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Methodenartikel

TRUE Gene Silencing: Screening eines Heptamer-Typ Kleiner Leitfaden RNA-Bibliothek für potentielle Krebs Therapeutika

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DOI:

10.3791/53879

⸱

2. Juni 2016

 ,  ,  , 
1Research Institute for Healthy Living, Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs.

Zusammenfassung

TRUE Gen - Silencing (genannt nach tR Nase Z L - u e fficacious gene silencing tilizing) ist eine von der RNA-gerichtete Gen - Silencing - Technologien, die eine künstliche kleine Führungs RNA (sgRNA) verwendet tRNA 3' - Prozessierung Endoribonuklease zu führen, tRNase Z L eine Ziel-RNA zu erkennen. sgRNAs kann durch Zellen ohne Transfektionsreagentien aufgenommen werden und können ihre Ziel-RNA-Niveaus und / oder induzieren Apoptose in menschlichen Krebszellen downregulate. Wir haben eine sgRNA Bibliothek mit 156 Heptamer-Typ sgRNAs für die Wirkung auf die Lebensfähigkeit von menschlichen Myelom und Leukämie-Zellen gescreent, und fand, daß 20 von ihnen effizient Apoptose in zumindest einer der Krebszelllinien induzieren kann. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs. Das Protokoll enthält, wie die sgRNA Bibliothek zu konstruieren, wie die Auswirkungen der einzelnen sgRNA auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten und wie fueitere bewerten die effektiven sgRNAs mittels Durchflusszytometrie. Rund 2.000 Treffer wäre zu erwarten, durch das Screening der Full-Scale sgRNA Bibliothek von 16.384 Heptamere zusammengesetzt zu erhalten.

Einleitung

TRUE Gen - Silencing (genannt nach tR Nase Z L - u e fficacious gene silencing tilizing) ist einer der RNA-directed gene silencing Technologien 1. Diese Technologie wurde auf die Eigenschaften von tRNase Z L (oder 3 'tRNase), tRNA 3' - Prozessierung Endoribonuclease entwickelt basiert: es jedes Ziel - RNA an einer erwarteten Stelle unter der Leitung eines künstlichen kleinen Führungs RNA spalten kann (sgRNA) durch eine Anerkennung pre-tRNA-ähnlichen oder Mikro pre-tRNA-ähnlichen Struktur zwischen der Ziel - RNA gebildet , und der sgRNA 2-9. sgRNA, die in der Regel 7-31 nt in der Länge, ist in vier Gruppen eingeteilt, 5'-Hälfte-tRNA, RNA Heptamer, 14-nt RNA linear und hook RNA.

Wir haben die Wirksamkeit von TRUE gene silencing demonstriert durch verschiedene künstlich gestaltete sgRNAs Einführung in die Zellen 10 leben - 15. Wir haben auch gezeigt, dass sgRNAs durch Zellen wi aufgenommen werden kann,thout jegliche Transfektionsreagenzien und können ihre Ziel - RNA - Niveaus downregulate und / oder Apoptose in menschlichen Krebszellen induzieren 16 - 18. TRUE Gen - Silencing erscheint auf dem intra- und interzellulären Genregulationsnetz System über tRNase Z L und natürliche sgRNAs 19 zu arbeiten - 21.

Wir haben eine sgRNA Bibliothek mit 156 Heptamers-Typ sgRNAs konstruiert 22 für potentielle therapeutische Heptamers-Typ sgRNAs für Blutkrebs zu suchen. Wir haben es für die Wirkung auf die Lebensfähigkeit von menschlichen Myelom und Leukämie-Zellen gescreent, und fand, daß 20 von ihnen effizient Apoptose in zumindest einer der Krebszelllinien induzieren kann. Und 4 von ihnen haben gezeigt, dass Tumorwachstumsraten in Maus-Xenograft Experimente reduzieren.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorführung eines Heptamers-Typ sgRNA Bibliothek für potenzielle therapeutische Medikamente gegen Blutkrebs. Das Protokoll enthält, wiezu konstruieren, die sgRNA Bibliothek, wie die Auswirkungen der einzelnen sgRNA auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten und wie Zytometrie die effektiven sgRNAs durch die Strömung weiter auszuwerten. Analyse für sgRNA der zellulären Ziel - RNAs und Bewertung der effektiven sgRNAs in Modellen Maus - Xenotransplantat kann nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden 17,22, obwohl diese in diesem Protokoll nicht enthalten.

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Protokoll

1. Aufbau eines Heptamer-Typ sgRNA Bibliothek

  1. Wählen einer Teilmenge der 16.384 (4 7) 7-nt - Sequenzen , wenn der umfassende Bibliothek konstruiert werden soll.
    HINWEIS: Die Sequenzen können statistische und / oder gestaltet sein, spezifische zelluläre RNAs abzuzielen. Für letztere hairpin - Strukturen ähnlich der T-Arm von tRNA in einer Ziel - RNA mit Hilfe eines geeigneten Computerprogramms zu finden und / oder optisch und wählen Sequenzen komplementär zu 7-nt - Sequenzen unmittelbar stromabwärts der Haarnadelstrukturen 4,10, 17,18.
  2. Synthetisieren jedes der ausgewählten Heptamere als ein vollständig 2'- O -methylated, 5'- und 3'-phosphorylierter RNA mit einem DNA / RNA - Synthesizer. Verwenden Sie die Phosphoramidit-Methode auf dem Glas mit kontrollierten Poren (CPG) Unterstützung, und lassen Sie das 5'-terminale 4,4'-Dimethoxytrityl (DMT) Gruppe im letzten Zyklus zu schützen (die Zugabe des Phosphat '5) der Synthese 23.
    HINWEIS: Benutzerdefinierte synth e tisches RNA kann auch von Oligonukleotid-Lieferanten erhalten werden.
  3. Nach Abschluss der letzten Synthesezyklus, übertragen Sie die CPG mit dem synthetisierten Oligonukleotid aus der Säule in eine Glasampulle mit einem Schraubverschluss Teflon-Liner, 1 ml von 29% Ammoniumhydroxid und brüten sie bei 55 ° C für 8 h auf das Oligonucleotid von dem CPG abzuspalten und die Schutzgruppen von den Basen und Phosphaten entfernen.
  4. Verdunsten Ammoniumhydroxid mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C und wieder aufzulösen das Oligonucleotid in 0,2 ml 0,1 M n-hexylammonium acetat.
  5. Reinige den synthetischen Oligonukleotids durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung eines Polystyrol-Divinylbenzol-Säule mit einem Puffer, der 10-50% Acetonitril / 0,1 M n-hexylammonium acetat. Führen Sie die Säule bei 2,0 ml / min für 25 min bei 80 ° C.
  6. Hinzufügen 0,25-0,5 ml konzentrierter Essigsäure zu der fraktionierten Probe (1-2 ml), eine 20% ige Essigsäurelösung zu machen, und Incubate diese Lösung für 1 h bei Raumtemperatur die DMT-Gruppe zu entfernen.
  7. Trocknen der Probe mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C, wieder aufzulösen sie in 1 ml von 29% igem Ammoniumhydroxid, und Inkubieren der Lösung für 15 min bei Raumtemperatur die Seitenkette des 5'-Phosphat zu entfernen.
  8. Reduzieren das Volumen (1 ml) der Probe auf etwa 0,3 ml mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C.
  9. Dialysieren die gesamte konzentrierte Probe gegen destilliertes Wasser (500 ml) über Nacht einen Dialyseschlauch mit einem Molekulargewichts-Cut-off 1000 bei 4 ° C verwendet wird.
  10. Übertragen die dialysierte Probe aus dem Dialyseschlauch in ein 1,5-ml-Röhrchen mit einer Pipette, trocknen mit einem Zentrifugal-Verdampfer bei 40 ° C und anschließend wieder aufzulösen es in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser, dessen Volumen sollte klein genug, um eine von mehr als 100 uM Lösung herzustellen.
  11. Messen, um eine optische Dichte der RNA bei 260 nm mit einem Spektrophotometer und stellen seine Konzentration auf 100uM von Wasser zur Injektion-grade Zugabe von Wasser. Speichern die RNA-Lösung bei unter -20 ° C vor dem Gebrauch.

2. Screening der sgRNA Bibliothek für Zell Viability

  1. Vorbereitung 10 3 Zellen / 99 ul / Vertiefung (beispielsweise HL60 und RPMI-8226) auf einer Schale mit 96 Vertiefungen in RPMI-1640 - Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin - Lösung. Bereiten Vertiefungen, die die Medien nur für Untergrundsubtraktion. Zur Vermeidung von Randeffekten, fügen Sie steriles Wasser zu leeren Brunnen rund um die Probenvertiefungen.
  2. 1 ul Heptamers-Typ sgRNA (100 & mgr; M), gelöst in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser zu jeder Vertiefung. Assay jedes sgRNA in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 3 Tage.
  3. Eine geeignete Menge eines handelsüblichen WST-8-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C im selben Inkubator für 1 bis 4 Stunden.
  4. Messen Sie die Absorption einT 450 nm mit einem Mikroplattenleser.
    HINWEIS: In den meisten Fällen Linearität zwischen Extinktion und Lebendzellzahl wird beibehalten werden, es sei denn der Wert Extinktion 1,0 übersteigt.

3. Bewertung der effektiven sgRNAs durch Durchflusszytometrie

  1. Vorbereitung 10 3 Zellen / 99 ul / Vertiefung (beispielsweise HL60) auf einer Schale mit 96 Vertiefungen in RPMI-1640 - Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin - Lösung. Vorbereitung mindestens 10 Vertiefungen für eine sgRNA getestet werden. Zur Vermeidung von Randeffekten, fügen Sie steriles Wasser zu leeren Brunnen rund um die Probenvertiefungen.
  2. 1 ul Heptamers-Typ sgRNA (100 & mgr; M), gelöst in Wasser für Injektionszwecke geeignetem Wasser zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator für 3 Tage.
  3. Sammeln Sie die mit dem gleichen sgRNA behandelten Zellen von mindestens 10 Brunnen in einen 5-ml-Röhrchen mit einer Pipette. Drehen Sie das Röhrchen 5 min in einer Zentrifuge bei 300 · g, und entsorgen Sie die Medien.
  4. 2 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit dem Rohr und resuspendieren der Zellen. Drehen Sie das Röhrchen 5 min in einer Zentrifuge bei 300 g und verwerfen PBS. Zugabe von 150 ul 1x Annexin V-Bindungspuffer auf das Rohr und die Zellen erneut zu suspendieren.
  5. In 2 ul Phycoerythrin (PE) konjugiertem Annexin V-Lösung und 1 ul 7-Aminoactinomycin D (7AAD) Lösung in das Röhrchen, mischen sie gut, und Inkubation die Röhrchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Analysieren Sie die Probe ein Durchflusszytometer 24 verwendet wird .

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Ergebnisse

Die sechs Heptamer-Typ sgRNAs 5'-AUCUUCA-3 '(H1885), 5'-ACACACA-3' (H3277), 5'-GGGGGCG-3 '(H10927), 5'-GGGGCCC-3' (H10944), 5'-GCCCCCG-3 '(H12287) und 5'-CACCAGC-3' (H13260) wurden chemisch synthetisiert , wie 2' - O - methyl RNA enthaltenden 5'- und 3'-Phosphate.

Diese sgRNAs wurden die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit eines menschlichen Leukämie-Zelllin...

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Diskussion

In den meisten Fällen scheinen vollständig 2′-O-methylierte, 5′- und 3′-phosphorylierte sgRNAs vom Heptamer-Typ, die in Wasser für Injektionszwecke (in einer Konzentration von 100 μM) gelöst wurden, mindestens ein Jahr lang bei unter -20 °C stabil zu sein, wenn man ihre Aktivität zur Induktion von Apoptose in Krebszellen betrachtet. Ihre Stabilität würde sich jedoch je nach Reihenfolge, Qualität und Reinheit ändern. In einigen Fällen scheint 5'- oder 3'-Phosphat eines Teils der sgRNA-Moleküle während der Lagerun...

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Offenlegungen

An der Universität für Pharmazie und angewandte Biowissenschaften Niigata ist eine Patentanmeldung für eine Untergruppe der sgRNAs vom Heptamer-Typ anhängig.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von Anpassungsfähig und Seamless Technologie-Transfer-Programm durch zielorientierte F & E, Japan Science and Technology Agency, die Wissenschaft Forschungsförderungsfonds von der Förderung und den gegenseitigen Aid Corporation für Privatschulen von Japan unterstützt, und die JSPS KAKENHI Grants-Nummern 24300342 und 15H04313 .

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Benutzerdefinierte Heptamer-RNANippon Bioservice OligoSep
Prep HC KartuscheTransgenomic99-3860
Wasser für InjektionszweckeOtsuka Pharmaceutical 7131400A2129
RPMI-1640 mittelWako189-02025
Fötales RinderserumSIGMA-ALDRICH172012-500ML
Penicillin-Streptomycin MischlösungNacalai Tesque26253-84
96 Well PlatteGreiner Bio-one655 180
Zellzählkit-8DOJINDO343-07623WST-8 Lösung
Mikroplatten-Reader, Sunrise Thermo RC-RTEKAN510-82851
FACS RundbodenröhrchenBD Falcon60819-820
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSIGMA-ALDRICHP7059-1L
PE Annexin V BindungspufferBD Biosciences51-66121E
PE Annexin VBD Biosciences51-65875X
7AADSIGMA-ALDRICHA9400-1MG
Durchflusszytometer, FACSCaliburBD Biosciences342973

Referenzen

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Schlagwörter

sgRNA vom Heptamer TyptRNase ZLZellviabilit tsbestimmungDurchflusszytometrieApoptoseinduktionBlutkrebs ScreeningPhosphoramidit Methode
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