Wir demonstrieren das Verfahren zur intratrachealen Inokulation von Haemophilus influenzae in die unteren Atemwege von Mäusen. Dies ist ein sehr nützliches Werkzeug, um Signalwege zu untersuchen, die die Entzündung der Atemwege in Mausmodellen regulieren.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hier beschreiben wir ein detailliertes Verfahren , um effizient und direkt Haemophilus influenzae liefern in die unteren Atemwege von Mäusen. Wir zeigen das Verfahren zur Herstellung von H. influenzae Inokulum, intratracheale Instillation von H. influenzae in die Lunge, Sammlung von broncho-alveolären Lavage (BALF), Analyse von Immunzellen in der BALF und RNA - Isolation für Differentialgenexpressionsanalyse. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Lungenentzündungsreaktion auf alle Bakterien, Viren oder Pilze zu untersuchen. Direkt tracheale Instillation wird meist über intranasale oder Aerosolinhalationsverfahren bevorzugt, da es effizienter das bakterielle Inokulum in die unteren Atemwege mit geringer Mehrdeutigkeit liefert.
Einleitung
Die Entzündung ist eine grundlegende Immunabwehrmechanismus gegen infektiöse Erreger. Es fördert die Erreger Beseitigung und Reparatur von beschädigtem Gewebe. Es erleichtert auch die Erholung zu einem normalen , gesunden Zustand 1. Jedoch führt dysregulated Entzündung oft zu chronischen entzündlichen Erkrankungen 2. Entzündung der Atemwege ist ein erster Auslöser für verschiedene Lungenerkrankungen wie chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Asthma und Lungenfibrose 3.
Die nicht-typisierbaren (nicht eingekapselten) Haemophilus influenzae (NTHi) mit chronischen oberen und unteren Lungenent....
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Protokoll
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von Baylor Research Institute durchgeführt.
1. Anzucht nicht typisierbaren Haemophilus influenzae (NTHi) und Vorbereiten des Inokulums
- Platte NTHi auf einem Schokolade - Agar - Platte und halten die Platte den Kopf in einem befeuchteten CO 2 Inkubator über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. Am folgenden Tag Kultur der Bakterien in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe. Dann fügen Sie 1 ml der Brühe in eine sterile 1,5 ml-Tube.
- Zentrifuge bei 4.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Dann w....
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Ergebnisse
Intratracheale Instillation führte zu einer deutlich erhöhten Anzahl von Leukozyten in der BALF (1A, linkes Feld) als Anlage mit Kochsalzlösung. Die Differentialzählung Analyse der Leukozyten zeigte deutlich erhöhte neutrophile Infiltration (Abbildung 1, rechts). Die FACS - Analyse der Zellen in der BALF bestätigt weiter die erhöhte Anzahl von Neutrophilen (1B). Histologische Analyse von H & E-gefärbten Schnitten des Lungengewebes ze.......
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Diskussion
Hier beschreiben wir eine einzigartige und minimal-invasive Verfahren, um die Lungen von Mäusen, die mit einer bakteriellen Lungen Pathogen zu beimpfen. Wir zeigen, dass dieses Verfahren verwendet werden kann, um die Funktion der verschiedenen Gene zu untersuchen, die in Mäusen unter Verwendung von Genen von Entzündungssignalwege defizient sind. Dieses Verfahren kann auch die Entzündungsreaktionen gegen virale und fungale Infektionen der Lunge zu untersuchen verwendet werden. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber and.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Carson Harrod für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch Herrn Minghui Zeng und Dr. Mahesh Kathania und Dr. Prashant Khare für ihre Beiträge. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der American Cancer Society (Research Scholar Grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) und des Sammons Cancer Center (Pilot Project Grant) an K. Venuprasad unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Schokoladen-Agar-Platte | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose wasserfrei | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Geschickte Schnelllösung | Sigma | GS500-500ML | |
| Spritzennadel 20/26G | BD( | REF305115/175) | |
| Iml-Spritze | BD | REF 309602 | |
| Katheter 20GA | BD | REF | |
| Präparierschere, gerade, 10 cm lang | kentscientific | INS600393 | |
| Irispinzette, gezahnt, 10 cm lang | kentscientific | INS650915 | |
| Pinzette #5 Edelstahl, 11 cm lang | kentscientific | ||
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml Polystyrol Rundbodenröhrchen | BD | REF 352058 | |
| 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet-Pestil-Motor (Gewebehomoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96-Well-Mikrotiterplatten V-Boden | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Arbeitsverdünnung 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Arbeitsverdünnung 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Lebend/tot fixierbares Aqua Totzellen-Färbekit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0,5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/ CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs Röhrchen Polystyrol Rundbodenröhrchen | BD | 352052 | |
| Formaldehyd | Polyscience | 4018 |
Referenzen
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
