebettetem Rezeptoren bzw. diese Funktion in Signale über Zellmembranen transduzieren. Sie funktionieren vorwiegend in Endothelzellen , sondern auch in Zellen epithelialen Ursprungs und diejenigen des Immunsystems ^1,2. Signalisierungs Eingriff Wege durch Liganden-aktivierte VEGF-Rezeptoren (VEGFRs) sind kritisch in großen Pathologien, wie altersbedingte Makuladegeneration und Krebs und Therapeutika ihnen sind in häufigen klinischen Gebrauch (zum Beispiel der monoklonale Antikörper Bevacizumab, die VEGF-A Targets) Targeting ^3,4.

Einer der Komplexität der VEGF-Familie ist die Vielfalt der löslichen Liganden in der Natur (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-Proteine ​​durch die Parapockenvirusfamilie orf und Schlangengift VEGF codiert, plus andere hemmendIsoformen von VEGF-A) ^2.

Diese Liganden interagieren mit drei Mitgliedern der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Familie, nämlich VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3. Diese Rezeptoren sind variabel auf verschiedenen Zelltypen exprimiert werden jedoch oft coexprimiert auf der Oberfläche von endothelialen Zellen , die Blut und Lymphgefäße aller Größen ⁵ auskleiden. VEGFR-2 binden kann die Säugetier-VEGF-A ^6, VEGF-C - ⁷ und VEGF-D ^8,9 sowie orf - Virus VEGF ¹⁰ und Schlangengift VEGF ¹¹ - Liganden. VEGFR-2 spielt eine wichtige Rolle der Angiogenese (das Wachstum neuer Blutgefäße aus bestehenden Gefäßen) in der Embryonalentwicklung, Wundheilung, Krebs und Augenkrankheiten in Fahrt. In diesen Zusammenhängen Liganden wie VEGF-A, -C und -D binden und aktivieren den Rezeptor auf den Blut vaskulären Endothelzellen ^12-15. Auf lymphatischen Endothelzellen spielt VEGFR-2 eine Rolle bei der Lymphangiogenese, die Bildung neuer Lymphgefäße ^16. VEGFR-2 kann auch ¹⁷ Erweiterung und den Ausbau der großen Arterien und Lymphgefäße in gesunden Geweben und Krankheiten zu fördern. Ein vollständiges Verständnis von VEGFR-2: Ligand - Wechselwirkungen ist daher wichtig für die Entwicklung von Inhibitoren für die Verwendung in ¹⁸ - Angiogenese-abhängigen Erkrankungen zu behandeln. Während die meisten Isoformen von VEGF-A - Bindung an VEGFR-2 wird proteolytische Spaltung von VEGF-C und VEGF-D erforderlich , der VEGF-Homologiedomäne ein Fragment freizusetzen , besteht, die die Bindung an VEGFR-2 ^19,20 eine hohe Affinität aufweist.

Wir haben ein Bioassay entwickelt Liganden von VEGFR-2 zu überwachen , die ausgelegt ist , die Notwendigkeit einer primären Endothelzellen zu umgehen, die für den Durchgang technisch schwer, teuer in der Anschaffung und die Kultur (erfordern spezielle Medium) ²¹ und mehrere VEGFRs exprimieren und co- assoziierten Rezeptoren ^22. Heterodimerisierung von VEGFR-2 mit anderen VEGF-Rezeptoren oder Co-Rezeptoren können unerwünschte Komplexität verursachen, wenn sie zu dem Ziel Bolzeny binäre Rezeptor-Ligand - Wechselwirkungen, Aktivität zurückzuführen auf einen spezifischen Rezeptor bewerten, oder die Wirkung von hemmenden Reagenzien zu beurteilen. ^23. Der Bioassay behält Beweglichkeit des entsprechenden Rezeptor in der Zellmembran und erlaubt die Bewertung der Fähigkeit eines Liganden zu binden und zu vernetzen, das VEGFR-2-extrazelluläre Region.

Der Bioassay beruht auf der Schaffung eines chimären Rezeptors, in dem die extrazelluläre Region eines VEGF-Rezeptors (in diesem Fall VEGFR-2) an die Transmembran- geschmolzen und intrazellulären Regionen des Erythropoietin-Rezeptor (EpoR), ein Mitglied der Zytokin-Rezeptor-Familie ^8,24. Dieses Fusionsprotein wird dann in der faktorabhängigen Pro-B-Zelllinie Ba / F3, auf die Stimulation mit einem Liganden, die zur Bindung und Vernetzung der extrazellulären Domäne des Rezeptors verursacht die Aktivierung der cytoplasmatischen Effektorregion exprimiert, die fähig ist, von ein Überlebenssignal über Janus-Kinasen (JAKs) Umwandlungs-Zelle zu fördernÜberleben und / oder Proliferation. Im Gegensatz dazu ist die Expression von Volllängen-VEGFR-2 in dem gleichen Zelltyp, und die Stimulation mit dem Liganden, was anzeigt, nicht das Überleben der Zelle und die Proliferation fördert, dass der proximale Signalisierungs Effektoren des VEGFR-2-Weg in diesem Zelltyp nicht verfügbar sind.

Wir haben den Test in einer Vielzahl von Kontexten verwendet zu erforschen Bindung von neuartigen VEGFR-2 - Liganden ^{10,19,20,24-29.} In Kombination mit einer VEGFR-3-EpoR-Ba / F3 - Assay haben wir die relativen Aktivitäten der VEGF-C und VEGF-D - Wachstumsfaktoren für die Bindung und Vernetzung VEGFR-2 und VEGFR-3 ³⁰ verglichen. Der Test wurde durchgeführt ³¹ , um die inhibitorische Aktivität von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern gegen VEGFR-2 oder VEGF-D, VEGFR-2 lösliches Falle und Peptidomimetika Targeting der VEGF - Familie zu charakterisieren. Der Test wurde auch in primären Endothelzellen zu zeigen, die Fähigkeit von VEGF aus verschiedenen orf-Virus-Stämme zu binden und zu vernetzen, VEGFR-2 vor dem Test verwendet ^{10,26. Der Test ist besonders nützlich für das schnelle Screening von Mutanten von VEGFs , die schnell auf ihre Aktivität untersucht werden können , bevor sie den mühsamer Endothelzelle Assays eingeführt werden , 25 oder bei der Beurteilung Protokolle zur Reinigung von Wachstumsfaktoren 27.}

Der Test wir beschreiben, ist einfach durchzuführen, und die semi-quantitative Version ermöglicht eine schnelle Bestimmung, die manchmal erforderlich sind, wenn die Herstellung oder Reinigung von Wachstumsfaktoren überwacht wird, Antikörper oder löslicher Rezeptordomänen für andere Experimente. Die einfache Bedienung des Assays ist es eine ideale Ergänzung zu weiteren und umfassendere Studien mit primären endothelialen Zellen aus Blut oder Lymphgefäße aus bestimmten Geweben oder Organsysteme abgeleitet durchgeführt.

Protokoll

Quelle von IL-3 und Herstellung von WEHI-3D-konditioniertem Medium

Hinweis: Die Maus granulocytic Leukämiezelllinie WEHI-3D ​​kultiviert wird ein konditioniertes Medium, das IL-3 zu erzeugen.

1. Kultur WEHI-3D ​​in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS), 1% langlebige Glutaminergänzung, 50 ug / ml Gentamicin. Beimpfen von 5 × 10 ⁶ Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in 50 ml frischem Kulturmedium in einem T175 cm ³ Gewebekulturflasche und wachsen etwa 7 Tage , oder bis die Zellen die log - Phase des Wachstums vergingen etwa 24 bis 48 hr (übermäßige Zelltod in der Kultur zu vermeiden). Konditioniertes Medium ist in der Lage für mehrere Jahre bei -20 ° C gelagert werden, so Chargen von 200-500 ml auf einmal hergestellt werden.
2. Dekantieren Flüssigkeit und Zellen aus den Kolben und Schleudern bei 1000 x g für 15 min Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Entfernen Sie die obere 90% der supernatant. Man filtriert durch ein 0,22 um-Filtereinheit.
3. Aliquot WEHI-3D-konditioniertem Medium (CM) in 1 ml, 50 ml und 200 ml-Volumina für die Lagerung bei -20 ° C oder -70 ° C. Kleiner Aliquots sind nützlich für die Probenaufbereitung, Zwischenvolumen zur Herstellung von Kulturmedium für den Durchtritt von faktorabhängigen Zelllinien und größere Volumina für die Langzeitlagerung. IL-3 ist relativ stabil bei 4 ° C so aufgetauten Medium kann, wenn unter sterilen Bedingungen für einige Wochen gelagert werden.
4. Alternativ verwenden, rekombinantes Maus-IL-3 auf einem Niveau von 50 ng / ml in Kulturmedium verdünnt, nachdem sie durch ein 0,22 um-Filtereinheit gefiltert wird.

2. Kultur und Evaluierung von VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 und die Kontrolle von Ba / F3-Zelllinien

1. Kulturkontrolle Ba / F3-Zellen in DMEM, 10% FBS, 50 & mgr; g / ml Gentamicin oder Penicillin / Streptomycin Ergänzungsmittel, 1% stabilisiert L-Glutamin und 10% WEHI-3D-CM. Passage-Zellen um 1:15 Verdünnungen etwa alle drei Tage von Zellenin der log-Phase wachsen.
2. Kultur VEGFR2-EpoR-Ba / F3-Zellen in DMEM, 10% FBS, 50 & mgr; g / ml Gentamycin, 1% stabilisiert L-Glutamin und 10% WEHI-3D-CM und 1 mg / ml G418. Passage-Zellen um 1:15 Verdünnungen von Zellen in der log-Phase wachsen. Siehe ²⁴ für mehr Details über die Konstruktion und Expression des chimären Rezeptors.
3. Erntesteuerung Ba / F3 oder VEGFR2-EpoR-Ba / F3-Zellen, die aus der mittleren logarithmischen Phase Kulturen. Vorsichtig pipettiert, diese nicht-adhärenten Zellen aus dem Boden des Kolbens zu entfernen. Waschen dreimal in Maus Tonizität phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,3 (PBS) (10 ml, Zentrifugieren bei 750 x g für 5 min Zellpellet wiederherzustellen) Medium , enthaltend IL-3 zu entfernen.
4. Wasche die Zellen einmal mit DMEM und Zusatzstoffe, ohne die WEHI-3D-CM oder rekombinantem IL-3, und dann in diesem Medium bei einer Konzentration von 7,4 × 10 ⁴ Zellen / ml (dh 1.000 Zellen pro 13,5 & mgr; l resuspendieren; 10.000 Zellen pro 135 & mgr; l, wie durch Zählen mit einem Hämozytometer bestimmt) fürverwenden in den semi-quantitative oder quantitative Versionen des Assays sind.
5. Beurteilen Sie Zellen für die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss (ACHTUNG). Mischungs Trypan-Blau in PBS (0,4%) 1: 1 mit der Zellpopulation und zählen ein Minimum von 100 Zellen auf einem Hämozytometer. Zellen, die den Farbstoff aufzunehmen sind tot oder sterbend betrachtet. Lebensfähigkeit von mehr als 98% erforderlich, um den Test durchzuführen.

3. Halb quantitative Assay

1. Hinzufügen gewaschenen Zellen (1000 Zellen) enthielt in 13,5 & mgr; l IL-3-defizienten Medium zu den Vertiefungen einer 72-well Mikrotiterplatte bei RT. Achten Sie darauf, die Zellsuspension zu mischen während Aliquotierung Zelle Einschwingzeit, um sicherzustellen, durch die Schwerkraft nicht Bias Zellkonzentration. Verwenden Sie einen gut kalibrierten P20 automatisierte Pipette und autoklavierten Spitzen.
2. Hinzufügen Testproben und Kontrollen in die Vertiefungen bei 10% Volumen (1,5 & mgr; l, um ein Endvolumen von 15 ul, enthaltend 1.000 Zellen pro Vertiefung zu machen), um eine kalibrierte P20 Pipette oder bevorzugt P2 Pipette. Nehmen care, um sicherzustellen, dass die Proben mit den Kulturbedingungen für die Ba / F3-Zellen im Hinblick auf pH, Salz und anderen potentiell cytotoxische / cytostatische Substanzen kompatibel sind. Wo es möglich ist , verwenden Sie ein kompatibles Medium oder Puffer (zB DMEM oder PBS, jeweils) oder in einem solchen Medium oder Puffer verdünnen. Verreiben mit der gleichen Spitze wird das Mischen zu gewährleisten.
3. Für die Kontrollproben, umfassen (i) Medium allein enthaltenden kein IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM hinzugefügt Medium allein bei 10% Endvolumen; und / oder (iii) VEGF-A allein zu 100 ng / ml in Medium verdünnt, die kein IL-3.
4. Füllen Sie alle nicht verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit sterilem Wasser, PBS oder Medium und legen Sie die Platte in einem befeuchteten Behälter (mit Wasser getränkt Seidenpapier) ermöglicht Gasaustausch. Inkubiere Zellen innerhalb der Behälter in einer befeuchteten Atmosphäre von 10% CO _2. Dieser Test kann bequem in 3 Stunden von einer Person aufgebaut werden, wenn die Testproben und Media-Komponenten zur Verfügung stehen.
5. Beurteilen Sie Platten typischerweise nach 16 hInkubation bei welcher Zeit die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Proben offensichtlich. Siehe Abbildung 3 für Beispiele, wie Zellen in Kultur erscheinen. Analysieren Platten mit einem Standard-invertierten Phasenkontrastmikroskop bei 40 bis 100-facher Vergrößerung.
   Anmerkung: Wells stützende Wachstumsfaktoren wie IL-3 oder VEGF-A enthält, enthalten Zellen, die rund und durchscheinend erscheinen. Wells ohne unterstützende Wachstumsfaktoren oder mit Medium wird allein eine verringerte Anzahl von runden Zellen, sowie tote oder sterbende Zellen und Zelltrümmer (zB 3C). Auswertung des Tests bei 24 bis 48 Stunden nach der Inkubation ist das Optimum für Empfindlichkeit.

4. Quantitative Bioassay

1. Hinzufügen gewaschenen Zellen (10.000 Zellen in 135 ul) in IL-3-defizienten Medium zu den Vertiefungen einer Standard-96-Well-Mikrotiterplatte bei RT. Achten Sie darauf, die Zellsuspension zu mischen während Aliquotierung Zelle Absetzen durch Schwerkraft, um sicherzustellen, nicht ce beeinflussenll Konzentration.
2. In Testproben und Kontrollen in die Vertiefungen bei 10% Volumen (15 ul) mit einer kalibrierten Pipette (P20). Achten Sie darauf, um sicherzustellen, dass die Proben mit den Kulturbedingungen kompatibel sind für Ba / F3-Zellen in Bezug auf pH-Wert, Salz oder andere potenziell zytotoxischen / zytostatischen Substanzen. Wo es möglich ist , verwenden Sie ein kompatibles Medium oder Puffer (z. B. DMEM oder PBS) oder in einem solchen Medium oder Puffer verdünnen. Filter sterilisieren kleine Volumina mit einem 0,22 um Poren Celluloseacetat Zentrifugenröhrchen Filtereinheit.
3. Inkubieren der Mischung von Zellen, Wachstumsfaktoren und / oder Inhibitor Mittel in einer befeuchteten Atmosphäre von 10% CO ₂ für 48 Stunden. Führen Sie den Test in einem befeuchteten Behälter, die mit Wasser getränkten Tissue-Papier und ermöglicht Gasaustausch hat. Bei der Beendigung der Inkubationsperiode bewerten Assay eines der alternativen Verfahren unter Verwendung der unten aufgeführten und Surrogatmarker der Lebendzellzahl in dem Bohrloch.
4. Alternative # 1: ³ H-thymidine Incorporation
   Anmerkung: Diese Quantifizierung der 96-Well-Plattenformat ausgelegt ist.
   1. Nach der Inkubation der Testplatten für 48 Stunden bei 37 ° C (150 & mgr; l Volumen pro Napf), fügen ³ H-Thymidin in einem Volumen von 50 ul Testmedium (Ba / F3 Kulturmedium ohne IL-3 / WEHI-3D ​​- CM) pro Vertiefung in einer Konzentration von 20 & mgr; Ci / ml, eine letzte Dosis von 1 uCi pro Vertiefung ergibt.
   2. Inkubieren Platten für weitere 4 Stunden bei 37 ° C vor der Zellen unter Verwendung eines Zellernters der Ernte. Extrahieren von einzelnen Proben, die durch die Filter in scintillant platzieren und zu quantifizieren, mit einem Flüssigszintillationszähler.
5. Alternative # 2: Biolumineszenz Detektion von Cellular ATP
   Anmerkung: Dieser Ansatz verwendet ein ATP Überwachung Reagenz, welches, wenn es mit Zelllysat kombiniert können ein Biolumineszenz-Signal erzeugen, das die lebensfähigen Zellen in der Population widerspiegelt.
   1. Lyse Zellen ATP zu extrahieren und ein ATP-Monitoring-Reagens verwenden, um eine generierenLumineszenzsignal gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lesen Lumineszenz eines Luminometers kompatibel mit einer 96-Well-Platte-Format.
6. Alternative # 3: Enzymatische Reduktion eines Indikatorfarbstoffes durch Viable Cells
   Hinweis: Resazurin basierte Assays gute Korrelation zu der Lebensfähigkeit der Zellen zeigen.
   1. Kombinieren Sie kultivierten Zellen mit dem Resazurin Farbstoff auf der Basis und zu quantifizieren Assays ein Fluoreszenz-Plattenleser gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

In diesem Abschnitt zeigen wir die Ergebnisse eines Experiments , die wesentlichen Merkmale eines VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay zeigt (Abbildung 1 für Prinzipien des Tests sehen). Andere veröffentlichte Studien zeigen , breitere Anwendungen des Assays für alternative VEGFR-2 - Liganden, mutierten VEGF - Moleküle und hemmenden monoklonalen Antikörpern ^{8,10,19,24-30.}

Die hier dargestellten Daten ste...

Diskussion

Der Test hier beschriebenen beruht auf Zellen hoher Lebensfähigkeit mit Hilfe der für Wachstumsfaktoren abhängig sind. Zellen müssen daher sorgfältig kultiviert werden sie Faktor abhängig zu gewährleisten, und die Expression des chimären Rezeptors binden. Um sicherzustellen, dass das Medium frisch hergestellt ist und nicht für einen zu langen Zeitraum gespeichert und dass WEHI-3D-CM ist hochaktiv ist wichtig. Zellen benötigen, von IL-3 enthaltendem Medium in das Assaymedium gründlich gewaschen werden, um sicherzustellen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154	0,4% ige Lösung in PBS wird 1:1 mit Zellsuspensionen zur Messung lebensfähiger Zellen verwendet. Gefährdung kann Krebs verursachen
G418 Sulfat (Geneticin)	Invivogen	ant-gn-5	Mittel zur Selektion transfizierter eukaryotischer Zellen. Gefahr - Kann Allergie- oder Asthmasymptome oder Atembeschwerden verursachen.
3H-Thymidin	PerkinElmer	NET-027	Dieses radioaktive Nukleosid wird während der Mitose in die chromosomale DNA eingebaut. Hazard-radiation
Vialight Plus Kit	Lonza	LT07-221	Biolumineszenz-Nachweis von zellulärem ATP zur Quantifizierung der Lebensfähigkeit unter Verwendung des ATP-Überwachungsreagenzes
Prestoblue Reagenz für die Lebensfähigkeit von Zellen Invitrogen		A13261	Resazurin-basierter Indikator für die Lebensfähigkeit von Zellen. Färbt sich in der reduzierenden Umgebung der Zelle
rot Nunc Minitray mit Nunclon Delta Oberfläche (72 Well)	Thermo Scientific	136528	Kleine Mikrotiterplatte
96 Well Gewebekulturplatte	Falcon, Corning Inc.
DMEM (1X)	Gibco	11965-92
GlutaMAX (100X)	Gibco	35050-061
Fötales Rinderserum	Gibco	10099-141
Zell-Harvester	Tomtec Life Sciences		Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Zell-Harvester
Flüssig-Szintillationszähler	LKB Wallac	1205	LKB Wallac 1205 Betaplate Szintillationszähler
UniFilter-96 GF/B	Perkin Elmer	6005177	Weiß 96-Well-Barex-Mikroplatte mit GF/B-Filtervon 1 & Mikro; m porengröße
Gentamicin	Gibco, Life Technologies	15750-060
Penicillin/Streptomycin	Gibco, Life Technologies	15140-122
0,22 μm Poren-Celluloseacetat-Zentrifugenrohr-Filtereinheit	Costar, Corning Inc.	8160	Zentrifugenrohrfilter haben einen 0,22 & Mikro; m pore CA membranhaltige Filtereinheit innerhalb einer 500 µ Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit L-Kapazität.
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