Anhaltende Fibrose mit Ablagerung von übermäßigen extrazellulären Matrixproteinen führt zu Zirrhose. Alkoholmissbrauch ist eine der Hauptursachen für schwere Lebererkrankungen. Wir haben ein Ethanol-induziertes Zebrafisch-Modell für fibrotische Lebern etabliert, um die Mechanismen und Strategien zur Förderung der Hepatozytenregeneration nach alkoholinduzierten Verletzungen zu untersuchen.
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Methodenartikel
Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Anhaltende Leberfibrose mit Fortsetzung des Proteinaufbaus in der extrazellulären Matrix (ECM) führt zum Verlust der zellulären Kompetenz der Leber, was zu einer Zirrhose mit hepatozellulärer Dysfunktion führt. Neben mehreren Leberschäden kann Alkoholmissbrauch zu erheblichen gesundheitlichen Problemen wie Leberversagen und hepatozellulärem Karzinom führen. Nichtsdestotrotz wurde die Identität endogener zellulärer Quellen, die Hepatozyten als Reaktion auf Alkohol regenerieren, nicht richtig untersucht. Darüber hinaus haben nur wenige Studien die Regeneration von Hepatozyten bei alkoholinduzierten Verletzungen effektiv modelliert. Wir haben kürzlich über die Etablierung eines Ethanol (EtOH)-induzierten fibrotischen Lebermodells im Zebrafisch berichtet, in dem hepatische Vorläuferzellen (HPCs) bei nahezu vollständigem Hepatozytenverlust in Gegenwart eines fibrogenen Stimulus Hepatozyten hervorbrachten. Darüber hinaus haben wir durch chemische Screenings mit diesem Modell mehrere kleine Moleküle identifiziert, die die Regeneration von Hepatozyten verbessern. Hier beschreiben wir ausführlich die Vorgehensweisen zur Entwicklung eines EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodells und zur Durchführung chemischer Screenings mit diesem Modell im Zebrafisch. Dieses Protokoll wird ein wichtiges Instrument sein, um die molekularen und zellulären Mechanismen der Regeneration von Hepatozyten in der fibrotischen Leber zu beschreiben. Darüber hinaus werden diese Methoden die potenzielle Entdeckung neuartiger therapeutischer Strategien für chronische Lebererkrankungen in vivo erleichtern.
Einleitung
Trotz der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit von Hepatozyten 1, die die Haupt Parenchymzelle Typ der Leber sind, beeinträchtigt chronischem Leberversagen diese Fähigkeit, die zu Lebervorläuferzellen (HPC) -abhängigen Regeneration 2.
Chronische Leberschäden wird hauptsächlich durch Alkoholmissbrauch, chronische Hepatitis - C - Virus (HCV) -Infektion 3 und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) 4 abgeleitet. Es führt zu einer nachhaltigen Leberfibrose, die mit der Akkumulation von extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen assoziiert ist. Persistierende ECM Akkumulation verzerrt intakte Le....
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Protokoll
Zebrabärblinge wurden angehoben und unter Verwendung eines Standardprotokolls gezüchtet, die die Kriterien der National Institutes of Health erfüllt und vom Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Herstellung der Lösungen
- Es werden 20 L Ei Wasser (austauschbar mit "Embryo Medium" verwendet) embryonale / Larven Zebrabärbling zu halten. Man löst 1,5 g CaSO 4 und 6 g Instant Ocean Meersalz in 250 ml destilliertem Wasser. Gießen Sie in einen Kanister mit 20 l destilliertem Wasser gefüllt und agitieren.
- Bereiten Sie 1 L 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) Stammlösung (20x). Man löst 0,6 g....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die Entwicklung einer EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodell in Larven Zebrabärbling. Um ein Protokoll zur Belichtung Zebrabärbling Larven EtOH optimieren wir zunächst EtOH Toxizität beurteilt. 2,5 Tage post-Fertilisation (dpf) Larven wurden auf 1% EtOH-Konzentration ausgesetzt, 1,5% bzw. 2% für 24 Stunden durch eine gleichzeitige 24 hr EtOH / MTZ Behandlung. Exposition gegenüber 2% EtOH verursacht hohe Mortalität, während fast alle Larven auf 1% EtO.......
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Diskussion
Wir beobachteten HPC-vermittelte Hepatozyten Regeneration in den EtOH / MTZ-behandelten Rückgewinnung Lebern, was nahe legt, dass selbst in Gegenwart von erheblichen Menge an ECM-Proteinen, einschließlich fibrillärem Kollagen Typ I, die HPCs ihre Kompetenz behalten als Hepatozyten zu regenerieren. Die MTZ nur Behandlung nicht zu einer Erhöhung der Abscheidung von ECM - Proteine signifikant, während die EtOH nur Behandlung nicht HPC Aktivierung 15 induzieren. Durch die Nutzung der kombinierten EtOH / MTZ Beh.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus der GTEC (2731336 und 1411318), der NIH (K01DK081351) und der NSF (1.354.837) zu CHS unterstützt Wir Alem Giorgis für das kritische Lesen des Manuskripts danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Calciumsulfat-Halbhydrat (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesiumsulfat (MgSO4) | EMD MX0075 | ||
| 1,4-Piperazindiethansulfonsäure (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′ -Tetraessigsäure (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 |
| proof Formaldehyd | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazol (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-Aminobenzoesäureethylester (Tricain) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Tablette mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) | Amresco | E404 | Eine Tablette mit 100 ml destilliertem Wasser auflösen |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Rinderserumalbumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Niedrigschmelzend agarose | Amresco | BP165 | |
| Bibliothek für Stammzellsignalverbindungen | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM Lagerbestand in DMSO |
| ActiProbe-1K Bibliothek | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM Lagerbestand an DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Mit DMSO auflösen auf 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Mit DMSO auf 10 auflösen mM |
| Anti-Collagen I Antikörper | Abcam | ab23730 | Verwendung bei 1:100 zur Immunfärbung, reagiert mit Fischen |
| AlexaFluor 647 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) | Molekulare Sonden | A31573 | Verwendung bei 1:200 zur Immunfärbung |
| Einbettmedien (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petrischale | VWR | 25384-088 | |
| 24-well Platte | VWR | 10062-896 | |
| Pinzette | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Objektträger | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Deckglas | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Frischhaltefolie | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminiumfolie | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotom | Leica | VT1000 S | |
| Stereomikroskop | Leica | M80 | |
| Epifluoreszenzmikroskop | Leica | M205 FA | |
| Confocol Mikroskop | Zeiss | LSM700 |
Referenzen
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
