-1::1
Simple Hit Counter
Skip to content

Products

Solutions

×
×
Sign In

DE

EN - EnglishCN - 简体中文DE - DeutschES - EspañolKR - 한국어IT - ItalianoFR - FrançaisPT - Português do BrasilPL - PolskiHE - עִבְרִיתRU - РусскийJA - 日本語TR - TürkçeAR - العربية
Sign In Start Free Trial

RESEARCH

JoVE Journal

Peer reviewed scientific video journal

Behavior
Biochemistry
Bioengineering
Biology
Cancer Research
Chemistry
Developmental Biology
View All
JoVE Encyclopedia of Experiments

Video encyclopedia of advanced research methods

Biological Techniques
Biology
Cancer Research
Immunology
Neuroscience
Microbiology
JoVE Visualize

Visualizing science through experiment videos

EDUCATION

JoVE Core

Video textbooks for undergraduate courses

Analytical Chemistry
Anatomy and Physiology
Biology
Cell Biology
Chemistry
Civil Engineering
Electrical Engineering
View All
JoVE Science Education

Visual demonstrations of key scientific experiments

Advanced Biology
Basic Biology
Chemistry
View All
JoVE Lab Manual

Videos of experiments for undergraduate lab courses

Biology
Chemistry

BUSINESS

JoVE Business

Video textbooks for business education

Accounting
Finance
Macroeconomics
Marketing
Microeconomics

OTHERS

JoVE Quiz

Interactive video based quizzes for formative assessments

Authors

Teaching Faculty

Librarians

K12 Schools

Products

RESEARCH

JoVE Journal

Peer reviewed scientific video journal

JoVE Encyclopedia of Experiments

Video encyclopedia of advanced research methods

JoVE Visualize

Visualizing science through experiment videos

EDUCATION

JoVE Core

Video textbooks for undergraduates

JoVE Science Education

Visual demonstrations of key scientific experiments

JoVE Lab Manual

Videos of experiments for undergraduate lab courses

BUSINESS

JoVE Business

Video textbooks for business education

OTHERS

JoVE Quiz

Interactive video based quizzes for formative assessments

Solutions

Authors
Teaching Faculty
Librarians
K12 Schools

Language

German

EN

English

CN

简体中文

DE

Deutsch

ES

Español

KR

한국어

IT

Italiano

FR

Français

PT

Português do Brasil

PL

Polski

HE

עִבְרִית

RU

Русский

JA

日本語

TR

Türkçe

AR

العربية

    Menu

    JoVE Journal

    Behavior

    Biochemistry

    Bioengineering

    Biology

    Cancer Research

    Chemistry

    Developmental Biology

    Engineering

    Environment

    Genetics

    Immunology and Infection

    Medicine

    Neuroscience

    Menu

    JoVE Encyclopedia of Experiments

    Biological Techniques

    Biology

    Cancer Research

    Immunology

    Neuroscience

    Microbiology

    Menu

    JoVE Core

    Analytical Chemistry

    Anatomy and Physiology

    Biology

    Cell Biology

    Chemistry

    Civil Engineering

    Electrical Engineering

    Introduction to Psychology

    Mechanical Engineering

    Medical-Surgical Nursing

    View All

    Menu

    JoVE Science Education

    Advanced Biology

    Basic Biology

    Chemistry

    Clinical Skills

    Engineering

    Environmental Sciences

    Physics

    Psychology

    View All

    Menu

    JoVE Lab Manual

    Biology

    Chemistry

    Menu

    JoVE Business

    Accounting

    Finance

    Macroeconomics

    Marketing

    Microeconomics

Start Free Trial
Loading...
Home
JoVE Journal
Medicine
Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Research Article

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

DOI: 10.3791/53927

September 13, 2016

Sami Al-Nawaiseh1, Fabian Thieltges1, Zengping Liu1,2, Claudine Strack1, Ralf Brinken1, Norbert Braun3, Marc Wolschendorf3, Arvydas Maminishkis5, Nicole Eter4, Boris V. Stanzel1,6

1Department of Ophthalmology,University of Bonn, 2Department of Ophthalmology,National University of Singapore, 3Geuder AG, 4Department of Ophthalmology,University of Münster, 5Section on Epithelial and Retinal Physiology and Disease,National Eye Institute/National Institutes of Health, 6Surgical Retina Department,Singapore National Eye Centre

Cite Watch Download PDF Download Material list
AI Banner

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Retraction Notice

The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice

Summary

Retinalen Pigmentepithel (RPE) Ersatzstrategien und Gen-Therapie für mehrere degenerativen Retina Bedingungen betrachtet. Für die klinische Übersetzung werden große Auge Tiermodellen erforderliche chirurgische Techniken anwendbar bei Patienten zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Kaninchenmodell für subretinalen Chirurgie zu RPE-Transplantation ausgerichtet, die vielseitig und kosteneffizient ist.

Abstract

Die altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis pigmentosa und andere RPE bedingte Krankheiten sind die häufigsten Ursachen für irreversible Erblindung bei Erwachsenen in industriell entwickelten Ländern. RPE-Transplantation scheint eine vielversprechende Therapie sein, da es dysfunktionalen RPE ersetzen kann, seine Funktion wiederherstellen und dadurch Vision.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung einer gezüchteten RPE-Monoschicht auf einem Gerüst in den subretinalen Raum (SRS) von Kaninchen Umpflanzen. eine maßgeschneiderte Shooter, bestehend aus einem 20-Gauge metallischen Düse mit einem Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Kolben Nach Vitrektomie Xenotransplantate wurden in die SRS geliefert. Die aktuelle Technik entwickelte sich in mehr als 150 Kaninchen Operationen über 6 Jahre. Postoperative Nachsorge kann unter Verwendung von nicht-invasive und repetitive in - vivo - Bildgebung , wie beispielsweise spektralen Bereich der optischen Kohärenztomographie (SD-OCT) durch Perfusion fest Histologie folgen erhalten.

the Verfahren hat gut definierte Schritte für einfaches Lernen und eine hohe Erfolgsquote. Kaninchen sind ein großes Auge Tiermodell nützlich in präklinischen Studien für die klinische Übersetzung berücksichtigt. In diesem Zusammenhang Kaninchen sind eine kostengünstige und vielleicht bequeme Alternative zu anderen großen Auge Tiermodellen.

Introduction

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache für Sehbehinderung bei Erwachsenen im Alter von 50 oder älter in industriell entwickelten Ländern, wie sie Verlust des zentralen Sehvermögens führt. Etwa 15% dieser Patienten leiden an der "feuchten" Form der Erkrankung, bei der Neovaskularisation von der Aderhaut stammt und stört die Funktion der Retina 1. Diese Variante kann durch eine hochwirksame Therapie mit wiederholten intra vitrealen Injektionen von anti - angiogenen Medikamenten 2 behandelt werden. Doch die überwiegende Mehrheit der Patienten (~ 85%) leiden an der trockenen Form, die durch extrazelluläre Ablagerungen (zB Drusen) unter dem retinalen Pigmentepithel (RPE) gekennzeichnet ist. Diese Ablagerungen verursachen RPE Dysfunktion Retinaatrophie in der Makula führen. Da der Mangel an kurativen Therapieoptionen, entwickelte sich AMD in ein intensiv Forschungsbereich entwickelt werden, wo viele verschiedene Heil therapeutische Ansätze erprobt. Chirurgische RPE Ersatzeine attraktive Zukunft Möglichkeit , diese lähmende Krankheit 3 zu besiegen.

Autologe subretinalen RPE - Transplantation ersetzt dysfunktionalen oder RPE in Macula verloren und hat das Potential , dessen physiologische Funktion 4-9 wiederherzustellen. Diese chirurgische Technik hatte einen Durchbruch bei der Entwicklung von RPE Differenzierungsprotokolle aus humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), der Wissenschaftler eine unbegrenzte Zellquelle von RPE für die Transplantation 10 geben. RPE-Transplantation wird nun als attraktive First-in-Human-Anwendung für die Stammzell abgeleitet Therapeutika anerkannt. Das Auge bietet ausgezeichnete chirurgische Zugang und anspruchsvolle In - vivo - Monitoring - Tools 13.11.

Um die RPE verpflanzen, ist eine Möglichkeit, mit einem minimal-invasive Lieferung einer Zellsuspension mit alternativ zu einer besseren RPE Eigenschaften und Transplantatfunktion, künstlichem Träger substr bewahrenAtes (Gerüsten) für die RPE Ersatz betrachtet 4,14,15 werden. Große Tiermodelle sind für die präklinische Validierung erforderlich, noch detaillierte technische Informationen über die Behandlung der Tiere und chirurgische Technik auf dem neuesten Stand 16-23 fehlt.

Wir und andere 11,24 trotz einiger gegenteiliger Beweise 25, schlagen die Verwendung eines starren noch elastischen Trägersubstrat , wie es sicherer Handhabung bietet, erhält einschichtigen Integrität und Funktionalität. Im Laufe der Zeit haben wir mehrere anwendungsspezifische Instrumente und Zusatz Techniken zur Implantation von zell Träger RPE-Transplantation in den subretinalen Raum (SRS) getestet. Wir nutzten die intraoperative Videoaufnahmen, in vivo Scanning - Laser - Ophthalmoskopie mit spektralen Bereich der optischen Kohärenztomographie kombiniert (SLO / SD-OCT) und Histologie die Implantation Erfolg 14,26,27 zu bewerten. Hier bieten wir unseren aktuellen Empfehlung für subretinaler Implantate RPE in Kaninchen,die in 5 verschiedenen Kaninchen-Stämme, 7-Zellträgermaterialien und 4 RPE Zellquellen in über 150 Verfahren getestet.

Protocol

Ethik der Behandlung der Tiere in der Augenforschung: Wir erhielten die Zustimmung der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät, Universität Bonn, und sich an die von der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Leitlinien übereinstimmt. Darüber hinaus sind alle Verfahren wurden von den staatlichen Regulierungsbehörden des Landes Nordrhein-Westfalen genehmigt. 20 ° C, Kontakt mit regelmäßigen Tageslicht, in standardisierten Einzelkäfigen mit freiem Zugang zu Futter und Wasser - Tiere wurden drinnen in einer spezialisierten Einrichtung in einem klimatisierten Raum mit einer Temperatur von 18 gehalten.

Hinweis: Um die Tiere operative Affinität zu gewährleisten, eine Tiergesundheit Notenblatt folgt, welches die folgenden endgültigen Tier Ausschlusskriterien enthält: 20% Gewichtsverlust im Vergleich zum Gewicht auf die Zulassung; offensichtlich Zyanose des Tieres; Tier zittert, hat Krämpfe oder kann nicht in Koordination bewegen; . Ataxie / Parästhesien, zB Lähmungen; Apathie; extreme Selbstverstümmelung (Hautwunden, abgeschlagenen Gliedmaßen).

</ P>

1. Instrumentensterilisation

  1. Legen Sie wiederverwendbare Instrumente in Ultraschallbad.
  2. In 500 ml destilliertem Wasser und 2 ml Instrument Desinfektionsmittel.
  3. Saubere Instrumente Sweep-Funktion für 15 min mit.
  4. Entfernen Sie Instrumente aus Ultraschallbad und gründlich destilliertes Wasser für 5 min mit.
  5. Legen Sie Instrumente in Autoklaven und verwenden Sie das Standardprogramm (Sterilisation von Instrumenten unter 121 ° C für 20 min).

2. Instrumentenaufbereitung

  1. Erstellung und Einführung eines sterilen Bereich aufrechtzuerhalten, indem sie in einem geschlossenen Raum arbeiten, mit dem OP-Peelings, Maske und Haarabdeckung. Desinfizieren der Hände vor dem sterilen OP-Handschuhe zu tragen. Ausführliche Ansatz siehe 28.
  2. Legen Sie sterilisierten Instrumente auf einem sterilen Tuch.
  3. Platzieren 1 ml Spritze mit 40 mg Triamcinolon gefüllt an einer 27 G Nadel für die Injektion 10 ml-Spritze mit Gleichgewicht Salzlösung (BSS) und 5 ml Spritze of Schmiermittel auf drapieren.
  4. Legen Sie 3-0 Seide, 7-0 Vicryl, Augen-Sticks, Twister Gazeschwämme, Wundverschlussstreifen (zu konjunktivalen / scleral Blutung zu stoppen) (die Vitrektomie Spitzenschlauch zu fixieren) und Kronleuchter endoillumination Faser Draht auf einem Tuch.
  5. Auszupacken 25 G Kronleuchter Endoilluminator und eine Verbindung zum Licht Maschine mit sterilen Techniken (siehe Schritt 2.1). Schließen Sie Vitrektomie Set mit hoher Geschwindigkeit vitrector und Venturi-Kassette zu Vitrektomie Maschine unter Verwendung von sterilen Techniken (siehe Schritt 2.1).
  6. Öffnen Sie 500 ml BSS Flasche und schließen Lösung Venturi Kassette nach den Anweisungen des Herstellers.

3. Herstellung von Anästhesie und Lagerung des Tier

  1. Wiegen Tier, um eine genaue Dosierung der Medikamente zu gewährleisten.
  2. Bereiten Sie die intramuskuläre (IM) Anästhesie mit 1 Spritze mit 27 G-Nadel 0,35 mg / kg Ketamin und 0,25 mg / kg Medetomidin für Start enthält. Drehen Sie die Spritze zu mischen.
  3. Bereiten Sie zwei Spritzen mit 1/3 ter dosiert die Anästhesie während des Betriebs aufrecht zu erhalten.
  4. Bereiten Spritze 20 ml einer 5% igen Glucoselösung und 18 G Nadel zur subkutanen Injektion als intravenöse Infusion alternative enthält.
  5. Geben Sie 3 x 1 Tropfen mydriatic Auge zu Vitrektomie für Pupillenerweiterung vor abfällt.
  6. Abdeckung Kaninchen mit Decke vor der Anästhesie Injektion injizieren im Hinterbein (Gesäßmuskel) und Massage um Injektionsstelle für 30 Sekunden zu beruhigen.
    Hinweis: Der erste Schuss von IM Narkose dauert etwa 1 bis 2 h. Je nach Größe des Kaninchens, Drogentoleranz, Fettschicht, Stress und Körpertemperatur. Das erste Zeichen der Anästhesie Fading entfernt ist ein Nystagmus, nachfolgende Injektionen letzten etwa 30 (muss vom Operateur überwacht werden) - 45 min.
  7. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, durch die Überprüfung der Hypnose, Hyporeflexie, Analgesie und Muskelrelaxation des Tieres.
  8. Geben Sie subkutane Injektion (Pt. 3.3) in Hals Hautfalte, wenn das Kaninchen bewusstlos ist.
  9. In methylcellulose Schmiermittel alle 5 - 10 min in operierte Auge, Schmiermittel und Band Deckel in nicht-operierten Auge hinzuzufügen.
  10. Legen Sie das bedeckte Kaninchen auf dem OP-Tisch drapiert mit einer Abdeckung wie ein Baumwolltuch in einer optimalen Position (Nase leicht durch eine Form der Decke angehoben, so dass er auf gleicher Höhe mit der Augenoberfläche) unter Operationsmikroskop. Richten Auge senkrecht Ziel Mikroskop.
  11. Stellen Sie sicher , die richtige Körperkerntemperatur mit Rektalthermometers (Normothermie 39 ± 1 ° C) 29.
  12. Cut Wimpern Schere (etwas Salbe auf der Klinge) unter Verwendung von postoperativen Infektionen zu reduzieren.
  13. Desinfizieren Sie das Auge mit 2 - 3 Tropfen von 0,1 g / ml PVP-Jod topisch für 1 min und Spülen mit steriler BSS.
  14. Bedecken Auge mit sterilen Tuch mit vorgeschnittenen Öffnung in der Mitte für das Auge und dann die Abdeckung mit (klebrig) chirurgischen Einschnitt drapieren 12 x 17 cm.

4. Vitrektomie

  1. Proptose und sicheres Auge mit 3-0 Seide inv miterted Sattels und führen Sie eine konjunktivale Peritomie.
    1. Inzision der Bindehaut mit einem Vannas Scheren der Nähe von Limbus, aber weit genug von den Blutgefäßen (~ 1 mm Abstand).
    2. Präparieren Sie die Bindehaut ein "T-cut" durch die Schaffung von. Erste vergrößern die Peritomie mit der Schere parallel zu Limbus und dann die Bindehaut einzuschneiden vertikal in Form eines "T" für ca. 6 - 7 mm. Trennen Sie vorsichtig unverblümt die Bindehaut.
  2. Führen Sie eine Sclerotomie eine 23 G microvitreoretinal (MVR) Klinge um 8 Uhr auf dem rechten Auge / OD (4 Uhr am linken Auge / OS) unter Verwendung von sorgfältig die scharfe Spitze der Klinge in Richtung auf den Sehnerv einsetzen. einfahren langsam die Klinge in die gleiche Richtung und vermeidet die Sklerotomie vergrößern.
  3. Stecken und Naht benutzerdefinierte Seitenanschluss-Infusionskanüle 27 mit 7-0 Seidennaht und stellen Sie den intraokularen Druck (IOP) bei 24 mmHg.
  4. Führen Sie eine Sclerotomie mit 25 G flachen Kopf Trokar um 2 Uhr auf OD (10 o '; Uhr auf OS) ähnlich 4.2 zu treten.
  5. Legen Sie 25 G Kronleuchter Licht in flachen Kopf Trokar, fixiert mit Klebeband an und schalten Sie Lichtquelle bei ca. 30%.
  6. Bei Bedarf entfernen edematous Hornhautepithel ein # 20 Skalpell für eine bessere intraokularen Visualisierung.
  7. Führen Sie eine Sclerotomie ähnlich 4.2 um 10 Uhr auf OD zu Schritt (2 Uhr am OS), (Vor-) Ort u-förmigen 7-0 Nähte um Sclerotomie ohne den Knoten zu binden, und legen Sie die Vitrektomie Cutter Spitze.
  8. Starten 30 Vitrektomie um die Eintrittsöffnung, dann weiter über die Papille und die fibrae medullares mit hoher Geschwindigkeit vitrector durch den Glaskörper in kleine Stücke schneiden bei max. 2.000 - 3.000 Schnitte / min, bei max Absaugen. 200 mmHg mit der angegebenen Parameter Aufbau der Vitrektomie - Maschine (Tabelle 1)
  9. Führen Sie eine hintere Glaskörperabhebung (PVD) durch den Glaskörper von der Netzhaut trennt durch die hohe Geschwindigkeit vitrector über den hinteren Pol eine Holdingnd (wenn möglich sanft) überlegen der Scheibe 31 , während nur bei max Absaugen. 200 mmHg ohne Schneiden.
  10. Injizieren ca. 50 & mgr; l (20 mg) Triamcinolon oder verdünnten Fluorescein (ca. 0,1 mg / ml) intravitreal zu visualisieren und zu erleichtern (in der Nähe von total) Entfernen des schwimmenden Glaskörper über den hinteren Pol und mittleren Peripherie während der Vitrektomie. Vermeiden Sie unter der Linse überqueren. Einrückungen peripheren glasig zu rasieren durch einen (Fach-) Assistent wird empfohlen, wenn Gastamponade gewünscht wird.
  11. Geben Sie 20 Einheiten / ml Heparin und 0,5 mg Epinephrin zur Endkonzentration von 0,001 mg / ml in die BSS Infusionslösung in parallel oder nach dem Schritt 4.10.
    Hinweis: Da Heparin / Epinephrin nicht intraokulare injiziert werden ihre Wirkung verzögert werden je nach Infusionsdurchflußrate.

5. Laden Shooter

Hinweis: Die hierin beschriebene Arbeit nicht unter den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki fällt; es waren nicht mit menschlichen Patienten. Hier standard RPE - Zellen wurden von fötalen menschlichen Augen isoliert, kultiviert und differenziert auf unbeschichteten 10 um dicke Polyester (PET) fügt gemäß unserer früher veröffentlichten Protokoll 14. Eine Berechtigung mit dem menschlichen fetalen Material zu arbeiten wurde von der Ethikkommission der Universität Bonn erhalten. Alternativ hES-RPE wurden aus dem Skottman lab (Manuskript in Vorbereitung.) Geliefert, wo sie nach der Technik von Vaajasaari et al beschrieben kultiviert wurden . 32; für diese Zellen eine Genehmigung wurde von der R.-Koch-Institut, Berlin, Deutschland, erhalten.

  1. Spülen der Zellkultur vor der Herstellung des Implantats 3x mit Augen Klasse BSS.
  2. Füllen Sie eine Standard-Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Augen Klasse BSS.
  3. Fügen Sie den Zellkultureinsatz in das BSS und in der Mitte der Schale unter einem Lichtmikroskop.
  4. Punch-Out ein 2,4 x 1,1 mm Implantat mit einem stumpfen, oval, maßgeschneiderte Nadel eine flache, bohnenförmige Substrat zu erhaltenmit zwei langen Kanten und zwei runden Kanten.
  5. Fluten vorsichtig die Nadel durch die zweite Öffnung mit BSS des Implantats in das BSS gefüllt zu spülen , nach Maß Ladestation (Abbildung 1).
  6. schneiden Optional eine Runde Ende des Implantats (<0,5 mm), um nur dritte Kante zu erhalten.
  7. Stellen Sie sicher, dass das Implantat in der richtigen Orientierung ist, indem sichergestellt wird, dass die Monoschicht auf der Zellträger Kopf ist. So ändern Sie sorgfältig zwei Skalpelle Positionierung verwenden.
  8. Schieben das Implantat sanft und vollständig in den Schützen Instrument unter Verwendung des Nadelhalters, bis das gesamte Implantat innerhalb der Spitze befestigt ist. Der Kolben sollte zurückgezogen bleiben.
  9. Halten Sie die "geladen" Shooter Spitze in Ladestation unter BSS bis zum Zeitpunkt der Implantation.

6. Implantierung

  1. Nähern Sie sich neuronale Netzhaut mit ausfahrbaren 41 G subretinalen Injektionsnadel gas Spritze verbunden (sicherzustellen, dass alle Luftblasen wurden evakuiertvon Leitungen!).
  2. Injizieren BSS (mit Calcium und Magnesium / CM) subretinal und dadurch eine Bleb Netzhautablösung (brd) erstellen von etwa 2 - 3 Disc-Durchmesser (DD). Zwei brd pro Auge kann sicher angehoben werden.
  3. Vergrößern Retinotomie bis 1,5 mm mit einer vertikalen 23 G VR-Schere. Der subretinalen Raum ist nun für die Implantation oder weitere Manövrieren.
  4. Extend Sclerotomie (genau) mit einem 1,4 mm Schneidmesser bis 20 G-Ansatz.
  5. Der Versuch, durch die Sclerotomie Gabe eines 20 G-Shooter Dummy verwenden, vergrößern bei Bedarf glatt, noch eng Übergang des geladenen Shooter zu gewährleisten.
  6. Fahren Sie mit dem geladenen Shooter 27 bis Sclerotomie idealerweise bei 24 mmHg.
  7. Ansatz Retinotomie Rand und Auswerfen des Implantats subretinal aus epiretinales Position.
  8. Stellen Sie das Implantat mit halbgeschlossenen 23 G Scheren, Pinzetten oder 41 G-Nadel sicherzustellen, dass es von der Retinotomie maßen gut weg unter dem retina- positioniert ist.

7.Außerbetrieb

  1. Entfernen Sie 25 G-Kronleuchter und Infusionskanüle.
  2. Suture alle Sklerotomien.
  3. Injizieren von 25 ul (10 mg) Triamcinolon durch den 8.00 Uhr Sklerotomie (vor dem Vernähen letzten Sklerotomie).
  4. Prüfen / einstellen IOP durch Palpation und injizieren BSS über 30 G-Nadel / Spritze, wenn nötig.
  5. Suture Bindehaut mit 7-0 Vicryl.
  6. Entfernen proptosing 3-0 Seide Schlinge langsam (tief orbitalen Venenplexus vermeiden!).
  7. In Dexamethason / antibiotische Salbe unter dem Deckel.
  8. Position für 1 Stunde mit Decke bedeckt mit operierten Auge nach oben (w / o Gas) oder nach unten (mit Luft / Gas).
  9. Lassen Sie keine Tier unbeaufsichtigt, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt sternal recumbence aufrecht zu erhalten.
  10. Nicht Kaninchen transportieren, bevor die Betäubung vollständig verblasst, kann dies durch Medetomidin Mittel Umkehren Injizieren beschleunigt werden gleich gegeben von Medetomidin betragen.

8. Post-operative Animal Care

  1. BehaltenKaninchen unter geeigneten Bedingungen (Temperatur, Licht, Nahrung, Wasser, Raum, etc.) und eine ständige Überwachung in einer spezialisierten Einrichtung.
  2. Stellen Sie sicher , dass Tier gut ausgeruht, dh., Keine längere Zeiträume von Lebensmitteln oder Wasserentzug.
  3. Achten Sie auf Wunden oder Verletzungen, vor allem an der Injektionsstelle.
  4. Halten Wunden trocken Infektionen zu verhindern. Geben Sie Antibiotika, wenn Verdacht auf eine Infektion: Dexamethason 1 mg / g, Neomycin-Sulfat 3.500 IE / g, Polymyxin B-Sulfat 6.000 IE / g Salbe aufgetragen wurde zweimal täglich für 1 Woche postoperativ auf der Augenoberfläche.
  5. In Dexamethason / antibiotische Salbe zur postoperativen nächsten 7 Tage zweimal täglich für eine bessere Augenoberfläche Regeneration und reduziert postoperative Schmerzen.
  6. Geben systemische Analgetika (Carprofene 4 mg / kg zweimal täglich) für die erste 48 Stunden.
  7. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten sternal recumbence wiedergewonnen hat.
  8. Verwenden Sie kein Tier zurückgeben,Chirurgie an der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen, bis sie vollständig erholt hat.
  9. Setzen Sie Tiere unnötige Ängste.

9. SLO / SD-OCT Guidance

  1. intramuskuläre (IM) Anästhesie mit 1 Spritze mit 27 G-Nadel enthält 0,175 mg / kg Ketamin und 0,125 mg / kg Medetomidin für den Start vorbereiten und injizieren. Drehen Sie die Spritze zu mischen.
  2. Fügen Sie ein Schmiermittel mindestens alle 5 min Auge zu befeuchten und klare SD-OCT-Bildgebung halten, gegebenenfalls eine benutzerdefinierte Kontaktlinse verwendet werden.
  3. Bringen Sie eine Stahlplattform an der Kopfstütze des Tieres in die gewünschte Position zu stabilisieren.
  4. Legen Sie Kaninchen auf Stahlplattform, platzieren ihre Auge senkrecht zur Sonde.
  5. Halten Sie den Kopf des Kaninchens aus der unteren Wangenknochen (Mandibula) Vermeidung der Luftröhre.
  6. Tilt Tierkopf um etwa 45 ° in Richtung der SD-OCT-Sonde den Blickwinkel auf das Implantat zu optimieren.
  7. Verwenden Sie einen 30-Grad-Objektiv und die folgenden Parameter für optimal OCT-Bildgebung [HS]: 30 Grad Einstellungen für einzelne Zeile scannt mit ART-Modus auf 100 (Mittelung) eingestellt und 20 x 20 Grad Einstellungen für Lautstärke-Scans mit ART-Modus auf 15 festgelegt; Hochauflösungsmodus ist nicht erforderlich.
  8. Verwenden SLO Infrarotreflexionsabbildungs ​​der Brennebene des Implantats (Fig . 2A) zu finden; optimale Schärfe ist erreicht , wenn (alle) sind die Implantatkanten scharf 14.
  9. In Dexamethason 1 mg / g, Neomycin-Sulfat 3.500 IE / g, Polymyxin B-Sulfat 6.000 IE / g Salbe unter dem Deckel, wenn Sie fertig.

Representative Results

Die Ergebnisse aus dem beschriebenen Verfahren zur subretinalen Implantation sind in Tabelle 2 gezeigt Engraftment unter der Netzhaut eine Erfolgsquote von ca. 61% hatte , als ein Kern - Vitrektomie durchgeführt wurde , und stieg bis zu 76%, wenn hintere Glaskörperabhebung induziert wurde. Diese Zahlen umfassen 21% der Tiere ca. die entweder intraoperativ oder starben in den ersten drei postoperativen Tage. Diese Technik kann verwendet werden, um zwei Gerüste auf verschiedenen Netzhautbereiche gleichzeitig in einem Auge zu implantieren.

Die Kaninchen unterzog sich Operation in vivo Follow - up mit SD-OCT und histologische Verarbeitung wie von Stanzel et al. 27 (Abbildung 2). Abb. 2A zeigt Laserrasterophthalmoskop Infrarot - Reflexionsbild von implantierten kultivierten RPE auf einem Polyester - Membran (PET) nach einer unkomplizierten Transplantation. DasHalo um Implantat entspricht Atrophie Photorezeptor. Abb. 2B zeigt entsprechende SD-OCT, Retinal Ankündigung, vor allem Kernschicht (ONL) Verdünnung, hyper reflektierende Band auf SD-OCT über Implantat äußere, während das neuronale Netzhaut an das Implantat angrenzenden zeigt nahezu normale Reflexionsbänder. Diese Ergebnisse legen nahe , eine atraumatische Lieferung. Abb. 2C zeigt Hematoxiline / Eosin (H / E) Fleck des Implantats , die subretinalen Narben und ONL Atrophie um die Retinotomie Website , wahrscheinlich als Folge einer iatrogenen Manipulation zeigt, eine zusammenhängende noch unregelmäßig pigmentierte Schicht über PET. Bruch-Membran unter dem Implantat erschien auch zusammenhängend sein, und die Choriokapillaris enthält einige verstreute Erythrozyten. Diese morphologischen Ergebnis sind vergleichbar mit der SD-OCT und stärken die These von einer atraumatischen Lieferung.

Abbildung 1
Feige ure 1: Laden Shooter mit menschlichen iPS-RPE Cultured auf PET - Zellträger. A) zeigt Stanzen ein Implantat aus maßgeschneiderte Nadel. B) bohnenförmige Implantat geschnitten aus der Zellkultur. C) Positionierung des Implantats vor dem Laden. D) Laden von Shooter mit Implantat. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen .

Figur 2
Abbildung 2: Kultivierte menschliche hES-RPE auf PET - Zellträger 4 Wochen in Kaninchen subretinalen Raum. A) zeigt SLO Infrarot - Reflexionsbild, die grüne Linie abgrenzt den Querschnitt in Fig. 2B. B) entsprechende SD-OCT. C) H / E - Färbung, siehe Text oder 26,27 für weitere Einzelheiten.ove.com/files/ftp_upload/53927/53927fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Parameter Gebrauchte Einstellungen
Vitrektomie 6000 Schnitte / min
Vakuum 200 mmHg
Die Anstiegszeit 1 Sek
Luft 24 mmHg
Bewässerung 24 cm H 2 O
DiathErmy 30%

Tabelle 1: Parameter Setup der Vitrektomie - Maschine.

Vitrektomie Implantieren Kaninchen betrieben Erfolgreiche Implantat fehlgeschlagen Implantat Tod Erfolgsrate%
Core-Vitrektomie HAUSTIER 30 19 4 7 63.33
PET + RPE 70 42 12 16 60
PVD, ± Plasmin w / PPV HAUSTIER 28 21 2 5 75
PET + RPE 22 17 2 3 77,27

Tabelle 2: Zusammenfassung der letzten 150 Operationen , einschließlich Verfahren und Implantattyp.

Discussion

RB, BVS, ZL, NE und Geuder AG haben eine europäische Patentanmeldung auf den Schützen eingereicht. NB ist ein Mitarbeiter von Geuder AG. Publikationsgebühren für dieses Video-Artikel wurden von Geuder AG bezahlt.

Disclosures

Retinalen Pigmentepithel (RPE) Ersatzstrategien und Gen-Therapie für mehrere degenerativen Retina Bedingungen betrachtet. Für die klinische Übersetzung werden große Auge Tiermodellen erforderliche chirurgische Techniken anwendbar bei Patienten zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Kaninchenmodell für subretinalen Chirurgie zu RPE-Transplantation ausgerichtet, die vielseitig und kosteneffizient ist.

Acknowledgements

Unterstützt von Rüdiger Stiftung vergibt im Jahr 2008 und 2010 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0015 (BVS), BONFOR / Gerok Scholarship O-137,0019 (FT), die Deutsche Forschungsgemeinschaft / DFG (BVS) STA 1135 / 2-1, Chinesisch Scholarship Council Nr 2008627116 (ZL) und eine uneingeschränkte Gewährung von Geuder AG, Heidelberg (Abb. 2). Mitglieder von H. Skottman Labor, Universität Tampere Finnland sind für die Bereitstellung von hES gedankt RPE in Bild 2 gezeigt abgeleitet.

Materials

: , ,
s30 Ultraschall-ReinigungsgerätElmasonic100 46312,75 L
DE-23  AutoklavSystecC 220923 L
Spritze BD 300013
300995 
301285
300294
300330 
1 ml x3
2 ml x3
5 ml x1
10 ml x1
20 ml x1
Nadel BD305196
305136
18 G x1 
27 G x5
Skalpellfeder2975#20Klinge#20 x3
OP-AbdecktuchHARTMANN
LOHMANN & RAUSCHER
277 502
25 440
60 x 40 cm x2
12 x 17 cm
OkularstäbchenLOHMANN & RAUSCHER16 51666 x 5 mm
Twister MullschwämmeHARTMANN481 274x2
VerschlussstreifenHARTMANN540 686x4
Opmi Visu CS MikroskopZeissN/ainkl. Fundus Imaging System BIOM II
Kronleuchter EndoilluminationGeuderG-S03503 +
G-S03504
25 G inkl. Trokar
LichtmaschineGeuderG-26033Xenotron III
VitrektomiegerätGeuderG-60000MegaTRON S4 S4/ HPS
VitrectorGeuderG-46301MACH2 Glaskörperschneider 23 G
Venturi-KassetteGeuderG-60700
Sideport-InfusionskanüleGeudercustom 23 g x1
3-0 SeidennahtETHICONV546Gx1
BremssattelGeuderG-19135x2
Vannas SchereGeuderG-19777x1
Sklerotomie KlingeZiemer21-23011x 23 G
1x 20 G
7-0 SeidennahtETHICONEH6162H x1
NadelhalterGeuderG-32320x2
IriszangeGeuderG-18910x1
Colibri PinzetteGeuderG-18950x1
Ausziehbare subretinale InjektionsnadelDORC1270.EXT41 G
VR SchereGeuderG-3654225 G
Grieshaber ZangenhalterAlcon712.00.4123 G
Gebogene ScherenzangeSpitzen Alcon723.5223 G
Implantat-LadestationDow Corning3097358-1004SYLGARD 184 Silikon-Elastomer-Kit
Blunt ovales Implantat-Trephin Geudernach Maß 2,4 x 1,1 mm;
Shooter DummyGeuderG-32227x1
ShooterGeuderG-S03443x1
FlötennadelDORC1281.SD20 G (Vakuum)
Manuelle MikroliterspritzeHamilton24535100 µ l
GewebekulturplattenGreiner bio-one  664160100 x 20 mm
Spectralis Multi-Modality
Imaging System
Heidelberg
Engineering
N/aSpectralis HRA
 + OCT
Drugs and solutions
NameCompanyWirkstoff Kommentare
Mucadont-ISMerz Hygieneviruzides Instrumentendesinfektionsmittel 2 L
Schleimhaut  TMerz HygieneAldehydfreies Instrumentendesinfektionsmittel2 L
Ketamin 10%WDTKetamin 10 ml (100 mg/ml)
DomitorOrion PharmaMedetomidinhydrochlorid10 ml (1 mg/ml)
AntisedanOrion PharmaAtipamezolhydrochlorid10 ml (5 mg/ml)
Neosynephrin POS 10%URSAPHARMPhenylephrin HCl10 ml
MydriacylAlconTropicamid10 ml (5 mg/ml)
Methocel 2%Omni VisionHydroxypropylmethylcellulose10 g
PURI CLEARZEISSBalance Salzlösung (BSS)  500 ml
Glukose 5%   B.BraunGlukose 5%  Lösung100 ml
Heparin-Natrium-25.000RatiopharmHeparin5 ml (2.500 Einheit/ml)
SuprareninSANOFIEpinephrin1 ml (1 mg/ml)
TriamcinolonUniversität Bonn Apothekekonservierungsmittelfrei Triamcinolon1 ml (40 mg/ml)
Isoptomax AugensalbeAlconDexamethason 1 mg/g
Neomycinsulfat 3.500 IE/g
Polymyxin B-Sulfat 6.000 IE/g
10 ml
BetaisodonaMundipharmaPovidon-Iod30 ml (1 g/10 ml)
OptiveALLERGAN,Natriumcarboxymethylcelluloseglycerin10 ml

References

  1. Fine, A. M., et al. Earliest symptoms caused by neovascular membranes in the macula. Arch Ophthalmol. 104, 513-514 (1986).
  2. Lim, L. S., Mitchell, P., Seddon, J. M., Holz, F. G., Wong, T. Y. Age-related macular degeneration. Lancet. 379, 1728-1738 (2012).
  3. Holz, F. G., Strauss, E. C., Schmitz-Valckenberg, S., van Lookeren Campagne, M. Geographic Atrophy: Clinical Features and Potential Therapeutic Approaches. Ophthalmology. 121, 1079-1091 (2014).
  4. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Prog Retin Eye Res. Prog Retin Eye Res. 26, 516-554 (2007).
  5. da Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Prog Retin Eye Res. 26, 598-635 (2007).
  6. Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Maculoplasty for age-related macular degeneration: reengineering Bruch's membrane and the human macula. Prog Retin Eye Res. 25, 539-562 (2006).
  7. Gouras, P., Marmor, M. F., Wolfensberger, T. J. . The retinal pigment epithelium. , 492-507 (1998).
  8. Lund, R. D., et al. Cell transplantation as a treatment for retinal disease. Prog Retin Eye Res. 20, 415-449 (2001).
  9. Blenkinsop, T. A., Corneo, B., Temple, S., Stern, J. H. Ophthalmologic stem cell transplantation therapies. Regen Med. 7, 32-39 (2012).
  10. Hirami, Y., et al. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458, 126-131 (2009).
  11. Carr, A. J., et al. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in neurosciences. 36, 385-395 (2013).
  12. Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385, 509-516 (2015).
  13. Jha, B. S., Bharti, K. Regenerating Retinal Pigment Epithelial Cells to Cure Blindness: A Road Towards Personalized Artificial Tissue. Curr Stem Cell Rep. , 1-13 (2015).
  14. Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2, 64-77 (2014).
  15. Hynes, S. R., Lavik, E. B. A tissue-engineered approach towards retinal repair: scaffolds for cell transplantation to the subretinal space. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248, 763-778 (2010).
  16. Szurman, P., et al. Experimental implantation and long-term testing of an intraocular vision aid in rabbits. Arch Ophthalmol. 123, 964-969 (2005).
  17. Bhatt, N. S., et al. Experimental transplantation of human retinal pigment epithelial cells on collagen substrates. Am J Ophthalmol. 117, 214-221 (1994).
  18. Nicolini, J., et al. The anterior lens capsule used as support material in RPE cell-transplantation. Acta Ophthalmol Scand. 78, 527-531 (2000).
  19. Thumann, G., et al. The in vitro and in vivo behaviour of retinal pigment epithelial cells cultured on ultrathin collagen membranes. Biomaterials. 30, 287-294 (2009).
  20. Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Kaplan, H. J. Survival of allogeneic porcine retinal pigment epithelial sheets after subretinal transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 985-992 (2004).
  21. Pritchard, C. D., Arner, K. M., Langer, R. S., Ghosh, F. K. Retinal transplantation using surface modified poly(glycerol-co-sebacic acid) membranes. Biomaterials. 31, 7978-7984 (2010).
  22. Montezuma, S. R., Loewenstein, J., Scholz, C., Rizzo, J. F. Biocompatibility of Materials Implanted into the Subretinal Space of Yucatan Pigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
  23. Brantfernandes, R. A., et al. Safety study in Mini Pigs of transplanted Human Embryonic Stem Cell Derived Retinal Pigment Epithelium (hESC-RPE). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 312 (2012).
  24. Lu, B., Zhu, D., Hinton, D., Humayun, M. S., Tai, Y. C. Mesh-supported submicron parylene-C membranes for culturing retinal pigment epithelial cells. Biomed Microdevices. 14, 659-667 (2012).
  25. Boochoon, K. S., Manarang, J. C., Davis, J. T., McDermott, A. M., Foster, W. J. The influence of substrate elastic modulus on retinal pigment epithelial cell phagocytosis. Journal of biomechanics. 47, 3237-3240 (2014).
  26. Liu, Z., Yu, N., Holz, F. G., Yang, F., Stanzel, B. V. Enhancement of retinal pigment epithelial culture characteristics and subretinal space tolerance of scaffolds with 200 nm fiber topography. Biomaterials. 35, 2837-2850 (2014).
  27. Stanzel, B. V., et al. Subretinal delivery of ultrathin rigid-elastic cell carriers using a metallic shooter instrument and biodegradable hydrogel encapsulation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 490-500 (2012).
  28. AORN Recommended Practices Committee. Recommended practices for maintaining a sterile field. AORN J. 83 (2), 402 (2006).
  29. Hong, S. B., et al. Physiologic characteristics of cold perfluorocarbon-induced hypothermia during partial liquid ventilation in normal rabbits. Anesth Analg. 94, 157-162 (2002).
  30. Machemer, R. The development of pars plana vitrectomy: a personal account. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233, 453-468 (1995).
  31. Los, L. I., van Luyn, M. J., Nieuwenhuis, P. Organization of the rabbit vitreous body: lamellae, Cloquet's channel and a novel structure, the 'alae canalis Cloqueti'. Exp Eye Res. 69, 343-350 (1999).
  32. Vaajasaari, H., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  33. Iverson, D. A., Katsura, H., Hartzer, M. K., Blumenkranz, M. S. Inhibition of intraocular fibrin formation following infusion of low-molecular-weight heparin during vitrectomy. Arch Ophthalmol. 109, 405-409 (1991).
  34. Thieltges, F., et al. Subretinal implantation of human embryonic stem cell derived RPE on ultrathin polyester carriers in rabbits. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56, 1824 (2015).
  35. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2, 205-218 (2014).
  36. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Intact sheets of fetal retina transplanted to restore damaged rat retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39, 2121-2131 (1998).
  37. Stanzel, B. V., et al. SD-OCT Complements Histology in Evaluation of Potential Bruch's Membrane Prosthetics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 5241 (2010).
  38. Marmor, M. F., Abdul-Rahim, A. S., Cohen, D. S. The effect of metabolic inhibitors on retinal adhesion and subretinal fluid resorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 19, 893-903 (1980).
  39. Frambach, D. A., Marmor, M. F. The rate and route of fluid resorption from the subretinal space of the rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 22, 292-302 (1982).
  40. Kita, M., Negi, A., Marmor, M. F. Lowering the calcium concentration in the subretinal space in vivo loosens retinal adhesion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33, 23-29 (1992).
  41. Marmor, M. F. Control of subretinal fluid: experimental and clinical studies. Eye. 4 (Pt 2), 340-344 (1990).
  42. Faude, F., et al. Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42, 1328-1337 (2001).
  43. Szurman, P., et al. Ultrastructural Changes after Artificial Retinal Detachment with Modified Retinal Adhesion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 4983-4989 (2006).
  44. Fang, X. Y., et al. Effect of Ca(2+)-free and Mg(2+)-free BSS Plus solution on the retinal pigment epithelium and retina in rabbits. Am.J.Ophthalmol. 131, 481-488 (2001).
  45. Ivert, L., Kjeldbye, H., Gouras, P. Long-term effects of short-term retinal bleb detachments in rabbits. Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol. 240, 232-237 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen
JoVE logo
Contact Us Recommend to Library
Research
  • JoVE Journal
  • JoVE Encyclopedia of Experiments
  • JoVE Visualize
Business
  • JoVE Business
Education
  • JoVE Core
  • JoVE Science Education
  • JoVE Lab Manual
  • JoVE Quizzes
Solutions
  • Authors
  • Teaching Faculty
  • Librarians
  • K12 Schools
About JoVE
  • Overview
  • Leadership
Others
  • JoVE Newsletters
  • JoVE Help Center
  • Blogs
  • Site Maps
Contact Us Recommend to Library
JoVE logo

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved

Privacy Terms of Use Policies
WeChat QR code