Methodenartikel

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

DOI:

10.3791/53933

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8. Mai 2016

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1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiple Sklerose ist vermutlich eine entzündliche Autoimmunerkrankung, die durch Bildung von Läsionen im zentralen Nervensystem (ZNS), die sich in kognitiven und motorischen Beeinträchtigungen charakterisiert ist. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein nützliches Tiermodell der MS, weil es auch durch Bildung von Läsionen im ZNS, motorischen Beeinträchtigungen charakterisiert ist und auch von Autoimmun- und Entzündungsreaktionen angetrieben wird. Einer der EAE - Modellen mit einem Peptid , abgeleitet von dem Myelin - Oligodendrozyten - Protein (MOG) 35-55 in Mäusen induziert. Die EAE Mäuse einen progressiven Krankheitsverlauf zu entwickeln. Dieser Kurs ist in drei Phasen unterteilt: die präklinische Phase (Tag 0 - 9), der Ausbruch der Krankheit (Tag 10 - 11) und der akuten Phase (Tag 12 bis 14). MS und EAE werden durch autoreaktive T-Zellen induziert, die das ZNS infiltrieren. Diese T-Zellen sezer Chemokine und Zytokine, die die Einstellung von weiteren Immunzellen führen. Daher ist die Immunzellverteilung im Rückenmark dährend die drei Krankheitsphasen untersucht. Um den Zeitpunkt der Krankheit hervorheben, an dem die Aktivierung / Proliferation / Anhäufung von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten beginnt, die Immunzellverteilung in Lymphknoten, Milz und Blut wurde ebenfalls bewertet. Darüber hinaus sind die Ebenen der mehreren Cytokinen (IL-1β, IL-6, IL-23, TNFa, IFN & ggr;) in den drei Krankheitsphasen bestimmt, Einblick in die Entzündungsprozesse der Krankheit zu erhalten. Zusammenfassend liefern die Daten, die einen Überblick über das Funktionsprofil von Immunzellen während EAE Pathologie.

Einleitung

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Multiple Sklerose (MS) und der entsprechenden Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zeigen, Autoimmun neuroinflammation Veränderungen im zentralen Nervensystem (ZNS). Frühe aktive MS und EAE Läsionen werden durch die Anwesenheit von Immunzellen infiltriert gekennzeichnet. Die Ätiologie von MS ist unbekannt, wird aber häufig von autoreaktiven T-Zellen vermittelt beinhalten die Zerstörung des Myelins betrachtet. Diese autoreaktiver T-Zellen sezernieren pro-inflammatorische Zytokine und Chemokine, die andere Immunzellen anziehen, wie beispielsweise B-Zellen, Monozyten und Neutrophile aus dem Kreislauf. Monozyten differenzieren sich in Makrophagen. Interferon gamma (IFNy) abgesondert von autoreaktiven T-Zelle polarisiert die Makrophagen in pro-inflammatorischen Makrophagen. Die pro-inflammatorischen Makrophagen Freisetzung Zytokine und reaktive Sauerstoffspezies, die Apoptose in Oligodendrozyten fördern. Der Tod der Oligodendrozyten führt zu einer Demyelinisierung. Weiterhin unterscheiden B-Zellen in pLASMA Zellen und Freisetzung Autoantikörper gegen die Myelinscheide, was letztlich zu einer Verschlechterung der Myelin. Der Verlust von Myelin führt zu einer Verschlechterung von Axonen und Nervenzellen und dadurch zur Bildung von Läsionsstellen im ZNS , die das Hauptmerkmal der MS 1 darstellen. In der Peripherie sind T-Zellen und B-Zellen in den Lymphknoten aktiviert, proliferieren sie in der Milz und wandern durch den Kreislauf in das zentrale Nervensystem. Monocyten und Neutrophile proliferieren im Knochenmark und auch durch den Kreislauf in das zentrale Nervensystem zu migrieren.

Leukozytenextravasation aus dem Knochenmark, der Milz und der Lymphknoten in das Blut oder aus dem Blut in das ZNS ist ein mehrstufiger Prozess, der von mehreren Faktoren abhängt, einschließlich der molekularen Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und von Chemokinen und Chemokinrezeptoren vermittelte Endothel. Die Produktion von Chemokinen durch verschiedene Zelltypen während der Immun reactio induziert werdenn durch Zytokine wie Tumor - Nekrose - Faktor-α (TNF & agr;), IFN & ggr; und Interleukin-6 (IL-6), die anschließend Immunzellen an den Ort der Entzündung 2,3 rekrutiert. Immunzellen, die eine Untergruppe von Chemokin-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, je nach Zelltyp und Migrationspfad zur Entzündungsstelle. Somit CXCR2, CCR1 und CXCR1 auf reifen Neutrophilen im Knochenmark exprimiert werden und Blut 4 und Bindung seiner Liganden, CXCL2, CCL5 oder CXCL6 bzw. aktiviert Neutrophile und fördert ihre Adhäsion an das Endothel und anschließend, um die Migration der Zellen in das Gewebe 5-9. CCL2 und CCL20 anziehen Monozyten und Th1 / Th17 - Zellen 10, die jeweils CCR2 11 und CCR6 12, zum Ausdruck bringen. CCR1 und CCR5, die von verschiedenen Zelltypen exprimiert, einschließlich T - Zellen, Monozyten und Makrophagen 13 binden CCL3, CCL5 und CCL7 und werden während der MS 14 aufreguliert. CXCR3 wird ausgedrückt auf T-Zellen und bindet CCL9, CCL10 undCCL11 15.

Eine Hauptstrategie in der MS-Behandlung ist der Abbau von Immunzellen oder die Verhinderung von Immunzellinfiltration in das ZNS. Daher hat die Blockade von spezifischen Chemokinrezeptoren wurde in EAE untersucht. Antagonismus oder genetische Deletion von CCR1 16, 17 CCR2, CCR7 18 oder CXCR2 19 reduziert EAE Pathologie, während Antagonismus oder genetische Deletion von 20 CCR1, CCR5 20 oder 21 CXCR3 hat die Pathologie nicht reduzieren. Daher ist die Expression von spezifischen Chemokinrezeptoren auf Leukozyten entscheidend für die Infiltration des letzteren in das ZNS und bestimmt den Verlauf der EAE.

Die Abreicherung von Immunzellen ist eine wirksame Behandlungsstrategie für MS - Patienten, da infiltriert Immunzellen Cytokine freizusetzen, wie TNFa, IL-6 und IL-1β, welche wiederum, 22 den Entzündungsprozess oder den Abbau von Neuronen fördern. Darüber hinaus auto-reaktiven Th1 Zellen setzen IFNy, die wiederum Makrophagen freizusetzen TNFa, IL-1β und IL-23 stimuliert.

Diese Handschrift beschreibt die Induktion von EAE, die Bestimmung der Immunzellverteilung und die Zytokinkonzentrationen (mRNA) in verschiedenen Geweben in EAE-Mäusen. Die Zellen wurden während des Krankheitsverlaufs zu verschiedenen Zeitpunkten isoliert eine zeitabhängige Überblick über die entzündlichen Prozesse zu schaffen, die schließlich in der ZNS-Läsion Bildung führen.

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Protokoll

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ETHIK STATEMENT: Unsere experimentellen Verfahren genehmigt werden von der Ethikkommission des Regierungspräsidiums Darmstadt (Deutschland) und den nationalen und europäischen Vorschriften bestätigen. Alle Anstrengungen wurden unternommen, das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu verringern.

1. EAE Modell

  1. Die Induktion des EAE-Modell
    1. Verwenden 10- bis 13-Wochen alten weiblichen 129S4 / SvJae × C57BL / 6-Mäuse zur Induktion von EAE.
    2. Geben die Mäuse eine subkutane Injektion in die oberen und unteren Rücken des enzephalitogenen MOG 35-55 (Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein) Peptid (200 ug), emulgiert in 200 & mgr; l komplettes Freund`s Adjuvans (CFA) , das 400 & mgr; g Mycobacterium tuberculosis.
      Anmerkung: Als negative, nicht-krankheitsauslösenden Scheinkontrolle, unvollständiges Freund'sches Adjuvans Mycobacterium tuberculosis, in der gleichen Menge und dem gleichen Weg kann verwendet werden.
    3. TherENach ​​und nochmals 24 Stunden später, geben die Mäuse eine intraperitoneale Injektion von Pertussis-Toxin (insgesamt 0,2 & mgr; g, verdünnt in 200 & mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung, PBS). Verwenden Sie unbehandelte Mäuse als Kontrollgruppe, in der Lage sein mit gesunden Tieren erkrankten zu vergleichen.
      Anmerkung: Es ist auch möglich, EAE zu induzieren mit 200-300 ug MOG 35-55 Peptid, 300-500 & mgr; g Mycobacterium tuberculosis in CFA und 0,2-0,3 & mgr; g Pertussis - Toxin in einem Volumen von 0,1-0,2 ml pro Injektion.
    4. Ab einer Woche nach der Injektion examine Mäuse täglich auf klinische Symptome (siehe Schritt 1.2.1)
      Anmerkung: Der Tag des Krankheitsanfalls variiert in verschiedenen Experimenten, aber unter den in unserem Labor, dies ist etwa Tag 11 und somit hier Tag 14 wird definiert als 3 Tage nach dem Ausbruch der Krankheit. Alle Mäuse in der vorliegenden Studie entwickelten klinischen Symptome.
  2. Scoring der Mäuse
    1. Klassifizieren der klinischen Symptome von klinischen Scores wie folgt:0) keine Anzeichen, 0,5) distale Lähmung des Schwanzes, 1) vollständige Lähmung des Schwanzes, 1.5) schlaffer Schwanz und mild Schwäche der Hinterbeine, 2) schlaffer Schwanz und schwere Schwäche der Hinterbeine, 2.5) schlaffer Schwanz und Lähmung ein Hinterbein, 3) schlaffer Schwanz und Lähmung beider Hinterbeine, 3.5) Lähmung beider Hinterbeine und Schwäche eines Vorderschenkel (Mäuse diese Punktzahl zu erreichen wurden eingeschläfert, mit den lokalen ethischen Richtlinien im Einklang).

2. Herstellung von Einzelzellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Hinweis: Die Antikörpermischung besteht aus 1 ul CD45-Vioblue, 2 ul CD8-eFluor650, 0,5 ul CD11b-eFluor605, 0,5 ul F4 / 80-PE-Cy7, 1 & mgr; l CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 & mgr; l CD11c -AlexaFluor700, 1 ul CD19-APC-H7 und 1 ul Ly6G-APC-Cy7.

Hinweis: Wenn Sie nehmen Blut, Lymphknoten, Milz und Rückenmark dann die Prozedur ist wie folgt: Die Mäuse sind tief mit einer Kombination aus isofl narkotisiertUrane (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht). Weiter, um den Brustkorb zu öffnen, um das Blut mit einem intrakardialer Stick entfernen und die Mäuse intrakardial mit kaltem PBS perfuse. Dann entfernen Sie Knoten die Lymphe von Milz und schließlich das Rückenmark. Wenn Sie die Mäuse nicht intrakardial perfuse müssen dann die Mäuse durch Luxation des Halses unter tiefer Narkose einschläfern.

  1. Isolation von Splenozyten
    1. Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht).
    2. Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol eine Kontamination mit den Haaren zu vermeiden und den Thorax in Längsrichtung zu öffnen, ohne tiefere Gewebe Punktierung mit einer Schere.
    3. Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23.
      Hinweis: Die Milz im linken superior Bauch unter dem Brustkorb befindet. Wenn nur die Milz untersucht werden, dieses Organ kann vor Perfusion entfernt werden, um zu retain alle Zelltypen von Interesse.
    4. Entfernen Sie die Milz und schneiden etwa 1/8 aus und wiegen. Lagern Sie die Probe in PBS auf Eis.
    5. Quetschen das Milzgewebe durch ein 70 um Mesh Sieb (angeordnet über einem 50 ml Röhrchen), mit dem Kolben einer 2 ml Spritze.
    6. Waschen Sie das Gitter mit 5 ml PBS. Zentrifuge bei 1.800 × g für 3 min. Das Pellet in 500 & mgr; l Lyse-Lösung.
      Hinweis: In dieser Phase kann es notwendig sein, um eine Differentialzelle machen zählen, wenn später eine alternative FACS-Analyseverfahren verwendet wird, das verwendet keine Perlen (siehe Abschnitt 3).
    7. Inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) und fügen 500 ul PBS. Zentrifuge für 6 min bei 650 xg bei Raumtemperatur (RT).
    8. Wiederholen Sie den Waschschritt mit 500 ul PBS. Überstand verwerfen, Zellpellet in 100 ul 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS, fügen Sie 2 ul Fc-Rezeptor-1 (FcRI-) Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln.
    9. In 13 ul einetibody Mischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 & mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen.
      Hinweis: Die Färbeverfahren des Herstellers empfiehlt einen einzigen Wasch, aber zusätzliche Reduzierung der Hintergrundfärbung kann durch gegebenenfalls Wiederholung der Waschschritt ein oder zwei weitere Male erreicht werden.
    10. Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l PBS (oder möglicherweise zur Proteintrennung Laufpuffer, um potenziell Zell Verklumpen zu reduzieren) und überträgt es cytometry Rohr zum Strömungs. Halten Sie Zellen auf Eis.
  2. Isolierung von Lymphknotenzellen
    1. Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht).
    2. Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol und öffnen Sie den Thorax längs einer Schere. Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23.
    3. Um den Leistenlymphknoten isolieren, entfernen Sie vorsichtig die Haut im Bereich der hallop und wählen Sie die Lymphknoten vorsichtig aus dem Fettgewebe mit einer Pinzette. Wiegen Sie den Leistenlymphknoten und speichern Sie die Probe in PBS auf Eis.
      Hinweis: Wir haben Leistenlymphknoten in unseren Studien , weil O`Connor et al. festgestellt , dass eine hohe Zahl von aktivierten Monozyten, Makrophagen, Neutrophile und T - Zellen alle in den Leistenlymphknoten nach EAE Induktions 24 vorhanden waren.
    4. Drücken Sie den Lymphknoten durch einen 70 & mgr; m-Mesh-Sieb (platziert über einen 50-ml-Röhrchen) mit dem Kolben einer 2-ml-Spritze.
    5. Waschen Sie das Gitter mit 5 ml PBS. Zentrifuge bei 2.400 × g für 8 min. Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln.
    6. In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 & mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT.
    7. Überstand verwerfen, Zellpellet in 300 ul PBS (oder einen geeigneten Laufpuffer) und übertragenauf eine Durchflusszytometrie Röhre.
  3. Isolierung von Blutzellen
    1. In 50 ul 20 mM HEPES bis 50 & mgr; l Blut (stabilisiert mit EDTA) und fügen 500 ul Lyselösung. Inkubieren für 10 min bei RT und fügen 500 ul PBS. Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen und wiederholen Sie den Waschschritt.
    2. Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blocking-Puffer und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln.
    3. In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 & mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT. Überstand verwerfen, Zellpellet in 300 ul PBS und übertragen es auf die Durchflusszytometrie Röhre.
  4. Isolation von Rückenmarkszellen
    1. Anästhesieren Mäusen mit einer Kombination von Isofluran (2% in Carbogen pro Minute) und Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht).
    2. Wet Schnittbereich mit 80% Isopropanol und öffnen Sie den Thorax längsmit einer Schere. Perfuse Mäuse intrakardial mit kaltem PBS pH 7,0 23.
    3. Befeuchten Sie den Schnittbereich auf der Rückseite und machen wieder einen Längsschnitt mit einem Skalpell und entfernen Sie die Haut.
    4. Schneiden Sie den Lenden Teil der Wirbelsäule aus (die die Hinterbeine innervates) und spülen Sie es mit einer PBS-Spritze das Rückenmark zu extrahieren. Schneiden Sie ca. 1/3 der Lendenwirbel aus, wiegen diese und speichern Sie die Probe in PBS auf Eis.
    5. Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, 500 & mgr; l Zellablösung Lösung und HBSS (1: 1). In 3 mg / ml Kollagenase A und 1 Einheit / ml DNase I, decollate die Zellen durch wiederholte nach oben und unten Pipettieren und Inkubation für 30 min unter Schütteln bei 37 ° C bei 400 Umdrehungen pro Minute.
      Hinweis: Wenn bevorzugt, kann die Zellsuspension durch Dichtegradientenzentrifugation von kontaminierenden Myelin und Zelldebris gelöscht werden, die die Empfindlichkeit der Durchflusszytometrie Messung verbessern kann, wodurch, Hintergrundautofluoreszenz ein Reduktionsd die Anzahl der Ereignisse, die zu erwerb (siehe Abschnitt 3.5).
    6. Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei RT. Überstand verwerfen, das Pellet in 1 ml 10% fötales Kälberserum (FCS) / Dulbeccos minimal essentiellem Medium (DMEM) und decollate die Zellen erneut durch wiederholte auf und ab Pipettieren.
    7. Zentrifuge bei 250 × g für 2 min bei RT. Wiederholen Sie den Waschschritt.
    8. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml PBS und drücken den Kolben einer 2 ml-Spritze in das Rückenmark durch ein 70 um Mesh Sieb (angeordnet über einem 50 ml Röhrchen).
    9. Waschen Sie das Gitter mit 4 ml PBS. Zentrifuge bei 1.800 × g für 3 min bei RT. Überstand verwerfen, Zellpellet in 100 ul 0,2% BSA / PBS, fügen Sie 2 ul FcRI- Blockierungsreagenz und Inkubation für 15 min bei RT im Dunkeln.
    10. In 13 ul Antikörpermischung, Inkubation 15 min bei RT im Dunkeln, 500 & mgr; l PBS und Zentrifuge für 6 min bei 650 × g bei RT.
    11. Überstand verwerfen, suspendieren die Zelle pellet in 500 ul PBS (oder einem geeigneten Laufpuffer) und überträgt es auf die Durchflusszytometrie Röhre.

3. Analyse über Durchflusszytometrie

  1. Titrieren alle vorher Antikörper optimalen Konzentrationen zu bestimmen , wie durch Olesch et al. 25.
  2. Verwenden Antikörper-Einfangen Entschädigung Perlen für einfarbige Kompensation Mehrfarbkompensation Matrizen gemäß den Hersteller `s Anweisungen zu erstellen.
  3. Kontrollieren Sie die Gerätekalibrierung täglich mit speziellen Perlen gemäß den Hersteller `s Anweisungen.
  4. Unmittelbar vor der Durchflusszytometrie Messung wurden 30 ul absolute Zahl Standard durchflusszytometrischen zu den Zellen hinzu (für die Isolierung siehe Abschnitt 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) absolute Zellzahlen zu bestimmen. Anstelle des Zählens Perlen verwenden, können die Zellen gezählt werden.
  5. Nehmen Sie Proben (Zellen aus der Milz, Lymphknoten und Blut: 100.000 Ereignisse, Rückenmark: 500.000 Ereignisse) in einem Durchflusszytometer einnd analysieren spezifische Durchflusszytometrie-Software.
    1. Öffnen Sie die Durchflusszytometrie Software und fügen Sie fcs 3.0-Dateien durch Drücken der Taste "add Samples".
    2. Öffnen Sie die hinzugefügte Datei mit einem Doppelklick. Stellen Sie die Kanäle für die x- und y-Achse. So wählen Sie die Zellpopulationen von Interesse ein Tor erzeugen (siehe Abbildung 4).

4. Quantitative PCR-Analyse

  1. Isolierung von mRNA und Transkription in cDNA
    1. Extrahieren Sie die mRNA von lumbalen Rückenmark (1/3), Milz (1/8) und Leistenlymphknoten durch Phenol-Chloroform und fällt mit Ethanol 26.
      1. Hierzu homogenisieren das Gewebe in 1 ml Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Mischung für 10 min inkubieren. In 200 ul Chloroform und Inkubation erneut 10 min.
      2. Nach einem Zentrifugationsschritt (18.000 xg für 15 min bei 4 ° C), waschen Sie die obere wässrige Phase wird mit 500 & mgr; l Isopropanol und Zentrifuge (18000 × g für 8 min bei 4° C).
      3. Waschen Sie das Pellet mit 500 ul Ethanol und nach einem Zentrifugationsschritt (18.000 xg für 5 min bei 4 ° C), trocknet das Pellet im Vakuum-Konzentrator (5 min bei 30 ° C). Danach das Pellet in 30 ul Wasser.
    2. Zur Extraktion der mRNA aus Blut, Zentrifuge 500 ul EDTA-stabilisiertes Blut (300 · g 10 min 4 ° C).
      1. Nehmen den buffy coat, enthält weiße Blutkörperchen und verdünnt in 1 ml Lyse - Lösung (150 mM NH 4 Cl, 100 mM NaHCO 3, 0,1 mM Na-EDTA pH 7,4).
      2. Zentrifuge Nach 10 min Inkubation bei RT, die Zellen bei 650 × g für 6 min und danach zweimal waschen mit PBS.
      3. Extrahieren der mRNA aus weißen Blutkörperchen (WBCs) ein Kit zur RNA-Extraktion unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers.
    3. Führen cDNA-Synthese ein Kit für die cDNA-Synthese einschließlich zufälliger Hexamere gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. Verwenden Sie 200 ng mRNA für das CDNEine Synthese.
  2. Quantitative PCR
    1. Um die Menge einer spezifischen mRNA zu quantifizieren, verwendet werden 1 & mgr; l cDNA, 1 & mgr; M Vorwärts / Rückwärts - Primer und einen fluoreszierenden DNA - Bindungsfarbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers 27. Siehe Tabelle 1 für die Sequenzen für die Primer - Sets. Messen Sie die CT-Werte von IL-1β, IL-6, IL-23, IFN & ggr;, TNFa und PPIA (Peptidyl-Prolyl-Isomerase), um eine quantitative PCR-System.
    2. Zur Bestimmung der relativen mRNA - Expression des Vergleichs CT (cycle threshold) Verfahren 27 verwendet werden .
      1. Hierzu CT-Werte der Zielgene zu den Expressionsniveaus von PPIA normalisieren , indem der Mittelwert CT-Wert von PPIA vom Zielgen subtrahieren, wie in früheren Studien beschrieben (Barthelmes et al. 28, Schiffmann et al. 29, Schiffmann et al. 30). Anschließend berechnen die so ΔΔCT-Werte genannt, mit denen, normalisieren die ACt-Werteder Zielgene von EAE Mäuse mit dem Expressionsniveau der Zielgene von unbehandelten Mäusen, wiederum durch den Mittelwert ACt-Wert in der unbehandelten Mäusen aus dem ACt-Wert in EAE Mäuse subtrahieren.
      2. Um die relative mRNA - Expression des Zielgens zu gewinnen, wird das Verhältnis unter Verwendung der folgenden Formel: 2 - ΔΔct.
  3. Testen Sie die Spezifität von jedem Primer. Bestimmung der amplifizierten Fragmentgröße unter Verwendung einer 2% igen Agarosegel 31. Die Fragmentgröße ist in Tabelle 1 gezeigt.

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die verschiedenen Methoden in diesem Artikel beschrieben. 1) Die Mäuse erhalten eine Injektion von MOG 35-55 Antigen und entwickeln erste klinische Symptome nach 10,7 ± 0,3 Tagen 28. Eine repräsentative Krankheitsverlauf der EAE - Mäusen ist in Abbildung 1. 2) verschiedene Gewebe (Milz, Lymphknoten, Lenden - Rückenmark) und Blut werden von der Kontr...

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Diskussion

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Die EAE - Modell hier beschrieben hat die meiste Aufmerksamkeit als ein Modell der MS empfangen und in die Prüfung therapeutischer Strategien für MS 32 routinemäßig eingesetzt. Die Maus-Krankheit zeigt viele klinische und histologische Merkmale der MS und wird durch die Induktion von Autoimmunität zu neuronale Antigene verursacht. Die Sensibilisierung gegen Myelin-Antigene ist mit Blut-Hirn-Schranke Dysfunktion assoziiert und dadurch Immunzellinfiltration in das ZNS. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Immunzellen...

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Offenlegungen

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MJP ist Berater von Xellia und Leo Pharmaceuticals.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde gefördert durch das Graduiertenkolleg Translationale Forschung Innovation - Pharma (TRIP) der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (EKFS) und durch die Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" des Landes Hessen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ABI Prism 7500 Sequenz-Erkennungssystem Applied Biosystems, Austin, USAquantitatives PCR-System
AccutaseSigma Aldrich München, DeutschlandA6964Zellablösungslösung
CD3-PE-CF594BD, Heidelberg, Deutschland562286
CD4-V500BD, Heidelberg, Deutschland560782
CD8-eFluor650eBioscience, Frankfurt, Deutschland95-0081-42
CD11b-eFluor605eBioscience, Frankfurt, Deutschland93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700BD, Heidelberg, Deutschland560583
CD19-APC-H7 BD, Heidelberg, Deutschland560143
CD45-Vioblue Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland130-092-910
CompBeadsBD, Heidelberg, Deutschland552843Kompensationskügelchen
Kollagenase ASigma Aldrich München, DeutschlandC0130
Zytometrischer absoluter ZählstandardPolyscience, Eppelheim, DeutschlandBLI-580-10
Zytometer-Setup und Tracking-Beads BD, Heidelberg, Deutschland642412
DNase ISigma Aldrich München, DeutschlandD5025
EAE KitHooke Laboratories, Lawrence, USAEK2110
F4/80-PE-Cy7 BioLegend, Fell, Deutschland123114
erstes Strang-cDNA-Synthese-Kit Thermo Scientific, Schwerte, DeutschlandK1612
Fc-Rezeptor-1-BlockierungspufferMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland130-092-575
Durchflusszytometrischer AbsolutzahlstandardPolyscience, Eppelheim, Deutschland580
FlowJo software v10 Treestar, Ashland, USADurchflusszytometrie-Software
LSRII/Fortessa BD, Heidelberg, DeutschlandDurchflusszytometer
Ly6G-APC-Cy7 BD, Heidelberg, Deutschland560600
Lysing-Lösung BD, Heidelberg, Deutschland349202
Maxima SYBR Green Thermo Scientific, Schwerte, DeutschlandK0221fluoreszierender DNA-Bindungsfarbstoff 
RNeasy Mini Bausatz Qiagen, Hilden, Deutschland74104RNA-Extraktionskit

Referenzen

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