Targeting Biofilm Assoziierte<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Verwendung von Resazurin Based Drug-Anfälligkeit Assay

Zusammenfassung

Die meisten bakteriellen Infektionen erzeugen einen Biofilm. Biofilm-assoziierte Bakterien sind aufgrund ihrer Umgebung oft phänotypisch resistent gegen Medikamente. Neuartige antibakterielle Moleküle, die Bakterien in Biofilmen abtöten, haben daher hohe Priorität. Wir etablieren einen Assay, um schnell nach antimikrobiellen Verbindungen zu suchen, die bei der Beseitigung von Biofilmen wirksam sind.

Zusammenfassung

Die meisten pathogenen Bakterien sind in der Lage, während einer Infektion Biofilme zu bilden, aber aufgrund der Schwierigkeit, Biofilme zu manipulieren und zu bewerten, wird der überwiegende Teil der Laborarbeit mit Planktonzellen durchgeführt. Hier beschreiben wir einen Peg-Platten-Biofilm-Assay, wie er mit Staphylococcus aureus durchgeführt wird. Bakterielle Biofilme werden auf Stiften gezüchtet, die an einem 96-Well-Mikrotiterplattendeckel befestigt sind, durch sanftes Eintauchen in Puffer gewaschen und in eine Wirkstoff-Challenge-Platte gelegt. Nach der anschließenden Inkubation werden sie erneut gewaschen und auf eine abschließende Auffangplatte gebracht, in der der Fluoreszenzfarbstoff Resazurin als Viabilitätsindikator dient. Dieser Assay bietet eine deutlich höhere Benutzerfreundlichkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine Fülle von Daten, wenn er als kinetischer Test durchgeführt wird. Darüber hinaus kann dieser Assay an einen Wirkstoffscreening-Ansatz mit mittlerem Durchsatz angepasst werden, bei dem stattdessen eine Endpunkt-Fluoreszenzauslesung vorgenommen wird, was einen Weg für die Wirkstoffforschung bietet.

Einleitung

Pathogene Keime können ¹ Biofilmen in vivo führt zu nicht akuten chronischen Infektionen bilden. Biofilm-assoziierte Infektion ist eine ernste Risikofaktor für medizinische Verfahren , die Implantation von Fremdkörpern (zB künstliche Knochenersatz, Brustimplantate) oder die Installation von Trachealtuben oder Urinkatheter ² beinhalten. In diesen Zusammenhängen ist eine antiinfektive Therapie fast immer notwendig , als Biofilm-basierte Infektionen auf ihren eigenen selten gelöscht werden, selbst in immunkompetenten Individuen. Staphylococcus aureus eine der am häufigsten beobachteten Krankheitserreger in Biofilm-Komplikationen beteiligt ist , während der Verwendung auftreten , von invasive medizinische Geräte ^3.

Sie mehr resistent gegen die Behandlung als planktonischen Zellen ^1,4, und die Bewertung der vorhergesagten klinische Wirksamkeit Leider macht das Wesen von Biofilmen als Schutzbarriere ist ein wichtiger Bestandteil der beiden AnfangsArzneimittelentwicklung sowie Arzneimittelresistenzüberwachung. Es gibt immer mehr Anerkennung , dass Laborbedingungen auf planktonischen Kulturen konzentriert, kann nicht treu reale Krankheit ⁵ darstellen. Weiterhin das Problem Compoundierung, ist die Replikation von Biofilm - Phänotypen schwierig, und vorhandene Biofilm - Modelle sind langwierig und leiden unter hohen inter- und intra Assay Variabilität ^6. viele Forscher, durch die Notwendigkeit, Standard zu planktonischen Zellassays von Medikamentenempfindlichkeit, wodurch möglicherweise ein wichtiger Aspekt der bakteriellen Virulenz zu vernachlässigen und Krankheit So.

Hier beschreiben wir das Protokoll für Bakterien Testen, insbesondere S. aureus, in pre-grown Biofilmen eine 96-Well - basierten Biofilm System ^7,8 verwendet. Während das Protokoll für die Biofilmbildung und die Herausforderung im Wesentlichen die Empfehlungen des Herstellers folgt präsentieren wir eine alternative informationsreiche Methode, um die Lebensfähigkeit des bioF zur Quantifizierungilm nach Herausforderung. Kurz gesagt, sind Bakterien in der Stange Platte kultiviert, wo Biofilmen an der Platte des Deckels angebracht an den vorstehenden Zapfen bilden. Nach der Biofilmbildung sind die Zapfen in die Vertiefungen einer frischen Platte mit PBS gefüllt zu entfernen planktonischen Zellen vorsichtig getaucht. Der PEG-Deckel mit Biofilmen angebracht ist, wird auf eine neue Herausforderung Platte übertragen, verschiedene Konzentrationen der Antibiotika enthält, untersucht werden. Nach einer zweiten Inkubation werden Deckel wieder entfernt, gewaschen und in ein Rückgewinnungsplatte Resazurin Farbstoff enthält, überführt, wo sie einer abschließenden Inkubation unterzogen werden. Resazurin Umwandlung kann nach einer definierten Erholungszeit als Endpunkt Lesen kinetisch oder verbucht. Dieser Farbstoff-basierte Methode , um die Lebensfähigkeit von Biofilmen zu quantifizieren , unterscheidet sich erheblich von den langweiligen KBE (Kolonie bildende Einheiten) zählen basierte Methodik im ursprünglichen Protokoll ⁷ beschrieben. OD ₆₀₀ Messungen der Droge Herausforderung Platte und Resazurin Umwandlungskinetik dienen als Lebensfähigkeit Leseouts von planktonischen und Biofilm-Zellen, die jeweils eine schnelle, zuverlässige, informationsreiche und technisch einfachen Test zur Biofilm Überleben anbietet.

Protokoll

1. Biofilm Initiation

1. Wachsen einer Kultur des Biofilms produzierenden Organismus in einem nährstoffreichen Medium. Impfen Staphylococcus aureus - Stamm Newman in 10 ml Mueller-Hinton - Medium aus einem Glycerin Lager. Führen Sie alle Arbeiten , die mit der Handhabung von S. aureus mit Handschuhen und in einem Biosicherheitsschrank.
2. bei 37 ° C für 16 Stunden inkubieren auf einem Rotationsschüttler (100-200 rpm).
3. Bestimmen Sie OD ₆₀₀ der Kultur eines Spektrometers und eine Standardküvette mit (Weglänge: 1cm).
4. Berechne das Volumen (V) der Kultur benötigt 20 herzustellen ml des Inokulums mit OD _{600 (Inokulum)} von 0,1 in chelexed Roswell Park Memorial Institute Medium (cRPMI) ⁹ mit der Formel: [V = 20 ml * 0,1 / OD _{600 (Kultur )]}
   Hinweis: Referenz 9 enthält Einzelheiten über cRPMI Vorbereitung.
   1. Die berechnete Kulturvolumen (von oben) in ein Zentrifugenröhrchen und Pelletzellen durch bei 10.000 x g für 1 min dreht. Um prepadas verbrauchte Nährmedium und resuspendieren Zellpellet in 20 ml cRPMI re Biofilm Inokulum absaugen.
5. Gießen Inokulum in einen 25-ml-Reservoir.
6. Entfernen Sie vorsichtig den Deckel aus einer sterilen 96-Well-Platte peg diese gerade nach oben ziehen.
   Hinweis: Bitte achten Sie dürfen nicht die Heringe zu verunreinigen nach unten aus dem Deckel hängen. Der Deckel kann in einem Biosicherheitsschrank auf eine saubere Oberfläche den Kopf gestellt werden.
7. Verwendung eines 200 & mgr; l Mehrkanalpipette, fügen 125 ul Impfgut zu jeder Vertiefung der Reihen A bis G der Bodenplatte.
8. Füllen Sie 125 ul sterile cRPMI Medium in jeder Vertiefung der Reihe H als Sterilitätskontrolle.
9. Nehmen Sie die peg-Deckel und halten Sie ihn mit den Zapfen über dem Plattenboden nach unten. sorgfältig ausrichten, um die einzelnen Stifte mit ihren jeweiligen Brunnen. Vermeiden Sie Körperkontakt zwischen der Platte und den Zapfen. Nach der Ausrichtung senken vorsichtig nach unten den Deckel. Vermeiden Sie Fehlstellungen wie ausgeführt Nachjustierungen nach den Zapfen der Bodenplatte berührt haben cont kannaminate Sterilität Kontrollen in Reihe H.
10. Verschließen Sie den Deckel auf die Platte mit Paraffin Filmverdampfung und in einen verschließbaren Plastikbeutel zu verhindern, Abdichtung fest. Halten Sie das Luftvolumen in der Tasche so gering wie möglich Verdunstung zu minimieren.
11. Inkubieren ohne für 48 Stunden in einem 5% CO ₂ Inkubator bei 37 ° C schüttelnd.
    Hinweis: 48 Stunden des Wachstums von S. optimal gewesen aureus, sondern wird auf den Organismus verwendet , variieren.
    Hinweis: Obwohl statische Inkubation ein guter Ausgangspunkt ist der Test zu optimieren, sanft bei 150 Umdrehungen pro Minute auf einem Schüttler Schütteln ist eine mögliche Variante , die die Biofilmbildung von einigen S. verbessern kann aureus - Isolaten.

2. Herstellung der Biofilm Challenge-Platte

1. Am Tag des Biofilms Herausforderung nehmen eine frische 96-Well-Platte und fügen 100 ul cRPMI, auf RT ins Gleichgewicht gebracht, in jede Vertiefung der Zeilen B bis H. inkonsistente Ergebnisse zu vermeiden, verwenden eine 96-Well-Platte, die 200 & mgr; l aufnehmen kanninnerhalb der Medien, wenn die Heringe, und verfügt über Vertiefungen mit Abmessungen identisch mit denen des Biofilms Einleitung Platte.
2. Verdünne bis zu 4 Testverbindungen getrennt in 1,0 ml cRPMI die gewünschte Endkonzentration, um zu 2x für eine Endverdünnung in Schritt 2.7 zu berücksichtigen.
   Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt ist 8-fach über die hemmende Konzentration von planktonischen Zellen.
3. In 200 ul der Verbindung 1 in den Vertiefungen A1 bis A3, die Verbindung 2 in Brunnen A4 bis A6, Verbindung 3 in Brunnen A7 bis A9 und Verbindung 4 in Brunnen A10 bis A12.
4. Abwechselnd verdünnen die Testverbindungen mit einer Mehrkanalpipette mit und 100 & mgr; l aus Reihe A übertragen B und mischen zu rudern.
5. Auf diese Weise weiterhin 100 ul Vertiefung zu Vertiefung zu übertragen. Mischen Sie nach jeder Übertragung und stoppen in der Reihe F.
6. Nach dem Mischen vertreiben 100 & mgr; l aus Reihe F in einen Abfallbehälter. Verwenden Sie keine Flüssigkeit in Reihen G und H. übertragen
7. 100 l cRPMI zu jeder Vertiefung der Platte mit einer Mehrkanalpipettebringen das Volumen auf 200 ul. Siehe Abbildung 1 für die endgültige Plattenlayout.

3. Biofilm Herausforderung

1. Mit 200 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf eine frische sterile 96-Well-Platte, die Vertiefungen mit Abmessungen identisch mit denen des Biofilms Initiationsplatte verfügt.
2. Entfernen Sie den Plastikbeutel und Paraffinfilm aus inkubiert Biofilm Initiationsplatte.
3. Heben Sie den Deckel gerade nach oben. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen den Zapfen und dem Plattenboden, da dies den Biofilm beschädigen können. Halten Sie Unterteil für die nachfolgende OD ₆₀₀ - Analyse (siehe 3.8).
4. Wegspülen planktonischen Zellen durch den Stift-Deckel auf die Platte legen enthält PBS (aus Schritt 3.1). Versenken Pflöcke für 5 Sekunden, heben Sie aus PBS, und tauchen noch einmal, man aufpassen, nicht die Zapfen gegen die Seiten gut zu treffen.
5. Setzen Sie den abgespült peg-Deckel in die Herausforderung Platte. Vermeiden Sie unnötigen Kontakt zwischen Zapfen und Bodenplatte, da dies der Biofilm führt zu Schäden aninkonsistente Ergebnisse.
6. Die Dichtungsplatte mit Paraffinfilm und in einen verschließbaren Beutel aus Kunststoff, wie in Schritt 1.10 beschrieben.
7. Inkubiere die Platte für 24 Stunden bei 37 ° C in einem 5% CO ₂ Inkubator ohne Schütteln.
8. Nehmen Unterseite des Biofilms Initiationsplatte von 3,3. Resuspendieren der Bakterien in jeder Vertiefung einer Mehrkanalpipette mit und die OD ₆₀₀ mit einem geeigneten Mikroplatten - Reader messen Wachstum zu bestätigen in allen Vertiefungen , aber die Sterilität Kontrollen in Reihe H. vorkommenden

4. Biofilm Bestimmung

1. Verwenden Leser eine Platte mit einer Inkubationskabine ausgestattet und in der Lage nehmen kinetische Fluoreszenzmesswerte zur Erfassung von Resazurin Umwandlung. Legen Sie eine 24-Stunden-kinetische Fluoreszenzmessung unter Verwendung eines 530 nm Anregung und 590 nm Emission auf.
2. Stellen Sie die Raumtemperatur auf 37 ° C und haben die Platte alle 20 Minuten lesen. Stellen Sie den Leser Platte von der Unterseite der Platte zu messen, nach Herstelleranweisunggen.
3. Bereiten Waschplatte durch Zugabe von 200 ul PBS mit einer Mehrkanalpipette in eine sterile 96-Well-Platte.
4. Bereiten Biofilm Wiederherstellungsmedium durch Zugabe von 400 & mgr; l von 0,8 mg / ml Stammlösung zu 20 ml cRPMI Medium auf eine Endkonzentration von 16 & mgr; g / ml Resazurin Resazurin.
   Hinweis: Resazurin ist eine bekannte hautreizend. Verwenden Sie einen Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe bei der Handhabung. CRPMI als Biofilm Recovery-Medien wurde verwendet, da es den niedrigsten Hintergrundsignal liefert, aber es kann von Mueller-Hinton-Medien gegebenenfalls ersetzt werden.
5. In 150 ul Biofilm Recovery Medium mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung einer frischen 96-Well-Platte.
6. Transfer Herausforderung Platte aus Inkubator in einem Biosicherheitsschrank und sorgfältig Plastiktüte und Siegelfolie entfernen.
7. Entfernen Sie die peg-Deckel von der Herausforderung Platte und abzuspülen planktonischen Zellen in PBS, wie in 3.4 beschrieben. Halten Sie den Boden der Herausforderung Platte für nachfolgende OD ₆₀₀ anaLyse (siehe 4.10).
8. Nach dem Spülen, legen Sie den zapfen Deckel in den Plattenboden des Biofilms Recovery-Medium enthält.
9. Wickeln Sie die Seite der Platte mit Paraffinfilm, wobei darauf geachtet, nicht den Boden der Umfang Brunnen zu behindern. Unmittelbar nach der Platte Verpackung, legen Sie sie auf dem Plattenleser und eine kinetische Lese über einen Zeitraum von 24 h beginnen, indem die bisherigen Resazurin kinetische Protokoll von Schritt 4.1 zu initiieren.
10. Um das Wachstum von planktonischen Zellen zu quantifizieren , die während der Herausforderung auftreten, lesen Sie die OD ₆₀₀ der gesamten Herausforderung Plattenboden kann oder auch nicht ein Mikroplattenleser. Folgen Sie die Anweisungen in Schritt 3.8.
    Hinweis: vorsichtig resuspendieren den Inhalt jeder Vertiefung als Shedding Zellen aus den Biofilm neigen dazu, in Klumpen am Boden der Vertiefung zu wachsen. Alle Blasen innerhalb des Schachtes wird stark mit OD ₆₀₀ Lesungen stören und müssen vor dem Lese vermieden oder entfernt werden.

Ergebnisse

Der Resazurin-Assay ist empfindlich genug, um zuverlässig sehr wenige lebensfähige Zellen replizieren in drogenfreien Medium nach der Herausforderung der Lage zu erkennen. In dieser Methode definieren wir die minimale Biofilm auszurotten Konzentration als die niedrigste Konzentration, bei der keine Resazurin Umwandlung innerhalb von 24 h zu sehen ist. Der Resazurin-Assay beruht auf oxidativen Moleküle in metabolisch aktiven Zellen gefunden, die den Farbstoff Farbe von blau zu rosa konver...

Diskussion

Hier haben wir ein abgewandeltes Biofilm - Assay zur Bestimmung der Aktivität der getesteten Inhibitoren auf S. beschrieben aureus Biofilm auf den Stoffwechselzustand von Biofilm assoziierten Zellen konzentriert. Während die beschriebene Biofilm Initiierung und Widerspruchsverfahren meist nachgeahmten Herstellerempfehlungen, die Verwendung von Resazurin Farbstoff Biofilm-assoziierte Zellen, die eine 24-Stunden-Inhibitor Herausforderung überleben dramatisch vereinfacht die empfohlene Verfahren der Zellg...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed für 1 h mit Chelex 100 Harz und dann ergänzt mit 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin Bio	Rad	142-2822
MBEC-platten	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800 µ g/ml in DI-Wasser        Filter sterile
Mikroplatten-Schüttelplattform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 Software	Biotek		Aufzeichnung und Analyse der Resazurin-Umwandlung
Neocuproin	Sigma	N1501	10 mM Brühe in 100% Ethanol vorbereiten, bei -80 & ordm lagern; C
Kupfersulfat	Acros Organics	7758-99-8	eine 100 mM Stammlösung in Wasser herstellen, bei 4 & ordm; C
Cu-Neocuproin	Self-Made		Hergestellt durch Mischen gleicher Molaritäten von Neocuproin und Kupfersulfat. Die Mischung wurde in CRPMI-Medium auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G