RESEARCH
Peer reviewed scientific video journal
Video encyclopedia of advanced research methods
Visualizing science through experiment videos
EDUCATION
Video textbooks for undergraduate courses
Visual demonstrations of key scientific experiments
BUSINESS
Video textbooks for business education
OTHERS
Interactive video based quizzes for formative assessments
Products
RESEARCH
JoVE Journal
Peer reviewed scientific video journal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Video encyclopedia of advanced research methods
EDUCATION
JoVE Core
Video textbooks for undergraduates
JoVE Science Education
Visual demonstrations of key scientific experiments
JoVE Lab Manual
Videos of experiments for undergraduate lab courses
BUSINESS
JoVE Business
Video textbooks for business education
Solutions
Language
German
Menu
Menu
Menu
Menu
Research Article
Sami Al-Nawaiseh1, Fabian Thieltges1, Zengping Liu1,2, Claudine Strack1, Ralf Brinken1, Norbert Braun3, Marc Wolschendorf3, Arvydas Maminishkis5, Nicole Eter4, Boris V. Stanzel1,6
1Department of Ophthalmology,University of Bonn, 2Department of Ophthalmology,National University of Singapore, 3Geuder AG, 4Department of Ophthalmology,University of Münster, 5Section on Epithelial and Retinal Physiology and Disease,National Eye Institute/National Institutes of Health, 6Surgical Retina Department,Singapore National Eye Centre
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Erratum Notice
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Retinalen Pigmentepithel (RPE) Ersatzstrategien und Gen-Therapie für mehrere degenerativen Retina Bedingungen betrachtet. Für die klinische Übersetzung werden große Auge Tiermodellen erforderliche chirurgische Techniken anwendbar bei Patienten zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Kaninchenmodell für subretinalen Chirurgie zu RPE-Transplantation ausgerichtet, die vielseitig und kosteneffizient ist.
Die altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis pigmentosa und andere RPE bedingte Krankheiten sind die häufigsten Ursachen für irreversible Erblindung bei Erwachsenen in industriell entwickelten Ländern. RPE-Transplantation scheint eine vielversprechende Therapie sein, da es dysfunktionalen RPE ersetzen kann, seine Funktion wiederherstellen und dadurch Vision.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung einer gezüchteten RPE-Monoschicht auf einem Gerüst in den subretinalen Raum (SRS) von Kaninchen Umpflanzen. eine maßgeschneiderte Shooter, bestehend aus einem 20-Gauge metallischen Düse mit einem Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Kolben Nach Vitrektomie Xenotransplantate wurden in die SRS geliefert. Die aktuelle Technik entwickelte sich in mehr als 150 Kaninchen Operationen über 6 Jahre. Postoperative Nachsorge kann unter Verwendung von nicht-invasive und repetitive in - vivo - Bildgebung , wie beispielsweise spektralen Bereich der optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) durch Perfusion fest Histologie folgen erhalten.
the Verfahren hat gut definierte Schritte für einfaches Lernen und eine hohe Erfolgsquote. Kaninchen sind ein großes Auge Tiermodell nützlich in präklinischen Studien für die klinische Übersetzung berücksichtigt. In diesem Zusammenhang Kaninchen sind eine kostengünstige und vielleicht bequeme Alternative zu anderen großen Auge Tiermodellen.
Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Sehbehinderung bei Erwachsenen im Alter von 50 oder älter in industriell entwickelten Ländern, wie sie Verlust des zentralen Sehvermögens führt. Etwa 15% dieser Patienten leiden an der "feuchten" Form der Erkrankung, bei der Neovaskularisation von der Aderhaut stammt und stört die Funktion der Retina 1. Diese Variante kann durch eine hochwirksame Therapie mit wiederholten intra vitrealen Injektionen von anti - angiogenen Medikamenten 2 behandelt werden. Doch die überwiegende Mehrheit der Patienten (~ 85%) leiden an der trockenen Form, die durch extrazelluläre Ablagerungen (zB Drusen) unter dem retinalen Pigmentepithel (RPE) gekennzeichnet ist. Diese Ablagerungen verursachen RPE Dysfunktion Retinaatrophie in der Makula führen. Da der Mangel an kurativen Therapieoptionen, entwickelte sich AMD in ein intensiv Forschungsbereich entwickelt werden, wo viele verschiedene Heil therapeutische Ansätze erprobt. Chirurgische RPE Ersatzeine attraktive Zukunft Möglichkeit , diese lähmende Krankheit 3 zu besiegen.
Autologe subretinalen RPE - Transplantation ersetzt dysfunktionalen oder RPE in Macula verloren und hat das Potential , dessen physiologische Funktion 4-9 wiederherzustellen. Diese chirurgische Technik hatte einen Durchbruch bei der Entwicklung von RPE Differenzierungsprotokolle aus humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), der Wissenschaftler eine unbegrenzte Zellquelle von RPE für die Transplantation 10 geben. RPE-Transplantation wird nun als attraktive First-in-Human-Anwendung für die Stammzell abgeleitet Therapeutika anerkannt. Das Auge bietet ausgezeichnete chirurgische Zugang und anspruchsvolle In - vivo - Monitoring - Tools 13.11.
Um die RPE verpflanzen, ist eine Möglichkeit, mit einem minimal-invasive Lieferung einer Zellsuspension mit alternativ zu einer besseren RPE Eigenschaften und Transplantatfunktion, künstlichem Träger substr bewahrenAtes (Gerüsten) für die RPE Ersatz betrachtet 4,14,15 werden. Große Tiermodelle sind für die präklinische Validierung erforderlich, noch detaillierte technische Informationen über die Behandlung der Tiere und chirurgische Technik auf dem neuesten Stand 16-23 fehlt.
Wir und andere 11,24 trotz einiger gegenteiliger Beweise 25, schlagen die Verwendung eines starren noch elastischen Trägersubstrat , wie es sicherer Handhabung bietet, erhält einschichtigen Integrität und Funktionalität. Im Laufe der Zeit haben wir mehrere anwendungsspezifische Instrumente und Zusatz Techniken zur Implantation von zell Träger RPE-Transplantation in den subretinalen Raum (SRS) getestet. Wir nutzten die intraoperative Videoaufnahmen, in vivo Scanning - Laser - Ophthalmoskopie mit spektralen Bereich der optischen Kohärenztomographie kombiniert (SLO / SD-OCT) und Histologie die Implantation Erfolg 14,26,27 zu bewerten. Hier bieten wir unseren aktuellen Empfehlung für subretinaler Implantate RPE in Kaninchen,die in 5 verschiedenen Kaninchen-Stämme, 7-Zellträgermaterialien und 4 RPE Zellquellen in über 150 Verfahren getestet.
Ethik der Behandlung der Tiere in der Augenforschung: Wir erhielten die Zustimmung der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät, Universität Bonn, und sich an die von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Leitlinien übereinstimmt. Darüber hinaus sind alle Verfahren wurden von den staatlichen Regulierungsbehörden des Landes Nordrhein-Westfalen genehmigt. 20 ° C, Kontakt mit regelmäßigen Tageslicht, in standardisierten Einzelkäfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser - Tiere wurden drinnen in einer spezialisierten Einrichtung in einem klimatisierten Raum mit einer Temperatur von 18 gehalten.
Hinweis: Um die Tiere operative Affinität zu gewährleisten, eine Tiergesundheit Notenblatt folgt, welches die folgenden endgültigen Tier Ausschlusskriterien enthält: 20% Gewichtsverlust im Vergleich zum Gewicht auf die Zulassung; offensichtlich Zyanose des Tieres; Tier zittert, hat Krämpfe oder kann nicht in Koordination bewegen; . Ataxie / Parästhesien, zB Lähmungen; Apathie; extreme Selbstverstümmelung (Hautwunden, abgeschlagenen Gliedmaßen).
</ P>
1. Instrumentensterilisation
2. Instrumentenaufbereitung
3. Herstellung von Anästhesie und Lagerung des Tier
4. Vitrektomie
5. Laden Shooter
Hinweis: Die hierin beschriebene Arbeit nicht unter den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki fällt; es waren nicht mit menschlichen Patienten. Hier standard RPE - Zellen wurden von fötalen menschlichen Augen isoliert, kultiviert und differenziert auf unbeschichteten 10 um dicke Polyester (PET) fügt gemäß unserer früher veröffentlichten Protokoll 14. Eine Berechtigung mit dem menschlichen fetalen Material zu arbeiten wurde von der Ethikkommission der Universität Bonn erhalten. Alternativ hES-RPE wurden aus dem Skottman lab (Manuskript in Vorbereitung.) Geliefert, wo sie nach der Technik von Vaajasaari et al beschrieben kultiviert wurden . 32; für diese Zellen eine Genehmigung wurde von der R.-Koch-Institut, Berlin, Deutschland, erhalten.
6. Implantierung
7.Außerbetrieb
8. Post-operative Animal Care
9. SLO / SD-OCT Guidance
Die Ergebnisse aus dem beschriebenen Verfahren zur subretinalen Implantation sind in Tabelle 2 gezeigt Engraftment unter der Netzhaut eine Erfolgsquote von ca. 61% hatte , als ein Kern - Vitrektomie durchgeführt wurde , und stieg bis zu 76%, wenn hintere Glaskörperabhebung induziert wurde. Diese Zahlen umfassen 21% der Tiere ca. die entweder intraoperativ oder starben in den ersten drei postoperativen Tage. Diese Technik kann verwendet werden, um zwei Gerüste auf verschiedenen Netzhautbereiche gleichzeitig in einem Auge zu implantieren.
Die Kaninchen unterzog sich Operation in vivo Follow - up mit SD-OCT und histologische Verarbeitung wie von Stanzel et al. 27 (Abbildung 2). Abb. 2A zeigt Laserrasterophthalmoskop Infrarot - Reflexionsbild von implantierten kultivierten RPE auf einem Polyester - Membran (PET) nach einer unkomplizierten Transplantation. DasHalo um Implantat entspricht Atrophie Photorezeptor. Abb. 2B zeigt entsprechende SD-OCT, Retinal Ankündigung, vor allem Kernschicht (ONL) Verdünnung, hyper reflektierende Band auf SD-OCT über Implantat äußere, während das neuronale Netzhaut an das Implantat angrenzenden zeigt nahezu normale Reflexionsbänder. Diese Ergebnisse legen nahe , eine atraumatische Lieferung. Abb. 2C zeigt Hematoxiline / Eosin (H / E) Fleck des Implantats , die subretinalen Narben und ONL Atrophie um die Retinotomie Website , wahrscheinlich als Folge einer iatrogenen Manipulation zeigt, eine zusammenhängende noch unregelmäßig pigmentierte Schicht über PET. Bruch-Membran unter dem Implantat erschien auch zusammenhängend sein, und die Choriokapillaris enthält einige verstreute Erythrozyten. Diese morphologischen Ergebnis sind vergleichbar mit der SD-OCT und stärken die These von einer atraumatischen Lieferung.

Feige ure 1: Laden Shooter mit menschlichen iPS-RPE Cultured auf PET - Zellträger. A) zeigt Stanzen ein Implantat aus maßgeschneiderte Nadel. B) bohnenförmige Implantat geschnitten aus der Zellkultur. C) Positionierung des Implantats vor dem Laden. D) Laden von Shooter mit Implantat. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen .

Abbildung 2: Kultivierte menschliche hES-RPE auf PET - Zellträger 4 Wochen in Kaninchen subretinalen Raum. A) zeigt SLO Infrarot - Reflexionsbild, die grüne Linie abgrenzt den Querschnitt in Fig. 2B. B) entsprechende SD-OCT. C) H / E - Färbung, siehe Text oder 26,27 für weitere Einzelheiten.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Parameter | Gebrauchte Einstellungen |
| Vitrektomie | 6000 Schnitte / min |
| Vakuum | 200 mmHg |
| Die Anstiegszeit | 1 Sek |
| Luft | 24 mmHg |
| Bewässerung | 24 cm H 2 O |
| DiathErmy | 30% |
Tabelle 1: Parameter Setup der Vitrektomie - Maschine.
| Vitrektomie | Implantieren | Kaninchen betrieben | Erfolgreiche Implantat | fehlgeschlagen Implantat | Tod | Erfolgsrate% |
| Core-Vitrektomie | HAUSTIER | 30 | 19 | 4 | 7 | 63.33 |
| PET + RPE | 70 | 42 | 12 | 16 | 60 | |
| PVD, ± Plasmin w / PPV | HAUSTIER | 28 | 21 | 2 | 5 | 75 |
| PET + RPE | 22 | 17 | 2 | 3 | 77,27 |
Tabelle 2: Zusammenfassung der letzten 150 Operationen , einschließlich Verfahren und Implantattyp.
RB, BVS, ZL, NE und Geuder AG haben eine europäische Patentanmeldung auf den Schützen eingereicht. NB ist ein Mitarbeiter von Geuder AG. Publikationsgebühren für dieses Video-Artikel wurden von Geuder AG bezahlt.
Retinalen Pigmentepithel (RPE) Ersatzstrategien und Gen-Therapie für mehrere degenerativen Retina Bedingungen betrachtet. Für die klinische Übersetzung werden große Auge Tiermodellen erforderliche chirurgische Techniken anwendbar bei Patienten zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Kaninchenmodell für subretinalen Chirurgie zu RPE-Transplantation ausgerichtet, die vielseitig und kosteneffizient ist.
Unterstützt von Rüdiger Stiftung vergibt im Jahr 2008 und 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), die Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, Chinesisch Scholarship Council Nr 2008627116 (ZL) und eine uneingeschränkte Gewährung von Geuder AG, Heidelberg (Abb. 2). Mitglieder von H. Skottman Labor, Universität Tampere Finnland sind für die Bereitstellung von hES gedankt RPE in Bild 2 gezeigt abgeleitet.
| s30 Ultraschall-Reinigungsgerät | Elmasonic | 100 4631 | 2,75 L |
| DE-23 Autoklav | Systec | C 2209 | 23 L |
| Spritze | BD | 300013 300995 301285 300294 300330 | 1 ml x3 2 ml x3 5 ml x1 10 ml x1 20 ml x1 |
| Nadel | BD | 305196 305136 | 18 G x1 27 G x5 |
| Skalpellfeder | 2975#20 | Klinge#20 x3 | |
| OP-Abdecktuch | HARTMANN LOHMANN & RAUSCHER | 277 502 25 440 | 60 x 40 cm x2 12 x 17 cm |
| Okularstäbchen | LOHMANN & RAUSCHER | 16 516 | 66 x 5 mm |
| Twister Mullschwämme | HARTMANN | 481 274 | x2 |
| Verschlussstreifen | HARTMANN | 540 686 | x4 |
| Opmi Visu CS Mikroskop | Zeiss | N/a | inkl. Fundus Imaging System BIOM II |
| Kronleuchter Endoillumination | Geuder | G-S03503 + G-S03504 | 25 G inkl. Trokar |
| Lichtmaschine | Geuder | G-26033 | Xenotron III |
| Vitrektomiegerät | Geuder | G-60000 | MegaTRON S4 S4/ HPS |
| Vitrector | Geuder | G-46301 | MACH2 Glaskörperschneider 23 G |
| Venturi-Kassette | Geuder | G-60700 | |
| Sideport-Infusionskanüle | Geuder | custom | 23 g x1 |
| 3-0 Seidennaht | ETHICON | V546G | x1 |
| Bremssattel | Geuder | G-19135 | x2 |
| Vannas Schere | Geuder | G-19777 | x1 |
| Sklerotomie Klinge | Ziemer | 21-2301 | 1x 23 G 1x 20 G |
| 7-0 Seidennaht | ETHICON | EH6162H x1 | |
| Nadelhalter | Geuder | G-32320 | x2 |
| Iriszange | Geuder | G-18910 | x1 |
| Colibri Pinzette | Geuder | G-18950 | x1 |
| Ausziehbare subretinale Injektionsnadel | DORC | 1270.EXT | 41 G |
| VR Schere | Geuder | G-36542 | 25 G |
| Grieshaber Zangenhalter | Alcon | 712.00.41 | 23 G |
| Gebogene Scherenzange | Spitzen Alcon | 723.52 | 23 G |
| Implantat-Ladestation | Dow Corning | 3097358-1004 | SYLGARD 184 Silikon-Elastomer-Kit |
| Blunt ovales Implantat-Trephin | Geuder | nach Maß | 2,4 x 1,1 mm; |
| Shooter Dummy | Geuder | G-32227 | x1 |
| Shooter | Geuder | G-S03443 | x1 |
| Flötennadel | DORC | 1281.SD | 20 G (Vakuum) |
| Manuelle Mikroliterspritze | Hamilton | 24535 | 100 µ l |
| Gewebekulturplatten | Greiner bio-one | 664160 | 100 x 20 mm |
| Spectralis Multi-Modality Imaging System | Heidelberg Engineering | N/a | Spectralis HRA + OCT |
| Drugs and solutions | |||
| Name | Company | Wirkstoff | Kommentare |
| Mucadont-IS | Merz Hygiene | viruzides Instrumentendesinfektionsmittel | 2 L |
| Schleimhaut T | Merz Hygiene | Aldehydfreies Instrumentendesinfektionsmittel | 2 L |
| Ketamin 10% | WDT | Ketamin | 10 ml (100 mg/ml) |
| Domitor | Orion Pharma | Medetomidinhydrochlorid | 10 ml (1 mg/ml) |
| Antisedan | Orion Pharma | Atipamezolhydrochlorid | 10 ml (5 mg/ml) |
| Neosynephrin POS 10% | URSAPHARM | Phenylephrin HCl | 10 ml |
| Mydriacyl | Alcon | Tropicamid | 10 ml (5 mg/ml) |
| Methocel 2% | Omni Vision | Hydroxypropylmethylcellulose | 10 g |
| PURI CLEAR | ZEISS | Balance Salzlösung (BSS) | 500 ml |
| Glukose 5% | B.Braun | Glukose 5% Lösung | 100 ml |
| Heparin-Natrium-25.000 | Ratiopharm | Heparin | 5 ml (2.500 Einheit/ml) |
| Suprarenin | SANOFI | Epinephrin | 1 ml (1 mg/ml) |
| Triamcinolon | Universität Bonn Apotheke | konservierungsmittelfrei Triamcinolon | 1 ml (40 mg/ml) |
| Isoptomax Augensalbe | :Alcon | Dexamethason 1 mg/g Neomycinsulfat 3.500 IE/g Polymyxin B-Sulfat 6.000 IE/g | 10 ml |
| Betaisodona | Mundipharma | ,Povidon-Iod | 30 ml (1 g/10 ml) |
| Optive | ALLERGAN, | Natriumcarboxymethylcelluloseglycerin | 10 ml |