Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

Summary

Das Einbringen mehrerer genomischer Veränderungen in Cyanobakterien ist ein wesentliches Werkzeug bei der Entwicklung von Stämmen für industrielle und Grundlagenforschungszwecke. Wir beschreiben ein System zur Generierung unmarkierter Mutanten in der Modell-Cyanobakterienspezies Synechocystis sp. PCC6803 und markierten Mutanten in Synechococcus sp. PCC7002.

Abstract

Cyanobakterien sind ökologisch wichtige Organismen und potentielle Plattformen für die Herstellung von Biokraftstoffen und nützlichen Industrieprodukten. Die genetische Manipulation von Cyanobakterien, insbesondere von Modellorganismen wie Synechocystis sp. PCC6803 und Synechococcus sp. PCC7002, ist ein wichtiges Instrument sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die angewandte Forschung. Die Erzeugung von unmarkierten Mutanten, bei denen chromosomale Veränderungen durch Einfügen einer Antibiotikaresistenzkassette (ein manipulierbares DNA-Fragment, das ein oder mehrere Gene enthält) in einen Stamm eingebracht werden, gefolgt von der anschließenden Entfernung dieser Kassette unter Verwendung eines negativen selektierbaren Markers, ist eine besonders leistungsfähige Technik. Unmarkierte Mutanten können wiederholt genetisch manipuliert werden, so dass beliebig viele Veränderungen in einen Stamm eingebracht werden können. Darüber hinaus ist das Fehlen von Genen, die für Antibiotikaresistenzproteine kodieren, in dem mutierten Stamm wünschenswert, da dadurch die Möglichkeit eines "Entweichens" von antibiotikaresistenten Organismen in die Umwelt vermieden wird. Detaillierte Methoden für wiederholte Runden der genetischen Manipulation von Cyanobakterien sind jedoch in der wissenschaftlichen Literatur nicht gut beschrieben. Hier geben wir eine umfassende Beschreibung dieser Technik, die wir erfolgreich zur Generierung von Mutanten mit multiplen Deletionen, Einzelpunktmutationen innerhalb eines interessierenden Gens und der Insertion neuartiger Genkassetten eingesetzt haben.

Introduction

Cyanobakterien sind eine evolutionär alten und unterschiedlichen Stamm der Bakterien in fast allen natürlichen Umwelt auf der Erde gefunden. In marinen Ökosystemen sind sie besonders reichlich vorhanden und spielen eine Schlüsselrolle in vielen Nährstoffkreisläufe spielen, für etwa die Hälfte der Kohlenstoff - Fixierung entfallen ^1, die Mehrheit der Stickstofffixierung ² und Hunderte von Millionen von Tonnen an Kohlenwasserstoffproduktion ³ in den Ozeanen jährlich. Chloroplasten, die Organell verantwortlich für die Photosynthese in eukaryotischen Algen und Pflanzen, sind wahrscheinlich von einem Cyanobakterium entwickelt zu haben , di....

Protocol

1. Herstellung von Kulturmedien

1. Bereiten Sie BG11 Medium nach Castenholz, 1988 ^17.
   1. Stocklösungen von 100x BG11, Spurenelemente und Eisen Lager (Tabelle 1).
   2. Bereiten Sie separate Lösungen von Phosphat Lager, Na ₂ CO ₃ Lager, N - [Tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethansulfonsäure (TES) Puffer und NaHCO ₃ (Tabelle 1).
   3. Autoklave mit Phosphat und Na ₂ CO ₃ Aktien. Filter-sterilisieren TES - Puffer und NaHCO ₃ mit 0,2 & mgr; m - Filter.
   4. Bereiten Sie BG11 durch die Kombination von 976 ml Wasser, 10 ml 1....

Results

Plasmid - Design ist entscheidend für die erfolgreiche Erzeugung der beiden markierten und nicht markierten Mutanten. Figur 1 gibt ein Beispiel von Plasmid A und B verwendet , um eine Deletionsmutante in den Synechocystis Gene ¹³ cpcC1 und cpcC2 zu erzeugen. In jedem Fall sind die 5 'und 3' flankierenden Regionen sind etwa 900-1.000 bp. Reduzierte flankierenden Regionen können verwendet werden, obwohl das kleinste wir erfolgreich erp.......

Discussion

Die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von nicht markierten Mutanten sind: 1) vorsichtig Plasmid-Design, um sicherzustellen, nur die Zielregion verändert wird; 2) sicherzustellen, dass die Proben bleiben axenic, vor allem, wenn die Kultur auf Saccharose; 3) plating Zellen für markierte Mutante Generation zunächst auf Agarplatten BG11 transformiert Antibiotika, gefolgt von der Zugabe von Agar und Antibiotika 24 Stunden später fehlen; 4) markierte Kultivierung Mutanten für 4 volle Tage vor auf BG11 und Saccharose-Agar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaNO3	Sigma	S5506
MgSO4.7H2O	Sigma	230391
CaCl2	Sigma	C1016
Zitronensäure	Sigma	C0759
Na2EDTA	Fisher	EDT002
H3BO3	Sigma	339067
MnCl2.4H2O	Sigma	M3634
ZnSO4.7H2O	Sigma	Z4750
Na2MoO4.2H2O	Sigma	331058
CuSO4.5H2O	Sigma	209198
Co(NO3)2.6H2O	Sigma	239267
Eisenammoniumcitrat	Sigma	F5879
K2HPO4	Sigma	P3786
Na2CO3	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO3	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cyanocobalamin	Sigma	47869
Na2S2O3	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Saccharose	Fisher	SUC001
Petrischale 90 mm dreifach belüftet	Greiner	633185
0,2 µ m filters	Sartorius	16534
100 ml Konuskolben	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38  m	Bemis	FIL003
Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
DNA-Aufreinigungskit	MoBio	12100-300
Restriktionsendonukleasen	NEB
T4 Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Luria Bertani Bouillon	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Kanamycin	sulfat Sigma	60615
Ampicillin	Sigma	A9518
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0503
14 ml Rundbodenröhrchen	BD Falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7805
425-600 µ m Glasperlen	Sigma	G8772
Glycerol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Leuchtstofflampen	Gro-Lux	69
HT Multitron Photobioreaktor	Infors