Abstract
Bei der Entwicklung von neuen vasoaktiven Mitteln, arterielle Blutdrucküberwachung von entscheidender Bedeutung für die Wirksamkeit der vorgeschlagenen neuen Medikamenten zu bewerten. Tatsächlich Forschung auf die Entdeckung neuer potentielle therapeutische Targets konzentriert genetisch veränderte Mäuse verwendet, erfordert eine zuverlässige, langfristige Beurteilung der systemischen arteriellen Druckschwankung. Derzeit ist der Goldstandard Langzeitmessungen des Blutdrucks in der ambulanten Mäuse verwendet implantierbare Radiosender für den Erhalt, die Arterie Kanülierung erfordern. Diese Technik eliminiert die Notwendigkeit für Tethering, Bändigen, oder die Tiere zu betäuben, die Stress und Artefakte während der Datensampling einzuführen. Jedoch kann arterielle Blutdruckmessung in Mäusen über Katheterisierung ziemlich schwierig sein, aufgrund der geringen Größe der Arterien. Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, die entscheidenden Schlüsselstellen für eine erfolgreiche subkutane Implantation von Radiosendern und Arteria carotis c illustrierenAnellierung in Mäusen. Wir sind auch Beispiele für Langzeit-Blutdruckaktivität von sich frei bewegenden Mäusen entnommen nach einer Zeit der postoperative Genesung. Im Anschluss an dieses Verfahren ermöglicht zuverlässige direkten Blutdruckaufzeichnungen von mehreren Tieren gleichzeitig.
Introduction
Bluthochdruck ist einer der wichtigsten Risikofaktoren für Herz - Kreislauf - Erkrankungen, wohl ist es ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit sowohl in Industrie- und Entwicklungsländern 1. Mehreren Tiermodellen experimenteller Hypertonie wurden beim Menschen 2 hypertensiven Reaktionen wie die beobachtet nachzuahmen entwickelt. Unter anderem stellt die ambulante Maus ein hervorragendes Modell , um die Entstehung und das Fortschreiten der Hypertonie zu untersuchen ermöglicht in vivo Analyse der Folgen einer chronischen Exposition bei Hypertonie.
Der Blutdruck (BP) Überwachung bei Mäusen hat Forscher dazu beigetragen , verschiedene Mechanismen in der Physiologie und Pathophysiologie von Erkrankungen wie Bluthochdruck und Herzinsuffizienz 3, 4 beteiligt zu entwirren. Tatsächlich Manipulation der Maus - Genom erlaubt Erzeugung transgener oder Gen-Targeting geeignete Modelle für das Studium Hypertension 5, 6. Aber auch sanfte Manipulationbewußter Mäusen induziert Aufregungen , die möglicherweise Artefakte während der Datenerfassung einführen kann, während die Verwendung von Sedierung oder tief Tranquilizer Blutdruck 7 beeinflussen. Diese Aspekte sind besonders wichtig und muss in Betracht gezogen werden, wenn langfristige BP Überwachung versuchen.
Es gibt mehrere Möglichkeiten BP in Mäusen zu erfassen, und ein Vergleich zwischen den gebräuchlichsten Techniken , die derzeit verfügbar diskutiert wurde an anderer Stelle 8, 9. Allerdings schlossen die AHA Empfehlungen für BP - Messung , dass die intraarterielle Messung von BP werden in der Regel wegen ihrer Fähigkeit bevorzugt direkt BP über einen längeren Zeitraum 10 messen. Radio-Telemetrie gekoppelt mit der direkten Messung des arteriellen Drucks ist die State-of-the-art Verfahren zur Überwachung physiologischer Funktionen in wach und frei Labortiere zu bewegen , während Stress zu minimieren und umweltassoziierten Artefakte 9, 11.Radio-Telemetrie bietet die Möglichkeit, automatisch Blutdruck, Herzfrequenz, Körpertemperatur und Tieraktivität von mehreren wachen Tieren sammeln.
Obwohl diese Methode ist in vielen Labors immer sehr beliebt, Radio-Telemetrie-Implantation in Mäuse können technisch anspruchsvoll sein. Hier zeigen wir einen Schritt-für-Schritt-Protokoll, das zeigt, wie ein Druckwandler in Mäusen zu implantieren. Die Technik beinhaltet subkutane Einführen der Sonde in dem Mausgehäuse, kanalisieren, um den Katheter an den Hals und nach vorne in der Nähe des Aortenbogens über die linke Arteria carotis. Remotely erfassten Daten werden live auf dem Computer-Monitor angezeigt. Die Daten werden auch für "off-line" Analyse gespeichert.
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Protocol
Ethik-Anweisung: Alle Tier Verfahren in diesem Video-Artikel erwähnt wurden überprüft und von der Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Tennessee Health Science Center genehmigt.
Hinweis: Verwenden Sie sterile Mikro Instrumente während des chirurgischen Eingriffs. Chirurgische Instrumente sterilisiert werden können, einen Infrarot-Sterilisator in einem optimalen Sterilisationstemperatur von 1.500 ° F (815,6 ° C) verwendet. Entfernungsmesser kann wiederverwendet werden, jedoch, bevor es in das Tier sicher Einführen des gesamten Senders gemäß der Anweisungen des Herstellers, und dass die Spitze des Katheters mit einem speziellen Gel wurde vom Hersteller bereitgestellt nachgefüllt zu sterilisieren.
1. Versuchstiere
- Erhalten Sie IACUC Genehmigung für alle Experimente, die durchgeführt werden soll. Beratung bei institutionellen IACUC ist stark in Bezug auf Anforderungen empfohlen für die postoperative Analgesie nach diesem Verfahren.
- Halten Sie die Tiere in clima kontrollierter Räume eine Umgebungstemperatur von 21 ° C, 60% relative Luftfeuchtigkeit, und eine 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser.
Anmerkung: Da die Mauskörper den Telemetriesonde aufzunehmen hat (annähernd 1 cm Durchmesser x 2 cm lang), es bevorzugt ist, Mäuse zu verwenden, die 20 g oder mehr wiegen.
2. Anästhesie und Operative Vorbereitung
- Wiegen Sie die Maus, um eine Präzisionswaage mit und notieren Sie sein Gewicht. Achten Sie darauf, das Tier sanft und leise zu behandeln.
- Legen Sie das Tier in die Induktionskammer und schließen Sie es. Eingestellt Sauerstoffdurchflussrate von 0,5 L / min und eingestellt Isofluran-Konzentration bei 4 bis 5%.
- Wenn die Maus das Bewusstsein verliert, legen Sie es auf eine Körperwärmeplatte bei 36 gehalten - 37 ° C. Pflegen Sie die Anästhesie über nosecone mit Isofluran-Set mit 2% (halten Durchfluss bei 0,5 l / min).
- Bereiten Sie die Betriebsbereiche durch das Haar von der Rückseite des Halses zu entfernen und ter ventralen Seite des Halses durch Enthaarungscreme Anwendung.
- Behandeln Sie die Inzisionsstelle mit 3-Anwendungen von chirurgischen Peeling (Betadin-Lösung) im Wechsel mit 70% Isopropylalkohol.
3. Chirurgie
- Platzieren Sie die Maus in Rückenlage. Prüfen Sie, ob Reflexe durch den Fuß Kneifen und Anästhesie anpassen, bis es keine Antwort gibt. Bilden eine in etwa 1 cm-Mittelschnitt unter dem Hals der Maus mit einem Skalpell. In der linken Seite des Schnitts einen subkutanen Raum schaffen, indem Sie vorsichtig die Haut von dem darunterliegenden Bindegewebe trennt.
- Drehen Sie die Maus, und verwenden Sie ein Skalpell, um einen Hautschnitt von ca. 1,5 cm in der dorsalen linken Seite hinter dem Schulterblatt. Erstellen Sie eine subkutane Tasche entlang der Flanke des Tieres groß genug, um das Gerät aufzunehmen. Stecken Sie den Sender in die Tasche.
- Legen Sie eine kleine hemostat Klemme in den Rücken Einschnitt und manövrieren sie subkutan in Richtung der vorderenHalsöffnung. Mit dem eingefügten hemostat Klemme, greifen Sie sanft ein ungiftiges Polyethylenrohr (4 cm Länge x 1 mm ID).
- Ziehen Sie den hemostat zurück durch den Tunnel aus dem lateralen Einschnitt in den Rücken, bis der Schlauch von beiden Bauch- und Dorsalschnitt ragt, lassen Sie den Schlauch vom hemostat. Von der Rückseite, legen Sie die Katheter-Sensor in das Rohr Tunnel die Spitze des Drucksensorkatheter durch den Hals. Vom Hals vorderen, ziehen und den Polyethylenschlauch entfernen und den Dorsalschnitt mit Metallklammern schließen.
- Trennen Sie sorgfältig die Mandibeldrüsen mit sterilen Spitze Applikatoren Baumwolle und Einfahren der linken Kieferdrüse einen elastischen Aufenthalt Haken verwenden. Mit feinen bestückte gebogenen Pinzette, suchen Sie die Arteria carotis auf der linken Seite der Trachea. Halten Sie die Operationsstelle steril, indem und eine sterile Abdeckung zu sichern.
- Sorgfältig isolieren, das Schiff aus dem umgebenden Gewebe und trennen sanft dieVagusnerv (weißlich), die entlang der A. carotis von der Arterie entfernt ist. Achten Sie darauf, nicht zu schneiden oder die Nerven oder die Arterie beschädigt werden.
- Führen Sie drei Stücke von nicht resorbierbaren 7-0 Naht unterhalb der isolierten Arteria carotis Abschnitt. Binden Sie die Schädelnaht zu verschließen Blutfluss. Ziehen Sie die Naht, die am nächsten an der Brustbeins ist, um vorübergehend den Blutfluss aus der Aorta zu verschließen.
- Machen Sie einen lockeren Knoten in der Mitte Naht verwendet wird. Dies wird verwendet, um den Katheter in dem Gefäß zu befestigen. Schneiden Sie einen kleinen Einschnitt in die Arterie zwischen der Schädel und den sternal Nähte mit Mikro-Schere.
- Ergreifen Sie den Katheter mit Spezialschiff Kanülierung Zange, wobei darauf geachtet, den Katheter nicht zu quetschen Gel Verlust von der Sonde zu verhindern. Sanft mit einer feinen Spitze gebogenen Pinzette Pinzette die Arterie greifen, um den Katheter abzurufen und es in dem Gefäß durch den kleinen Einschnitt ein.
- Ziehen Sie die mittlere Nahtknoten um die Arterie und sanft die Katze voranheter. Vorsichtig lassen Sie die Naht, die mit dem Brustbein proximal und weiterhin den Katheter in Richtung der Quer Aorta zu fördern.
- Beachten Sie die Markierung auf dem Katheter, der eine ungefähre Index gibt, wie weit der Katheter eingeführt werden soll. Sobald der Punkt erreicht ist, sanft ziehen sowohl die untere und die obere Naht um den Katheter. Der Katheter wird in die Arteria carotis durch Naht Knoten gesichert.
- Schließen Sie den Hautschnitt mit nicht resorbierbaren 5-0 Naht. Einmal geschlossen, dichten den Einschnitt mit Gewebekleber.
4. Chirurgische Erholung und BP-Messungen
- Monitor-Tier eng für die Rückkehr der normalen Körperhaltungen und Verhaltensweisen. Während der 24 Stunden nach der Operation Zeitraum verabreichen Analgesie, wie durch einen Mitarbeiter Tierarzt gerichtet.
- Sobald die Tiere erholt haben (5 bis 7 Tage nach der Operation), Das Haus sie einzeln in einem regelmäßigen Käfig Maus auf der Oberseite des Telemetrie-Empfänger Platte gelegt.
- Drehen Sie den implantierten transmitters "on" und "off" durch eine Magnetvorrichtung kurz nahe Verwendung von der Außenseite des Käfigs zu dem Tier positioniert ist.
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Representative Results
Die Daten können von einem Empfänger erfasst remote; Spuren werden auf einem Computer - Bildschirm für die Qualitätskontrolle (Abbildung 1a) sichtbar gemacht . Details wie Tier ID, der diastolische Blutdruck und der systolische Blutdruck werden auch (1b) gezeigt ist . Arterial BP kontinuierlich (24/7) aufgenommen werden können, oder für kurze programmierten Intervallen (dh 60 sec Akquisitions jede Stunde). Daten können automatisch auf einer Festplatte für eine spätere Analyse gespeichert werden. Gemittelte BP - Daten von einem 3-tägigen Daueraufzeichnung gezeigt werden (Abbildung 2) ist es möglich , den zirkadianen Rhythmus Variation zwischen dunklen und hellen Zyklus zu schätzen wissen. Durchschnitt der Druckänderung und die Herzfrequenz wurden berechnet und gegen die Zeit aufgetragen.
Abbildung 1. Typische Blutdruck Tracings von 4 verschiedenen mit telemetrischer Gerät implantierte Mäuse. (A) Tracings zeigt Echtzeit-arteriellen Blutdruckänderungen (mmHg) über einen 5 Minuten-Intervall. Daten werden 5 Tage nach der Implantation gleichzeitig von vier verschiedenen erwachsenen Mäuse erworben. (B) bei höheren zeitlichen Auflösung von A extrahiert Tracing ist es möglich , den Blutdruck diastolischen und systolischen Werte, BP Zyklusdauer und Herzfrequenz zu schätzen wissen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Langzeit - arterieller Blutdruck Zeigt Circadian Rhythm Variation. Gemittelt Druckdaten zeigen die Werte für (A) systolische Druck (SP), (B) diastolische Druck (DP), (C) des mittleren arteriellen Druck (MAP), und (D) Herz rate ausgedrückt in Schlägen / min. Die Daten wurden von Daueraufzeichnungen extrahiert während des Tages eingenommen (Licht-Zyklus, L) oder in der Nacht (Dunkel-Zyklus, D). Die Aufnahme gestartet 7 Tage nach der Operation. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM (n = 4 Mäuse) ausgedrückt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Implantierbare Radio-Telemetrie hat sich in den letzten zehn Jahren verbessert; kleinere Sondengröße macht weniger das Implantat traumatische für das Tier, verlängert die Lebensdauer der Batterie hilft, die Kosten und unabhängige Entfernungsmesser Frequenzen beseitigen Übersprechens zwischen den Empfängern zu reduzieren. Telemetrie wird der state-of-the-art - Verfahren betrachtet zum Sammeln einer Vielzahl von physiologischen Parametern von frei Tiere ohne die Artefakte , die mit der Verwendung von Rückhalte, menschliche Interaktion oder Anästhesie bewegt , die 8,9 durch andere Techniken erforderlich sind.
Allerdings sind einige der Nachteile seiner Technik mit den Anschaffungskosten des Instruments und Software verbunden sind. Die Sender sind zerbrechlich und anfällig für Beschädigungen, und die Batterie schließlich aus Energiemangel und müssen ersetzt werden. Obwohl das Unternehmen diese beschädigte Sonden zu geringeren Kosten zu sanieren bietet, können die Kosten für einige Labors noch unerschwinglich.Darüber hinaus kann dieses Verfahren technisch anspruchsvoll sein und Praxis erforderlich ist zuverlässig BP Messung zu erreichen. Schließlich gibt es einige postoperative Mortalität verbunden, die in unseren Händen etwa 5%. Dies kann dramatisch zunehmen, wenn eine bestimmte Behandlung getestet werden muss oder wenn eine genetische Manipulation kompromittiert die Maus Gesundheit.
Die folgenden kritischen Faktoren sind wesentlich für die erfolgreiche Durchführung des Verfahrens: Gewebehydratation mit steriler Kochsalzlösung während des gesamten Verfahrens beibehalten. Fassen Sie den Sender mit großer Sorgfalt; vermeiden, ist es durch den Drucksensor hält, wie dies das Gel verursachen kann der Sender austreten oder zu beschädigen. Beim Einführen des Katheters, binden die zentrale Naht mit einem doppelten Knoten, als Versagen, dies zu tun in den Katheter führen wird, das Schiff zu verlassen. Die erforderliche Länge des Katheters, die in der Carotis eingeführt werden muss, kann nach dem Mausstamm und das Gewicht in diesem insbeson verwendet verändernlar Studie. Daher ist es sehr empfehlenswert, einige vorläufige Experiment ausgeführt, um zu bestimmen, wie tief der Katheter eingeführt werden muss Okklusion der Aorta zu vermeiden. Schließlich überwacht das Tier täglich und stellen Sie sicher, dass die Haut über dem Sender nicht gedehnt oder nekrotischen. Wenn erweiterte Nekrose oder Infektion auftritt, einschläfern die Tiere nach dem institutionellen Politik.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
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