Vorgehensweise Um die Effizienz von Flockungsmittel für die Beseitigung von Dispersed Partikel aus Pflanzenextrakten zur Bewertung

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Versuchsdesign-Verfahren ermöglicht die Bewertung verschiedener Flockungsmittel im Hinblick auf ihre Fähigkeit, dispergierte Partikel in Pflanzenextrakten zu aggregieren und so die Trübung und die Kosten der nachgelagerten Verarbeitung zu reduzieren.

Zusammenfassung

Pflanzen sind für den Menschen nicht nur wichtig, weil sie Rohstoffe wie Nahrung, Futtermittel und Rohstoffe liefern, sondern zunehmend, weil sie als Produktionsplattformen für Mehrwertprodukte wie Biopharmazeutika verwendet werden können. In beiden Fällen müssen unter Umständen flüssige Pflanzenextrakte geklärt werden, um Partikel zu entfernen. Eine optimale Klärung reduziert die Kosten für Filtration und Zentrifugation durch Erhöhung der Kapazität und Langlebigkeit. Dies kann durch die Einführung von geladenen Polymeren, den sogenannten Flockungsmitteln, erreicht werden, die dispergierte Partikel vernetzen, um die Fest-Flüssig-Trennung zu erleichtern. Für komplexe Mischungen wie Pflanzenextrakte gibt es keine mechanistischen Flockungsmodelle, daher werden stattdessen empirische Modelle verwendet. Hier wird ein Design-of-Experiments-Verfahren beschrieben, das ein schnelles Screening verschiedener Flockungsmittel ermöglicht, die Klärung von Pflanzenextrakten optimiert und die Trübungen deutlich reduziert. Die daraus resultierenden Vorhersagemodelle ermöglichen die Identifizierung robuster Prozessbedingungen und Sätze von Polymeren mit komplementären Eigenschaften, z.B. effektive Flockung in Extrakten mit spezifischen Leitfähigkeiten. Die vorgestellten Ergebnisse für Tabakblattextrakte können leicht auf andere Pflanzenarten oder Gewebe übertragen werden und werden so die Entwicklung kostengünstigerer nachgelagerter Prozesse für Rohstoffe und pflanzliche Arzneimittel erleichtern.

Einleitung

Pflanzen sind weit verbreitet zu produzieren Nahrungsmittelrohstoffe wie Fruchtsäfte verwendet, aber sie können auch als Plattform für die Herstellung von höherwertigen biopharmazeutischen Produkten ^1-3 entwickelt werden. In beiden Fällen wird der Weiterverarbeitung (DSP) beginnt häufig mit der Entnahme von Flüssigkeiten aus dem Gewebe wie Blätter oder Früchte, gefolgt von der Klärung der partikelbeladenen Extrakte ^4,5. Für die Herstellung von Biopharmazeutika, können die Kosten für die DSP machen bis zu 80% der gesamten Produktionskosten ^6,7 und dies spiegelt teilweise die hohe Partikelbelastung in Extrakten durch disruptive Methoden wie Blade-basierte Homogenisierung hergestellt ^8,9 . Obwohl die rationale Auswahl der Filterschichten kann die Partikelgrößenverteilung in dem Extrakt auf Filterkapazität zu erhöhen und die Kosten ^10,11 reduzieren, kann die Verbesserung nicht durch die Anzahl von Partikeln definiert , die Obergrenze der absolute Kapazität überschreiten , die pro aufbewahrt werden müssenEinheit Filterfläche Klärung zu erreichen.

Die Decke kann aufgehoben werden , wenn weniger Partikel die Oberfläche der feinsten Filter in der Filterstrang gelangen, und dies kann , wenn dispergierte Teilchen vermischt sind mit Polymeren als Flockungsmittel bekannt , erreicht werden, die die Aggregation fördern ¹² große Flocken zu bilden. Solche Flocken können weiter stromaufwärts durch gröbere und weniger teuer Beutelfilter zurückgehalten werden, um die Partikelbelastung Verringerung der feineren erreichen und teurer Tiefenfilter. Die Polymere müssen Sicherheitsprofile haben für ihre Anwendungen, zB für Biopharmazeutika sie mit der guten Herstellungspraxis (GMP) entsprechen müssen, und in der Regel müssen sie eine Molmasse> 100 kDa haben und entweder neutral oder ¹³ aufgeladen werden kann. Während neutral Flockungsmittel deren Aggregation und die Bildung von Flocken mit einem Durchmesser handeln , im allgemeinen durch Vernetzung dispergierten Teilchen verursacht> 1 mm ^11, neutralisieren geladene Polymere die Ladung von dispersed Partikel, wodurch ihre Löslichkeit und damit verursachenden Niederschläge ^14.

Flockung kann durch Einstellen Parameter wie pH oder Leitfähigkeit und der Polymertyp oder der Konzentration verbessert werden, ^15,16 , die Eigenschaften des Extrakts zu entsprechen. Tabakextrakte vorbehandelt mit 0,5-5,0 g L ^-1 Polyethylenimin (PEI), eine mehr als 2-fache Erhöhung der Tiefenfilterkapazität wurde in einer 100-L Pilotmaßstab Prozess berichtet. Die Kosten für dieses Polymers weniger als 10 € kg ^-1 , so dass ihre Einführung in den Prozess zu Kosteneinsparungen geführt von ca. 6.000 € für Filter und Verbrauchsmaterialien pro Charge ¹⁶ oder sogar noch mehr , wenn sie mit Cellulosebasis Filterhilfsmittel ¹⁷ kombiniert. Trotzdem sind Vorhersagemodelle erforderlich , um die a priori wirtschaftlichen Nutzen von Flockungsmitteln zu bewerten , da die Einbeziehung halten Schritten von 15-30 min ^16,18 erfordern kann, was zu einer weiteren Investitionskosten für die LagerungPanzer. Es gibt jedoch noch keine mechanistische Modelle zur Verfügung, um das Ergebnis dieser Experimente aufgrund der komplexen Natur der Flockung vorhersagen kann. Daher ist ein geeignetes Design-of-Experiments (DoE) Ansatz ¹⁹ wurde wie in diesem Artikel beschrieben entwickelt. Ein Protokoll für die allgemeine DoE Verfahren wurde kürzlich ²⁰ veröffentlicht.

Kleines Geräte sind ab sofort verfügbar für das Hochdurchsatz - Screening von Flockungsbedingungen ^21. Jedoch können diese Vorrichtungen nicht realistisch Bedingungen während der Ausflockung von Pflanzen simulieren extrahiert, da die Abmessungen des Reaktionsgefäßes (~ 7 mm für die Vertiefungen auf einer Platte mit 96 Vertiefungen) und die Partikel oder Flocken kann weniger als eine Größenordnung auseinander. Dies kann Mischmuster beeinflussen und damit die Vorhersagekraft des Modells. Darüber hinaus kann es schwierig sein, Prozesse zu verringern Präzipitation denen aufgrund nicht-linearen Änderungen des Mischungsverhalten und Präzipitat stabilität ^22. Daher beschreibt dieser Artikel eine Bank-top-Skala - Screening - System mit einem Durchsatz von 50 bis 75 Proben pro Tag, Ergebnisse liefert , die von der anfänglichen 20 ml Reaktionsvolumen auf einer 100 l - Pilotmaßstab Prozess ¹⁶ skalierbar sind. Wenn es mit einem DoE Ansatz kombiniert, ermöglicht dies die Vorhersagemodelle für die Prozessoptimierung und Dokumentation im Rahmen eines Qualitäts-by-Design-Konzept verwendet werden.

Das nachfolgend beschriebene Verfahren kann auch auf Biopharmazeutika angepasst werden produziert in der Zellkultur-basierten Verfahren, bei denen Flockungsmittel auch als kostensparende Werkzeug ²³ in Betracht gezogen werden. Es kann auch die Ausfällung von Zielproteinen aus einem Rohextrakt zu modellieren als Teil eines Reinigungsstrategie verwendet werden, wie für die β-Glucuronidase in Raps, Mais und Soja ^24,25 hergestellt demonstriert. Eine detaillierte Beschreibung der Flockungsmittel Eigenschaften können an anderer Stelle werden ^16,26 und es ist wichtig , um sicherzustellen , dass das Polymer Konzentr gefundentionen sind entweder nicht-toxische oder unter schädlichen Mengen im Endprodukt ^11.

Protokoll

1. Entwickeln Sie eine angemessene experimentelle Strategie

1. Identifizieren Sie die Umwelt- und Prozessparameter , die relevant sind für die Flockung Verfahren festgelegt oder optimiert werden, das heißt , welche Faktoren den stärksten Effekt auf Flockung haben. Typischerweise gibt es mehrere solche Parameter so ein Ansatz DoE wie kürzlich beschrieben ²⁰ aufgrund des Fehlens von mechanistischen Modelle notwendig.
   1. Wählen Sie die Parameter (Faktoren) auf Basis von Literaturdaten ^12, Vorkenntnisse und Erfahrungen mit dem System. Typische Faktoren umfassen Puffer , pH, Pufferleitfähigkeit, Inkubationszeit und Temperatur sowie Polymertyp und Konzentration ^15,16,27.
   2. Verwenden Sie die gleichen Referenzen (siehe 1.1) für jeden numerischen Faktor und Ebenen für kategoriale Faktoren sinnvolle Bereiche zu definieren.
   3. Definieren die Versuchsergebnisse (Reaktionen) zu überwachen und verwendet werden, um die Effizienz der Flockung zu bewerten. Je nach System, diesekann Filtrat oder der Überstand Trübung, Sinkgeschwindigkeit, Aggregatgröße oder die Kapazität eines nachfolgenden Filter ^16,23,28-30.
   4. Sicherstellen, dass die Tests verwendet, um die Antworten zu messen sind quantitative, robuste und reproduzierbare / reproduzierbar, so dass die daraus resultierenden Daten hoher Qualität mit Experimenten später oder durch einen anderen Betreiber durchgeführt ergänzt werden kann.
2. Wählen Sie eine DoE Art die Anzahl der Faktoren suiting über das System untersucht und der Grad des Wissens bereits angesammelt. Verwenden Sie vorhandene Literatur eine geeignete DoE Typ ²⁰ zu identifizieren.
   1. Wählen Sie eine Siebung Design, wenn es wenig Informationen über die Flockung System untersucht werden, eine große Anzahl von Parametern gescreent werden müssen oder nur wenig bekannt über sinnvolle Bereiche für die Parameter. Typische Screening-Designs sind voll und teilfaktoriellen Designs. Umfassen Mittelpunkte in der Konstruktion , wenn die Parameter eine nichtlineare Wirkung zu erwarten ist , beispielsweise Sättigung über einer bestimmten Schwelle ^19.
   2. Wählen Sie eine Antwortoberfläche Methodik (RSM), zB zentrale Composite Design (CCD) ³¹ oder optimale ^32,33, wenn nur wenige Faktoren , die mit bekannten Bereiche müssen genau gekennzeichnet werden.
3. Stellen Sie die DoE mit entsprechender Software up a priori Qualitätskriterien wie der Anteil der Design - Raum zu gewährleisten ²⁰ erfüllt sind.

2. Bereiten Sie die Flockung Experimente

Abbildung 1: Pflanzenextrakt Flockung Workflow: Prozessmaßstab (links) und Benchtop - Skala (rechts). Folgende Protein Extraktion mit wässrigen Puffern, dispergierte Teilchen von Zelltrümmer werden durch die Zugabe von Flockungsmitteln aggregiert. Die Aggregate werden dann durch eine Kaskade von Tasche und Tiefenfiltration und die Kapazität dieser entferntentlang Filter mit dem Filtrat Trübungen können direkt die Effizienz der Flockung zu messen, verwendet werden.

1. Entwickeln Sie eine Allgemeine experimentelle Work Flow (Abbildung 1).
   1. Verwenden Sie eine Absaugeinrichtung , die voraussichtlich in der gleichen Partikelgrößenverteilung ergibt sich (oder bereits beobachtet wird ) bei der Endanwendung Skala, zB einem spezialisierten Homogenisator. Wenn möglich, die Gestaltung eines Scale-down - Modell des Extraktor für die Homogenisierung von Tabak beschrieben ¹⁰ verlässt.
   2. Definieren Sie die Extraktmengen während Flockung Experimenten verwendet (hier 20 ml). Wählen Sie ein Volumen , das eine repräsentative Anzahl von Teilchen sein , die in dem Reaktionsgefäß, beispielsweise Flockungs- Experimente in 20 ml Aliquots ergab reproduzierbar und skalierbares Ergebnisse für Tabakextrakten ~ 7% [w / v] Feststoffe ³⁴ und Teilchengrößen von ~ 0,5 ermöglicht um bis ~ 3 mm ^16.
   3. Entwerfen Sie alle Überwachungs- und Post-Flockung-Operationen, so dass they sind repräsentativ für die Skala Endanwendung, zB wählen Sie Filter mit dem gleichen Verhalten Partikelretention , wie sie bei den Produktionsmaßstab verwendet.
2. Pflegen Sie die Pflanzen, aus denen die Extrakte hergeleitet.
   1. Verwenden Sie die gleiche Pflanzenlinie, hier Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 und Anbaubedingungen , die bei der Herstellung verwendet werden , wie zuvor beschrieben ^33.
   2. Wenn andere Ausgangsmaterialien verarbeitet werden, diese Ausgangsmaterialien vorbereitet , so dass sie von der Endanwendung Maßstab repräsentativ sind, zum Beispiel verwenden authentische Puffer, zur Berücksichtigung von Verdünnungsschritte während des Prozesses und halten Sie sich an den erwarteten pH - Wert und Leitfähigkeit, hier pH 7,5 und Leitfähigkeit 30 mS cm ^-1.
3. Bereiten Filtration Utilities, Trübungs-Überwachungsgeräte und Probenahmegefäße.
   1. Schneiden Sie die Filtermaterialien auf die gewünschte Größe, hier 15 x 15 cm ^2, wenn sie nicht bereit zu uns sinde-Module. Sicherstellen, dass alle Überwachungs- und Analysegeräte sind funktionell und beschriften Sie alle Probenröhrchen.
   2. Auch wenn diese einfache Aufgaben sind, bereiten diese Elemente in der Zeit, um sicherzustellen, dass sie nicht Unterbrechungen während der eigentlichen Flockung Experimente führen wird. Vermeiden Sie Verzögerungen, weil sie mit den Ergebnissen, die Flockung gegeben stören kann, ist eine zeitabhängige Verfahren.
4. Bereiten Sie Flockungsmittel Stammlösungen. ACHTUNG: Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung , wenn Flockungsmittel, zB Handschuhe Handhabung. Die Materialien können gefährlich sein (Gefahrzetteln nach Europa UE 67/548 / EWG und 1999/45 / CE umfassen N, Xi oder Xn). Vermeiden Sie Staub und beziehen sich auf die Sicherheitsdatenblätter. Die Arbeiten im Rahmen einer Abzugshaube.
   1. Wählen Sie eine Stammkonzentration für jedes Flockungsmittel, hier 80,0 g L ^-1 für die beiden PEI Flockungsmittel , die verwendet wurden. Wählen Konzentrationen so hoch wie möglich Probenverdünnung zu vermeiden, wenn das Flockungsmittel Zugabe, die Partikel Konzentra reduzieren würdetion und damit Flockung Effizienz beeinflussen.
   2. Konto für jede Prädilutions- , die die Hersteller Formulierung des Polymers, zum Beispiel , wenn das Polymer bereits geliefert als eine wässrige 50% [w / v] Lösung widerspiegelt. Flockungsmittel Stammlösungen von 4-8% [w / v] gefunden wurden die am besten geeignet, so weit zu sein.
   3. Unter Berücksichtigung der oben diskutierten Punkte, stellen Sie sicher, dass das Flockungsmittel Konzentration erzeugt keine eine hochviskose Lösung, die Pipettieren hemmt, möglicherweise Fehler verursachen, weil die endgültige Flockungsmittelkonzentration nicht richtig eingestellt ist.
   4. Verwenden Sie die gleiche Stammkonzentration für alle Flockungsmittel, wenn möglich, da dies den Aufbau eines Pipettierschema (2.5) erleichtern somit die Wahrscheinlichkeit von Fehlern zu reduzieren.
   5. Stellen Sie den pH - Wert und Leitfähigkeit jedes Flockungsmittel Stammlösung , die Bedingungen der Extrakte übereinstimmen, hier pH 4-10 und 15-55 Leitfähigkeit mS cm ^-1. Bereiten Sie einzelne Aktien für ein einzelnes Flockungsmittel, wenn mErz als ein Satz von pH-Wert und / oder Leitfähigkeitsbedingungen für diesen Polymer getestet.
   6. Bereiten Sie Flockungsmittel Stammlösungen frisch, nicht mehr als 48 Stunden vor dem Gebrauch. Obwohl kann Flockung mit Polymer-Aktien für mehr als 4 Wochen gelagert induziert werden, kann der Wirkungsgrad durch Hydrolyse bei hohen oder niedrigen pH-Werten zu Polymer sinken. Finden Sie in der Dokumentation des Herstellers für weitere Details.
   7. Stellen Sie sicher , dass die Parameter für die DoE ausgewählt können während des Experiments genau für jede Probe eingestellt werden, zum Beispiel sicherzustellen , dass es Heiz- / Kühlbäder zur Verfügung Bebrütungstemperaturen einzustellen, hier 4 ° C, 20 ° C und 37 ° C. Wenn während der Flockung Mischteil des Experiments ist es, sicherzustellen, dass die Mischvorrichtung ist repräsentativ für die Endanwendung Skala in Bezug auf kritische Parameter wie Stromeingang.
5. Konvertieren Sie das DoE Zeitplan in ein Pipettierschema.
   1. Konvertieren Sie die verschiedenen Flockungsmittel Konzentrationen tes zu seinted in Volumen der Stammlösung, die zu den Extraktproben hinzugefügt werden: die letzten Flockungsmittel Konzentrationen durch die Stammkonzentration teilen und durch das Probenvolumen in den Flockung Experimenten verwendet multiplizieren. Identifizieren Sie die größte resultierende endgültige Volumen, zB wenn 20 ml Probe mit maximal 2 ml Flockungsmittel Stammlösung gemischt wird diese 22 ml sein wird.
   2. Berechnen Volumina Puffer erforderlich , um den gleichen Endvolumen in allen Flockung Aliquots auf dem größten Volumen des Flockungsmittels Lager basierend aufrechtzuerhalten hinzugefügt werden, beispielsweise wenn 0,75 ml Flockungsmittel Lager muß dann 1,25 ml Puffer zu einer Probe hinzugefügt werden , erforderlich , um die zur Aufrechterhaltung letzte Probenvolumen von 22 ml (2.5.1).
   3. Addieren Sie die Volumina von Flockungsmittel Stammlösung für jedes Polymer und Flockung Zustand bis die absoluten Volumina der Stammlösung zu berechnen, die für die DoE erforderlich sind.
6. Ernte-Tabakblätter und Vorbereiten der Extrakt.
   1. Entfernen Sie die Top-Sechs leaves (oder so viele wie möglich in den Verfahrensanweisungen angegeben) aus Tabakpflanzen eines geeigneten Alter, zB 6 Wochen alt, und die Übertragung auf eine geeignete Vorrichtung Extraktion wie einem Homogenisator oder Schneckenpresse.
   2. In drei Volumina Extraktionspuffer pro Gramm Biomasse, zB 300 ml pro 100 g, und Mischung für 8 min.
   3. Bereiten einzelnen Extrakte mit den geeigneten Puffern, wenn unterschiedliche pH und / oder Leitfähigkeit getestet. Hier handelt es sich dabei um das Pflanzenmaterial Homogenisieren 3 x 30 sec in einem Mixer oder einem Entsafter ^34.
   4. Alternativ bereiten den Extrakt in einer Weise, die repräsentativ für die Verfahren untersucht wird.
7. Aliquot der Extrakt und Fügen Sie den Puffer.
   1. Manuell und gründlich verrühren, den Extrakt während des gesamten Verfahrens die Proben sind homogen mit einer gleichmäßigen Verteilung der Partikel zu gewährleisten.
   2. Gerade verteilen den Extrakt unter den voretikettierten Reaktionsröhrchen dekantiert,hier 20 ml in jedem Gefäß. Selbst stehende 50-ml-Röhrchen Handhabung vereinfachen und sind ideal für 20-ml-Proben.
   3. Füge das Volumen jeder Extraktionspuffer erforderlich, um die Fest Endvolumen für jede einzelne Reaktionsröhre aufrechtzuerhalten einer geeigneten Pipette.

3. ausflocken die Pflanzenextrakte mit verschiedenen Polymeren

1. Pipette, um die benötigte Menge an Flockungsmittel Stammlösung, hier 0,1-2,0 ml, auf die Proben der Reihe nach, wie durch die randomisierten Lauf Reihenfolge der DoE angezeigt. Gründlich mischen jede Probe unmittelbar nach der Zugabe von Flockungsmittel durch intensive Anleitung genau 20 Sekunden schütteln.
   1. Bei Bedarf anpassen für andere Einsatzmaterialien, die Rüttelzeit Durchmischung zu gewährleisten, sondern streng konsequente Mischzeiten für alle Proben zu gewährleisten. Beachten Sie, dass das Mischen verlängert kann die irreversible Zerstörung der Flocken verursachen und inkonsequent ausgeübte Kraft während des Schüttelns verzerren können die Flockung Ergebnisse.
2. Optional: das Verfahren Modify oben für die gleichzeitige Anwendung von zwei oder mehr Flockungsmittel beschrieben.
   1. Option 1: Anstelle eines einzigen Polymer eine Mischung aus zwei oder mehreren Flockungsmitteln hinzuzufügen, hier PEI und Chitosan. Verwenden Sie die Flockungsmittel Kombinationen in der DoE definiert. Integrieren Sie das Verhältnis und absoluten Konzentrationen der Polymere als einzelne Parameter während des DoE-Setup (1.1).
   2. Option 2: Hinzufügen von zwei oder mehr Polymeren sequentiell zu dem Extrakt.
      1. Verwenden, um die einzelnen Polymerkonzentrationen, ist ihre Art und die Inkubationszeit zwischen jeder Zugabe zu dem Extrakt, als zusätzliche Faktoren während der SVM-Setup.
      2. Auch diesen Ansatz verwenden, um zu testen, ob die wiederholte Zugabe eines einzelnen Polymer Flockung verbessern können. Verwenden , um eine schrittweise Zugabe der langsamen Zugabe eines Flockungsmittels zu simulieren, beispielsweise vier Stufen, wobei jede Zugabe von 0,25 ml 80 g L ^-1 Flockungsmittel Lager auf ein 20 ml Volumen über 4 min kann die Zugabe von Flockungsmittel imitieren miteine Durchflussrate von 0,25 ml min ^-1.
      3. In allen Fällen, indem die maximale Lautstärke aller Flockungsmittel zum Probenvolumen, hier noch 22 ml, und neu berechnen die erforderlichen Mengen an Flockungsmittel Stammlösungen und Puffer zur Steigerung des Volumens, wenn notwendig, eine neue maximale endgültige Probenvolumen für diese Einrichtung zu identifizieren.
3. Inkubieren der Proben für die Zeiten, in der DoE definiert, typischerweise 3-30 min, Flockenbildung zu ermöglichen. Stellen Sie sicher , dass alle anderen Inkubationsbedingungen, zB Temperatur, werden entsprechend dem DoE.
4. Bitte beachten und Dokument Flockenbildung. Notieren Sie sich den Fortschritt der Flockenbildung bei Bedarf, zB als mm von Flocke pro min Absetzen durch die Höhe der abgesetzten Feststoffe zu messen. Bei Bedarf verlängern Flockung für einen längeren Zeitraum, wie beispielsweise über Nacht.
5. Filtern des ausgeflockten Extrakt.
   1. Verwenden Sie die Filtermaterialien früher hergestellt (2.3) des ausgeflockten Extrakt nach der entsprechenden zu klärenInkubationszeit durch die ausgeflockten Proben durch das Filtermaterial und in ein sauberes Gefäß oder Reaktionsröhrchen dekantiert.
      1. Sie nicht erneut zu suspendieren die abgesetzten Flocken vor der Filtration und Anwendung des Extraktes mit mit einer Rate von ~ 300 ml min ^-1 auf den Filter, entsprechend 3-4 sec für eine 20 ml Probe.
      2. Bestätigen Sie die Leistung des Filtrationsschritt , wenn ein anderes Material in den Benchtop-Experimente verwendet wird , im Vergleich zum letzten Prozess in Bezug auf die Partikelretention, zB durch die Partikelgrößenverteilung in den beiden Probentypen ¹¹ zu messen.
   2. Analysieren des Filtrats in Bezug auf Trübung und / oder Korngrößenverteilung je nach Bedarf mit geeigneten Vorrichtungen, beispielsweise einem Turbidimeter.
   3. Optional: wiederholen Sie die Analyse nach längeren Inkubationszeiten, zB 12-24 h, die Bildung oder Neubildung von instabilen Flocken zu untersuchen.
6. Analysieren Sie die Proben im Hinblick auf die PrE-definierten Antworten (1.1.3).
   1. Nehmen Sie Proben aus den Filtraten und analysieren sie für zusätzliche Reaktionsparameter, wie zB die Konzentrationen verschiedener Zielproteine ​​oder wertvolle Produkte.
   2. Optional: Analysieren Sie den Rückstand (meist Feststoffe) für die gleichen Parameter, die die Massenbilanz des Verfahrens zu schließen. Insbesondere quantifizieren die Wirkung von Flockungsmitteln auf Flüssigkeitsrückgewinnung durch die Feststoffe zu vergleichen Masse zurückbleibt, nachdem Proben behandelt werden oder nicht mit Flockungsmittel behandelt.
7. Bestätigen Sie die Datenqualität und übertragen die Ergebnisse an die DoE-Software.
   1. Geben Sie für extreme Werte in den gesammelten Antwortdaten, zB unerwartet hohe Werte.
   2. Stellen Sie sicher, dass alle Antwortdaten korrekt mit den entsprechenden experimentellen Bedingungen ausgerichtet sind.
   3. Übertragen Sie die Ergebnisse in die DoE-Software und stellen Sie sicher, dass die Standard-und randomisierten Lauf Aufträge nicht vertauscht werden.

4. Bewerten Siedie DoE

1. Verwenden Sie die integrierten Datenanalysetools der DoE - Software ein Vorhersagemodell zu entwickeln , wie zuvor ²⁰ beschrieben.
   1. Wählen Sie einen geeigneten Datentransformationsmodus bei Bedarf Modellbildung zu erleichtern, melden Sie sich hier _10. Ein Verhältnis von mehr als 10 für größte vs. kleinste Antwortwert zeigt an, dass eine Datenumwandlung erforderlich. Identifizieren Sie die am besten geeignete Transformation die entsprechenden statistischen Werkzeugen, zB einer Box-Cox Plot ^35.
   2. Wählen Sie ein Basismodell , das (i) an die ausgewählte DoE passt (1.2) und (ii) stimmt mit Vorkenntnissen über das untersuchte System basiert auf der Analyse der Varianz (ANOVA) Werkzeuge der DoE - Software, zB ein Polynom zweiter Ordnung oft passt besser zu den beobachteten Effekt der Inkubationszeit als ein Polynom erster Ordnung.
   3. Entfernen unbedeutende Modell Faktoren, zum Beispiel p> 0,05, oder Faktor Wechselwirkungen iterativ durch sie Abwahl derreby Verringerung der Komplexität des Modells und seiner Aussagekraft zu erhöhen.
   4. Bestätigen Sie die Modellqualität durch R Vergleich ^2, eingestellt R ² und sagte voraus , R ² zusammen mit dem normalen Wahrscheinlichkeitsdiagramm der studentisierten Residuen Residuen-vs-run, vorhergesagt-vs-Ist - und Box-Cox - Plots ^36. Alle R ² Werte sollten innerhalb eines 0,2 - Bereich liegen.
   5. Stellen Sie sicher , dass das endgültige Modell stimmt mit den grundlegenden Annahmen der Physik und Thermodynamik, zB keine negativen Konzentrationen vorhergesagt werden.
2. Verwenden Sie die Modellbedingungen vorherzusagen, die am günstigsten sind für das untersuchte System, hier eine geringe Trübung.
   1. Wählen Sie die wichtigsten Antworten und deren bevorzugte Zustände, zB minimale Trübung. Kombinieren Sie diese Auswahl durch eine Wünschbarkeit Funktion oder ähnliche Werkzeuge zu maximieren, die eingebaut sind Merkmale von mehreren DoE - Software - Pakete ^36.
   2. In Abhängigkeit von der beabsichtigten Anwendung of Modell läuft Bestätigung wählen die optimalen Bedingungen und / oder die Vorhersagekraft des Modells im Allgemeinen, zum Beispiel , wenn die Bedingungen zu überprüfen , vorhergesagt am günstigsten zu sein waren sie nicht Teil der ursprünglichen DoE wählen als Follow-up - Experimente.

5. Verbesserung des Modells und Überprüfen Sie die Vorhersagekraft

1. Verfeinern Sie den ursprünglichen Design - Raum zu den begehrenswertesten Betriebsbedingungen, zB niedrige Trübung in der 0-1.000 nephelometrischen Trübungseinheiten (NTU) Bereich auf der Basis der Modellprognosen (4.2).
2. Richten Sie eine neue DoE innerhalb dieser Bereiche, darunter nur jene Faktoren, die als wesentliche oder relevant identifiziert wurden (4.1.2)).
   HINWEIS: Ein Faktor kann für einen Prozess in Bezug auf die Modellanalyse aber irrelevant signifikant sein, dh seine Wirkung auf eine Antwort ist <1% der von anderen Faktoren verglichen.
3. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 5,2, bis die Qualität der Modellvorhersagen der requiremen Spielets, beispielsweise die Standardabweichung des Modells , wie durch die Software angegeben ist für die beabsichtigte Anwendung ausreichend. Ändern Sie die experimentelle Strategie , wenn für diese Iterationen erforderlich sind , zB verwenden nur ein Flockungsmittel in der Verfeinerung.
4. Übertragen und die Ergebnisse aus der Scale-down-Modell in den Pilotmaßstab oder endgültige Produktionsmaßstab bestätigen.

Ergebnisse

Flockung von Tabakextrakt mit verschiedenen Polymeren

Das oben beschriebene Verfahren wurde erfolgreich ein Verfahren zu entwickeln für die Ausflockung von Tabakextrakte bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers (der HIV-neutralisierenden Antikörper 2G12) und ein fluoreszierendes Protein (DsRed) (Abbildung 1) ¹⁶ verwendet und ist seit übertragen auf andere Proteine ​​einschließlich Lektine,...

Diskussion

Der wichtigste Aspekt zu berücksichtigen , wenn eine DoE Einrichtung Partikel Flockung zu charakterisieren , ist , dass das Design grundsätzlich in der Lage sein müssen , um die zu erwartenden oder möglichen Auswirkungen ^36,38, zB der Einfluss von pH - Wert, Polymertyp und Polymerkonzentration ¹⁶ erfassen und zu beschreiben. Daher ist es wichtig, den Anteil des Bauraums (FDS) vor Beginn der eigentlichen Experimente zu bewerten. Die FDS ist der Anteil des mehrdimensionalen Versuchsraum (abg...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2100P Tragbares Trübungsmessgerät	Hach	4650000	Trübungsmessgerät
2G12 Antikörper	Polymun	AB002	Referenzantikörper
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR-Gerät
BP-410	Furh	2632410001	Beutelfilter
Catiofast VSH	BASF	79002360	Flockungsmittel
Zentrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Zentrifuge
Zentrifugenröhrchen 15 ml	Labomedic	2017106	Reaktionsröhrchen
Zentrifugenröhrchen 50 ml freistehend	Labomedic	1110504	Reaktionsröhrchen
Chitosan	Carl Roth GmbH	5375.1	Flockungsmittel
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.DoE	Software
Dinatriumphosphat	Carl Roth GmbH	4984.3	Medienkomponente
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Dünger
Forma -86C ULT Gefrierschrank	ThermoFisher	88400	Gefrierschrank
Gewächshaus	n.a.n.a.Für		die Pflanzenzucht
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm	Grodan	102446	Rockwool Block
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Medienkomponente
K700P 60D	Pall	5302305	Tiefenfilterschicht
KS50P 60D	Pall	B12486	Tiefenfilterschicht
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filtertuch
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020 pH-Messgerät	/ Leitfähigkeitsmessgerät
Osram kaltweiß 36 W	Osram	4930440	Lichtquelle
Phytotron	Ilka Zell	n.v.Für	den Pflanzenbau
Polymin P	BASF	79002360	Flockungsmittel
POLYTRON PT 6100 D	Kinematica	11010110	Homogenisierungsgerät mit speziellem Klingenwerkzeug
Protein A	Life technologies	10-1006	Antikörper-bindendes Protein
Natriumchlorid	Carl Roth GmbH	P029.2	Medienkomponente
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluoreszenzplatten-Reader
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Medienkomponente
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Medienkomponente
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filtergehäuse
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS Messung der Partikelgrößenverteilung