Futter suchen Pfad-Länge-Protokoll für Drosophila melanogaster Larvae

Zusammenfassung

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für einen Drosophila melanogaster-Assay zur Nahrungssuche zur Verfügung. Wir besprechen die Vorbereitung und Handhabung von Versuchstieren, die Durchführung des Assays und die Analyse der Daten.

Zusammenfassung

Die Drosophila melanogaster Larven Weglängen-Phänotyp ist ein etabliertes Maß verwendet , um die genetischen und Umwelt Beiträge zur Verhaltensänderung zu studieren. Die Larven Weglängen-Assay wurde individuelle Unterschiede in der Nahrungssuchverhalten zu messen entwickelt , die später auf die Nahrungssuche Gen verknüpft wurden. Larval Pfad-Länge ist ein leicht erzielte Merkmal, das die Sammlung von großen Probengrößen bei minimalen Kosten, für die genetische Bildschirme erleichtert. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung des aktuellen Protokolls für die Larven- Weglänge Assay zuerst von Sokolowski verwendet. Das Protokoll beschreibt, wie reproduzierbar Testtiere behandeln, die Verhaltenstest durchführen und die Daten zu analysieren. Ein Beispiel, wie kann der Assay verwendet werden Verhaltensplastizität in Reaktion auf Umweltveränderungen zu messen, die von Umgebungs Manipulieren Einspeisen vor dem Test durchgeführt wird, ist ebenfalls vorgesehen. Schließlich entsprechende Test-Design sowie Umweltfaktoren, die ändern könnenLarven Weg Länge wie Lebensmittelqualität, sind Entwicklungsalter und Tag Effekte diskutiert.

Einleitung

Seit der Entdeckung des weißen Gens in Thomas Hunt Morgan Labor im Jahre 1910, die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), wurde als Modell für die Untersuchung der molekularen und physiologischen Grundlagen der verschiedenen biologischen Prozessen eingesetzt. Die Popularität von D. melanogaster resultiert im Wesentlichen aus der großen Menge und Vielfalt an genetischen Werkzeugen. Drosophila geringe Größe, relativ einfache Handhabung und kurze Generationszeit machen es zu einem idealen Modell für Genetik Studien. Ebenso wichtig ist die Fähigkeit der Drosophila viele der Phänotypen von komplexeren Organismen einschließlich Säugetieren ausgedrückt zu demonstrieren. Dazu gehören komplexe Phänotypen wie Verhalten, das an der Schnittstelle zwischen dem Organismus und seiner Umwelt stehen. Als solche haben wesentlich zu unserem Verständnis, wie Gene und Umwelt vermitteln Verhalten Verhaltensstudien an der Fruchtfliege beigetragen1.

Eine der ersten Studien von D. melanogaster Larven Verhalten untersucht individuelle Unterschiede in der Larvennahrungssuche Strategien durch die Weglängen von Larven ² Messung während der Fütterung. Pfadlänge wurde als die Gesamtdistanz von einer einzigen Larve auf Hefe, innerhalb eines Zeitraums von fünf Minuten gereist definiert. Beide Laborstämme und Fliegen aus einer natürlichen Population in Toronto variiert in ihrer Nahrungssuche Verhaltensweisen und es gab eine genetische Komponente der individuellen Unterschiede in der Pfadlänge. Zwei Larvennahrungssuche Morphs wurden aus den quantitativen Pfadlängenverteilungen beschrieben und sie wurden Rover und Sitter genannt. Rovers zeigen längere Weglängen, während eine größere Fläche, während auf einem Lebensmittelsubstrat als Sitter durchquert. Mit diesem Weg langen Test de Belle et al. ³ abgebildet , die Nahrungssuche (für) Gen diese individuellen Verhaltensunterschiede zu einem diskreten Ort auf Chromosomen- 2 (24A3-24C5) zugrunde liegen. Die D. melanogaster für Gen wurde später ⁴ kloniert und ergab ⁶ eine cGMP - abhängige Proteinkinase ^5, ein Modulator der Physiologie und Verhalten in Drosophila und anderen Organismen zu sein.

Hier beschreiben wir die aktuelle Protokoll für die Larven- Weglängen-Assay ursprünglich in Sokolowski ² entwickelt. Obwohl sich einige Aspekte des Tests im Laufe der Jahre verändert haben, hat das Konzept hinter dem Design nicht. Wir stellen auch Daten der Test das Potenzial zu beurteilen , genetischen und Umwelt Beiträge zur individuellen Unterschiede in der Nahrungssuchverhalten von Drosophila - Larven zu illustrieren. Die Larven Weglängen-Test ist einfach, effizient und doch robust. Eine einzelne Person kann in vier Stunden mit Leichtigkeit zu 500 Larven testen und Ergebnisse können mit einem hohen Maß an Reproduzierbarkeit erhalten werden. Ursprünglich entwickelt für zu lokalisieren, kann es in genetischen Screens verwendet werden, quantitative trait locus mapping, und in Studienvon Gen-für-Umgebung (GXE) Wechselwirkungen. Darüber hinaus machen die Einfachheit und Reproduzierbarkeit es eine große Ressource für Bachelor-Unterricht.

Protokoll

1. Bereiten Sie Trauben Platten und Halten Flaschen für Sammlung von Larvae

1. Um halten Flaschen machen, schneiden Löcher in einer Seite von 6 Unzen Fliegenkulturflaschen, groß genug , um eine Fliege Fläschchen Stecker für die Luftzufuhr zu passen (Abb. 1D).
2. Um Trauben Platten machen, bereiten 250 ml Traubensaft Medium (1,8% Agar, 45% Traubensaft, 2,5% Essigsäure, 2,5% Ethanol) durch Kochen des Agar, Traubensaft und das meiste Wasser, abkühlen auf 70 ° C ( rühren, während) Abkühlen, dann Essigsäure und Ethanol hinzufügen und auf das Volumen mit Wasser bringen.
3. Verwenden , um eine Spritze (ohne Kanüle) zu füllen , 35 x 10 mm Petrischale mit Deckel , bis die Oberfläche des Traubensaftes Medium eine Kuppel über der Lippe des Deckels bildet (Fig. 1A).
4. Store grape Platten in einer feuchten und luftdichten Behälter bei 4 ºC bis zur Verwendung (bis höchstens 2 Wochen).

2. Herstellung von Lebensmittel-Platten

1. Bereiten Sie Standard-fly Essen Rezept.
   Hinweis: Um test Aufzuchtfutter Qualität Auswirkungen auf Weglänge verwendet wir geringe Nährstofffliegenfutter: 10% Saccharose, 1,3% Agar, 0,8% Kaliumnatriumtartrat, 0,1% Monokaliumphosphat, 0,05% Natriumchlorid, 0,05% Calciumchlorid, 0,05% Magnesiumchlorid, 0,05% Eisensulfat, 5% Hefe und 0,5% Propionsäure in Wasser; und hohe Nährstofffliegenfutter: 1,5% Saccharose, 1,4% Agar, 3% Glucose, 1,5% Maismehl, 1% Weizenkeime, 1% Sojamehl, 3% Melasse, 3,5% Hefe, 0,5% Propionsäure, 0,2% Tegosept und 1 % Ethanol in Wasser. Für beide Lebensmittel , die Lösung und Abkühlen auf 50 ^° C im Autoklaven vor der Propionsäure, Tegosept und Zugabe von Ethanol.
2. Gießen Sie 40 ml Fliege Nahrung in 100 x 15 mm Petrischalen.
3. Die Lebensmittel-Platten in einer feuchten und luftdichten Behälter bei 4 ° C bis zur Verwendung (bis zu maximal 2 Wochen).

3. Bereiten Sie Testplatten

1. Bereiten Sie 58 x 25 cm, 6 mm dicke schwarze Plexiglasplatten mit 10, 1 mm tiefen, kreisförmigen Vertiefungen, 10 cm Durchmesser und angeordnet in einem 2 x 5 design (Abb. 1C) Larven zu testen , auf.
   Anmerkung: Bis zu 30 Larven können gleichzeitig getestet werden, wenn 3 oder mehr der oben Plexiglasplatten verfügbar sind. Alternativ dazu können Larven in Petrischalen von 10 cm Durchmesser getestet werden. Diese Option ist wesentlich arbeitsaufwendiger und ermöglicht niedrigere Anzahlen von Larven getestet werden.
2. Besorgen Sie sich eine schwarz 39 x 8 cm, 6 mm dicke Plexiglas Spreizer zum Spreizen des Hefe-Paste auf den Plexiglas-Testplatten.
3. Bereiten 100 x 15 mm Petrischale Deckel für die Aufnahme Larven Weglängen durch Deckel von Böden im Voraus zu trennen.

4. Einstellen der Kinder Populations

1. Halten Aufzuchtbedingungen konstant über den gesamten Test (zB 25 ° C, 60% Luftfeuchtigkeit und ein 0.12 Licht: Dunkel - Zyklus auf Standard - fly Essen).
2. Heben Sie die elterliche Bevölkerung in gleichen Aufzuchtbedingungen.
3. Sammeln Sie 100 bis 150 Frauen und 50 bis 75 Männer und älter werden sie für 5 ± 1 Tag für eine optimale Fruchtbarkeit.
4. Lassen Sie females und Männer über Nacht in einem 6 Unzen Fliegenkulturflasche mit Standard-fly Nahrung zu paaren.
5. Transfer fliegt in eine Halteflasche und sichern eine Traube Platte (eine kleine Menge frischer Hefe - Paste auf der Wein Platte wird zur Eizelle zu fördern; Fig . 1B) über die Oberseite mit Kreppband (Abb . 1E).
6. Lassen Sie Flaschen stehen auf den Kopf (Abb. 1F), mit der Traubenplatte am Boden Erwachsenen zu ermöglichen , um Eier zu legen auf der Traubenplatte.
7. Entsorgen Sie die erste Trauben Platte nach 24 Stunden und eine neue Traubenplatte in der Halteflasche. Dies wird die Trauben Platte, aus der Larven am nächsten Tag gesammelt werden.
   Hinweis: Traubenplatten werden müssen von 22 Stunden Larven gelöscht , nachdem aufgebaut wird, eingerichtet Platten , so dass sie früh am nächsten Tag gelöscht werden kann (. ZB Rüstplatte um 12 Uhr und klar um 10 Uhr am nächsten Tag). Es ist ratsam, die erste Trauben Platte zu verwerfen Eier zu vermeiden, die Frauen haben könnte Quellen und that könnte in der Entwicklung vorangetrieben werden.

5. Sammeln L1 (Erste Instar) Larven von Grape Plates

1. Entfernen Traubenplatten aus Flaschen 22 Stunden, nachdem sie eingerichtet wurden und in einem 60 x 15 mm Petrischale.
2. Legen Sie eine neue Trauben Platte mit frischer Hefe-Paste auf der Halteflasche.
3. Klare und verwerfen alle Larven aus der ausgesäten Traubenplatte eine Sezieren Sonde.
4. Incubate gelöscht Trauben Platten für 4 Stunden unter Standardbedingungen.
5. Nach 4 Stunden, Pick 100 L1-Larven pro Stamm aus den Traubenplatten und auf Nahrungsmittelplatten.
   1. Legen Larven auf das Essen sanft (ohne das Essen Perforieren und Vergraben der Larven) und vermeiden Crowding durch die Larven über die Nahrungsmittelplatte zu verteilen.
6. Inkubieren Lebensmittel Platten bis Versuchstiere etwa 10 Stunden vor dem Beginn der Wanderung sind.
   Hinweis: Bei 25 ° C, 10 Stunden vor dem entspricht wandert im allgemeinen 72 bis 96 Stunden nach dem Schlüpfen. Die Exact Höhe der Inkubationszeit sollte bis zum Beginn der Wanderung (wandernde Larven bewegen sich aus der Nahrung auf den Seiten und der Deckel des Lebensmittels für jeden Stamm und die Aufzeichnung der Anzahl der Stunden durch das Sammeln eine erste Reihe von Larven vor dem Start des Experiments bestimmt werden Platten).
   Hinweis: Bei Bedarf können die gleichen Eltern für drei Larven zu sammeln verwendet werden - 4 Tage Prüfung durch die Schritte 4,7-5,5 wiederholen. Ändern Sie die Reihenfolge, in der Stämme werden aufgebaut und getestet über Tage einen Test, um Auswirkungen auf die Weglänge zu vermeiden. Testen Sie die gleiche "Kontrolle" Stamm / Stämme jeden Testtag für Tag Effekte zu steuern.
7. Wenn viele Stämme getestet, taumeln die Einrichtung und Abholzeiten der Larven für die Prüfung von jedem Stamm an der entsprechenden Zeitpunkt später zu ermöglichen.

6. Larval Pfad-Länge-Test

1. Man löst trocken aktive Bäckerhefe in Wasser bei einem Verhältnis 1: 2 (Gewicht zu Volumen). Die fertige Hefe Paste sollte dünner als pancake Teig, in einer Weise, dass, wenn aus der Paste einen Löffel Anheben tropft es und hinterlässt Bänder auf der Oberfläche der Paste, die sich schnell zu schmelzen.
   Anmerkung: Die Konsistenz der Hefepaste ist wichtig und sollte während des gesamten Experiments konstant sein. Die genaue Hefe-Wasser-Verhältnis haben könnte je nach Marke und Charge von Hefe angepasst werden.
2. Pick vorsichtig Larven des ersten Stammes aus der Nahrungsmittelplatte getestet werden mit einem Pinsel.
3. Sammeln Larven in einer Petrischale und vorsichtig waschen mit Wasser alle Lebensmittel zu entfernen.
   1. Schnell waschen Larven mit 1 bis 2 ml Wasser und sanft abtupfen Larven trocken mit einem Labor wischen Sie Wasser zu vermeiden, wenn die Übertragung auf der Testplatte die Larven platzieren. Um Stress zu vermeiden, halten Larven feucht, aber nicht in Wasser eingetaucht.
4. Ordnen Sie drei Testplatten nebeneinander und legen Sie einen 5 Minuten-Timer für jede Testplatte.
5. Tragen Sie Hefe-Paste an die Spitze der Testplatten und mit dem Spreizer, verteilt eine dünne Laiener der Hefepaste auf jeder Testplatte, so dass alle Vertiefungen haben eine gleichmäßige Schicht von Hefe.
6. Sanft legen Sie eine Larve in der Mitte jeder Vertiefung, die 5 min Timer Start nach auf jeder Platte die ersten Larven platzieren. Hinweis: Drei Platten kann zu einem Zeitpunkt erfolgen, eine Stichprobengröße von 30 / Stamm / Testtag wodurch man bis zu insgesamt 500 Larven.
7. Legen Sie eine Petrischale Deckel auf der Oberseite jeder Vertiefung.
8. Wenn die Zeit abgelaufen ist, ohne dass die Larven von der Platte zu entfernen, starten Sie die Weglängen links hinten in der Hefe Tracing einen permanenten Marker. Trace Weglängen in der gleichen Reihenfolge wie Larven wurden auf den Testplatten angeordnet.
   1. Führen mit der gleichen Geschwindigkeit wie Verfolgungs Larven auf die Platten gelegt wurden. Aus Gründen der Einheitlichkeit in späteren Datenanalyse, verwenden die gleiche Markierung für alle Weglängen. Permanent Marker wird empfohlen.
9. Wiederholen Sie die Schritte 6.2 bis 6.8.1 für jeden Stamm getestet werden. Wählen Sie jeden Stamm aus der Nahrung, unmittelbar vor der Prüfung Verhungern Auswirkungen auf pa zu vermeidenth-Länge.

7. Lebensmittel Deprivation

1. Wenn Larven Larven werden Lebensmittel vor der Prüfung entzogen, sammeln wie in den Schritten von 6,2 bis 6,3, aber die gewünschte Menge an Zeit , Nahrungsentzug früher (z. B. wenn Larven werden Lebensmittel für 4 Stunden beraubt, sammeln Larven 4 Stunden vor Testzeit).
2. Teilen Sie gewaschen Larven in zwei Gruppen und legen Sie die Nahrung entzogen Gruppe in einem 60 x 15 mm Petrischale mit 5 ml 1% Agar und der Kontrollgruppe in einer Petrischale mit 5 ml Standard-Nahrung.
3. Legen Sie ein Gewicht auf dem umgekehrten Deckel der Petrischalen (sonst Larven sind in der Lage zu kriechen, wenn der Suche nach Nahrung).
4. Inkubieren für die zuvor ermittelten Nahrungsentzug Zeit und fahren Sie mit der Prüfung wie in den Schritten von 6,2 bis 6,9 beschrieben.
5. Wenn viele Stämme zu testen sind, taumeln die Entziehung Nahrung Startzeiten für die Prüfung jedes Stammes an der entsprechenden Zeitpunkt zu ermöglichen.

8. Datenanalyse

Anmerkung: Dieser Abschnitt beschreibt ein Verfahren für die Datenanalyse unter Verwendung ImageJ ⁷ oder Fiji ⁸ zur Verarbeitung von Weglängen, obwohl andere Software verwendet werden kann.

1. Verwenden Sie eine leichte Tabelle, die alle verfolgt Weglängen von den Petrischale Deckel auf weißes Papier zu übertragen (Deckel kann mit Ethanol und erneut verwendet werden zur weiteren Weg-Längen-Aufzeichnung gewaschen werden).
2. Trace eine 50 mm gerade Referenzlinie auf einem der Blätter Papier.
3. Scannen Sie die Weglängen bei einer Auflösung von 300 dpi und speichern als Bitmap oder TIFF-Bilddateien.
4. Öffnen Sie die Image-Datei, wählen Sie das Register "Entwickeln"> "Binary"> "Make binär". Dann unter "Prozess", wählen Sie "Binary"> "Skelettierung". Dies erzeugt eine eine Pixelbreite Linie, unabhängig von Dicke der Spur.
5. Stellen Sie sicher, jeder Pfad-Länge erscheint als eine kontinuierliche einzelne Zeile ohne Crossover.
6. Trennen Sie alle Kreuzungen der "Straight li mitne Werkzeug Wand "(Tracing) Werkzeug" und Färben der Linie weiß (die Kontinuität des Weges mit dem überprüft werden ", sollte der gesamte Pfad gelb markiert werden (Abb. 2).
7. Wählen Sie die "Analyse" tab> Set Messungen und wählen Sie "Perimeter" und "Display Label".
8. Wählen Sie die "Analyse"> Registerkarte "Set Skala" und wählen Sie "Kalk-".
9. Auf dem Bild, wählen Sie nur die Referenzlinie, wählen Sie die "Analyse"> Registerkarte "Analyse Partikel" und wählen Sie "Show: Outlines", "Ergebnis anzeigen" und "Clear Ergebnistabelle". Hinweis: Die Ausgabe der Anzahl von Pixeln zeigen, wird die Linie 50 mm Skala entspricht.
10. Wählen Sie "Analyse"> Registerkarte "Set Maßstab" und in die Pixelzahl in "Abstand in Pixeln" und dem entsprechenden Abstand (50 mm) in "bekannten Abstand" zu füllen.
11. Schließlich wählen Sie alle Pfadlängen Zeichnungen eines Genotyps einta Zeit, wählen Sie die "Analyse"> Registerkarte "Analyse Partikel" und wählen Sie "Show: Umrisse", "Ergebnis anzeigen" und "Tabelle löschen Ergebnisse".
    1. Entfernen Sie alle schriftlichen Etiketten oder offensichtliche Fremd Markierungen (sie werden als Pfadlängen erkannt werden) innerhalb des ausgewählten Bereichs durch den Bereich auswählen und weiß zu füllen.
12. Eine Sichtprüfung des "Outlines" Ausgabedatei die Umfänge wurden korrekt ermittelt zu gewährleisten. Der Ausgang wird für jeden Pfad Länge Zeichnung in der Auswahl einen Pfad-Länge in mm zeigen. Dies kann leicht mit einer beliebigen Statistik-Software in eine Kalkulationstabelle und analysiert exportiert werden.

Ergebnisse

Unterschiede in der Pfadlänge des Rover und Sitter für die Stämme und die Wirkung von Nahrungsentzug auf dem Weg Länge sind in Fig. . 3 gesammelten Daten über drei aufeinander folgenden Testtagen zeigten eine signifikante Belastung Effekt (F _(1,421) = 351,89, p <2,20 x 10 ^-16; Fig . 3A), mit Rovern reisen weiter als Sitter. Zusätzlich zu der Verspannungseffekt gab es auch eine signifikan...

Diskussion

Die Pfadlänge Test hier skizzierte bietet eine robuste und einfache Maßnahme der Nahrungssuchverhalten von Drosophila - Larven. Das Protokoll folgt der allgemeinen Methodik in Sokolowski ² beschrieben, jedoch wurde in Bezug auf Effizienz und experimentelle Kontrollen da verbessert. Nach bestem Wissen ist diese Methode die einzige verfügbare Methode zur Larven Pfad-Länge. Die ursprüngliche Version des Pfadlänge Protokoll ^{2, 3, 15, 16} getestet Larven auf Petrischalen mit einer dünnen Schicht...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
6 Unzen; Flaschen für Fliegenkultur	Fisher Wissenschaftlich	AS355
Fliegenfläschchen Stopfen	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 mm Petrischalen	Falcon	351008
100 x 15 mm Petrischalen	Fisher	875712
60 x 15 mm Petrischalen	VWR	25384-168
Sonden zum Präparieren	Almedic	2325-58-5300
	Hefe Lab Scientific	FLY-8040-20F