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Methodenartikel

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

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DOI:

10.3791/54002

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13. Mai 2016

 ,  , 
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Anhaltende Fibrose mit Ablagerung von übermäßigen extrazellulären Matrixproteinen führt zu Zirrhose. Alkoholmissbrauch ist eine der Hauptursachen für schwere Lebererkrankungen. Wir haben ein Ethanol-induziertes Zebrafisch-Modell für fibrotische Lebern etabliert, um die Mechanismen und Strategien zur Förderung der Hepatozytenregeneration nach alkoholinduzierten Verletzungen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Anhaltende Leberfibrose mit Fortsetzung des Proteinaufbaus in der extrazellulären Matrix (ECM) führt zum Verlust der zellulären Kompetenz der Leber, was zu einer Zirrhose mit hepatozellulärer Dysfunktion führt. Neben mehreren Leberschäden kann Alkoholmissbrauch zu erheblichen gesundheitlichen Problemen wie Leberversagen und hepatozellulärem Karzinom führen. Nichtsdestotrotz wurde die Identität endogener zellulärer Quellen, die Hepatozyten als Reaktion auf Alkohol regenerieren, nicht richtig untersucht. Darüber hinaus haben nur wenige Studien die Regeneration von Hepatozyten bei alkoholinduzierten Verletzungen effektiv modelliert. Wir haben kürzlich über die Etablierung eines Ethanol (EtOH)-induzierten fibrotischen Lebermodells im Zebrafisch berichtet, in dem hepatische Vorläuferzellen (HPCs) bei nahezu vollständigem Hepatozytenverlust in Gegenwart eines fibrogenen Stimulus Hepatozyten hervorbrachten. Darüber hinaus haben wir durch chemische Screenings mit diesem Modell mehrere kleine Moleküle identifiziert, die die Regeneration von Hepatozyten verbessern. Hier beschreiben wir ausführlich die Vorgehensweisen zur Entwicklung eines EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodells und zur Durchführung chemischer Screenings mit diesem Modell im Zebrafisch. Dieses Protokoll wird ein wichtiges Instrument sein, um die molekularen und zellulären Mechanismen der Regeneration von Hepatozyten in der fibrotischen Leber zu beschreiben. Darüber hinaus werden diese Methoden die potenzielle Entdeckung neuartiger therapeutischer Strategien für chronische Lebererkrankungen in vivo erleichtern.

Einleitung

Trotz der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit von Hepatozyten 1, die die Haupt Parenchymzelle Typ der Leber sind, beeinträchtigt chronischem Leberversagen diese Fähigkeit, die zu Lebervorläuferzellen (HPC) -abhängigen Regeneration 2.

Chronische Leberschäden wird hauptsächlich durch Alkoholmissbrauch, chronische Hepatitis - C - Virus (HCV) -Infektion 3 und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) 4 abgeleitet. Es führt zu einer nachhaltigen Leberfibrose, die mit der Akkumulation von extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen assoziiert ist. Persistierende ECM Akkumulation verzerrt intakte Leber Architektur durch ein faseriges Narbengewebe 5 bilden, anschließend in Zirrhose mit hoher Morbidität und Mortalität führt. Viele Versuche sind unternommen worden , um die fibrotische Reaktion zu mildern , die hauptsächlich durch die Konzentration auf die Hemmung profibrogenen Zytokine und aktiviert Myofibroblasten 6. Letztere wird in erster Linie, abgeleitet von hepatischen Sternzellen (HSCs) das Prinzip der Leber nicht parenchymalen Zellen verantwortlich für die Leber Narbenbildung 4. Dennoch regenerative Therapien, die endogenen zellulären Quellen, einschließlich HPCs stimulieren Hepatozyten in Gegenwart von anhaltender fibrogen Beleidigungen erwarten eine weitere Untersuchung zu regenerieren.

Viele experimentelle Modelle der Leberfibrose wurde in Säugetieren beschrieben. Repetitive Injektion von Kohlenstofftetrachlorid (CCl 4) wurde in großem Umfang verwendet , um Leberfibrose in Maus- und Rattenmodelle 7 induzieren. Wenn sie mit einem hohen Fett (HF) Diät kombiniert, führte Alkohol zu einer wesentlichen Heraufregulierung von profibrogenen Genexpression und Leberfibrose 8. Während Steatose (Fettansammlung) von einer akuten Alkoholexposition führt, macht es die Leber anfällig für mehr schwere Leberschädigung 9.

Der Zebrabärbling, Danio rerio, hat sich als eine unschätzbare wirbelModellSystem entstand Regeneration für das Studium. Obwohlanderen niederen Wirbeltiere wie Molche und Axolotl haben eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration, die Zebrabärbling hat Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen in Bezug auf die Genmanipulation und Visualisierungsstrategien benötigt Potenzial regenerativer 10 Faktoren zu manipulieren. Der Zebrafisch stellt auch ein attraktives Vertebraten Modell für die Untersuchung alkoholische Lebererkrankung (ALD) durch einfaches Hinzufügen von Ethanol (EtOH), um ihr Wasser. Akute EtOH Exposition gegenüber Larven und erwachsenen Zebrafisch verursacht Hepatosteatose 13.11. Bei Erwachsenen Zebrabärbling erweiterten EtOH Belichtung erhalten, Kollagenablagerung wurde mit upregulation der Fibrose im Zusammenhang mit Genen 14 beobachtet. Es besteht jedoch ein Bedarf für die Entwicklung Modelle Leberregeneration in Reaktion auf EtOH als fibrogene Stimulus zu studieren.

Vor kurzem haben wir eine EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodell in Zebrabärbling 15. Wir kombiniert, um eine Hepatozyten-spezifischen genetischen Ablationssystem mit EtOH Behandlung in Larven- und adult Zebrabärbling. Wir erzeugten zwei transgenen Linien, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 und Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, in denen E.coli Nitroreduktase (NTR) zu dem cyan fusioniert sind und mCherry fluoreszierendes Protein jeweils unter der Kontrolle der Hepatozyten-spezifischen Fettsäure - bindendes Protein 10a, Leber einfach (fabp10a) Promotor. In diesem System wandelt NTR eine nicht - toxische Prodrug Metronidazol (MTZ) in eine DNA Interstrang-Vernetzungsmittel 16, expliziter Tod von Hepatozyten zu induzieren. Mit diesem Modell haben wir gezeigt, dass eine Population von Leberzellen, die Signalisierungs Notch ansprechen, umgewandelt in Hepatozyten in naher Abwesenheit von Hepatozyten und im Überschuß von ECM. Wir bezeichneten diese Zellen als HPCs. Darüber hinaus wird durch chemische Bildschirme identifizierten wir kleine Molekül Aktivatoren der Wnt-Signal und Inhibitoren der Notch-Signalweg, die Hepatozyten-Regeneration in der fibrotischen Leber vermehren. Therefore, unser fibrotischen Lebermodell in Zebrabärbling stellt ein hervorragendes System chemisches Screening im Vergleich zu Zellkultur- oder Säugetier-basierte Screening-System. Es ist ein in vivo - System mit erheblichen Kosten- und zeitsparende Vorteile. Hier beschreiben wir die Einzelheiten der Verfahren zur Herstellung einer EtOH-induzierten Modell fibrotischen Leber und zur Durchführung chemischer Bildschirme unter Verwendung dieses Modells in Zebrabärbling. Darüber hinaus wurden der zeitliche Verlauf Analysen wie Hepatozyten Regeneration in der fibrotischen Leber auftritt, zu untersuchen durchgeführt. Dieses Protokoll wird ein unschätzbares Werkzeug zur Verfügung stellen, die Mechanismen und Strategien zur Verbesserung Hepatozyten Regeneration in der fibrotischen Leber zu studieren.

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Protokoll

Zebrabärblinge wurden angehoben und unter Verwendung eines Standardprotokolls gezüchtet, die die Kriterien der National Institutes of Health erfüllt und vom Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Herstellung der Lösungen

  1. Es werden 20 L Ei Wasser (austauschbar mit "Embryo Medium" verwendet) embryonale / Larven Zebrabärbling zu halten. Man löst 1,5 g CaSO 4 und 6 g Instant Ocean Meersalz in 250 ml destilliertem Wasser. Gießen Sie in einen Kanister mit 20 l destilliertem Wasser gefüllt und agitieren.
  2. Bereiten Sie 1 L 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) Stammlösung (20x). Man löst 0,6 g PTU Pulver in 1 l destilliertem Wasser. 1 ml der Stammlösung pro 20 ml Embryo Medium bis zu einer Endkonzentration von 0,003% als Arbeitslösung.
    ACHTUNG: PTU systemische Toxizität nach Inhalation oder dermale Exposition führen kann. Vorbereiten und in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang mit verwenden.
  3. Bereiten Sie 1 L Ethyl-3-aminobenzoate methansulfonat (Tricaine) Stammlösung (20x). Man löst 4 g Tricaine Pulver in destilliertem Wasser. PH-Wert auf 7 durch Zugabe von 1 M Tris-Puffer (pH 9) und bringe das Endvolumen auf 1 l mit destilliertem Wasser. Aliquot in 50 ml und bei -20 ° C. Tauen Sie vor dem Gebrauch.
    ACHTUNG: Tricaine kann einen Verlust der Empfindung hervorrufen. Vorbereiten und in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang mit verwenden.
  4. Bereiten Sie 100 ml Larven Metronidazol (MTZ) Arbeitslösung. Machen frischen 15 mM MTZ-Lösung durch Auflösen von 0,25 g MTZ-Pulver in 0,1% Dimethylsulfoxid (DMSO) in 100 ml embryo Medium. Man löst MTZ Pulver vollständig durch kräftiges Schütteln. Machen Sie frische MTZ-Lösung und Verwendung von Alufolie photokatalytischen Abbau von MTZ zu verhindern.
    ACHTUNG: MTZ kann zu Reizungen führen. Vorbereiten und in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang mit verwenden.
  5. Bereiten Sie 100 ml Larven Ethanol / Metronidazol (EtOH / MTZ) Arbeitslösung. Machen Sie frische MTZ-Lösung und nutzen Alufolie photokatalytischer de zu verhindernAbstufung der MTZ. 1,5 ml 100% Ethanol in 100 ml MTZ-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 1,5% unmittelbar vor der Verwendung.
  6. Bereiten Sie 500 ml Erwachsenen MTZ Arbeitslösung. Machen Sie frische 10 mM MTZ-Lösung durch Auflösen von 0,83 g MTZ Pulver in 0,1% DMSO in 500 ml Wasser-System. Man löst MTZ Pulver vollständig durch kräftiges Schütteln. Machen Sie frische MTZ-Lösung und Verwendung von Alufolie photokatalytischen Abbau von MTZ zu verhindern.
  7. Bereiten Sie 1 L PEM-Puffer. Man löst 30,2 g PIPES, 0,74 g EGTA und 0,12 g MgSO 4 in destilliertem Wasser. PH-Einstellung auf 7 mit NaOH. Bringen endgültige Volumen auf 1 Liter mit destilliertem Wasser.

2. Herstellung von Larval Zebrabärbling

  1. Richten Sie Paarung von [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 erwachsenen Zebrafisch mit Tg (hand2: EGFP) PD24 in Paarungs Tanks 13 erwachsenen Zebrafisch. Verwenden Teiler timed Paarung durchführen.
  2. Entfernen Sie die divider folgenden Morgen und lassen Sie Fisch ohne Unterbrechung zu paaren. Ernte Embryonen 2 Stunden später durch das System Wasser belasten und die Übertragung der Embryonen in 100 mm Petrischalen mit Embryo Medium.
  3. Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale. Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie unbefruchteten Eiern mit einer Glaspipette. Wachsen Embryonen bei 28 ° C und fügen Phenylthioharnstoff (PTU) bis zu einer Endkonzentration von 0,003% nach 10 Stunden post-Befruchtung (hpf) Pigment Entwicklung zu hemmen.

3. Ethanol, Metronidazol Behandlung und Leberregeneration in Larval Zebrabärbling

  1. Bereiten frische EtOH-Lösung von Ethanol in Embryomedium bis zu einer Endkonzentration von 1,5% hinzugefügt wird. Fügen Sie keine PTU.
  2. Behandeln Embryonen mit 20 ml Ethanollösung pro Petrischale 56-80 HPF. Decken Sie Petrischalen mit Plastikfolie zu Ethanol Verdunstung verhindern.
  3. Aussortieren [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) PD24] Larven mit ähnlichen Lebergröße, wie bei 80 HPF von GFP - Expression, bestimmt. Nicht Tricaine verwenden, wenn die EtOH-behandelten Larven Sortierung, da diese hohe Sterblichkeit mit anschließender EtOH / MTZ Behandlung verursacht. Halten sortierter Larven in einer Dichte von 30 Embryonen pro Petrischale.
  4. Bereiten Sie frische 15 mM MTZ in Embryo-Medium in 0,1% DMSO. Fügen geeignete Menge EtOH in MTZ-Lösung mit einer Endkonzentration von 1,5% zu bringen. Inkubieren Larven in 20 ml EtOH / MTZ Lösung pro Petrischale 24 h lang bei 28 ° C. Decken Sie Petrischalen mit Plastikfolie EtOH-Konzentration und mit Aluminiumfolie zu halten vor Licht zu schützen.
  5. Am Ende der Behandlung zu entfernen EtOH / MTZ Lösung von Larven auf neue Petrischalen mit frischem embryo Medium zu übertragen. Waschen Sie Larven 3-mal mit Embryo Medium und halten sie in 20 ml Embryo Medium ohne PTU.
  6. Um die Larven sortieren, mit nahezu vollständigen Ablation von Hepatozyten, beobachten Fluoreszenzunter einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit dem GFP-Filter bei einer Vergrößerung von 80X. Erfolgreiche Ablation führt zu einer minimalen CFP Fluoreszenz in der Leber und deutlich reduzierten Lebervolumen.
  7. Um zu vermeiden, den Tod des EtOH / MTZ-behandelten Larven, verwenden Tricaine nicht für die Sortierung. Fixieren Sie die Larven für Immunfärbung (siehe Abschnitt 5) oder halten sortierten Larven in Petrischalen bei 28 ° C für weitere Analysen.

4. Chemische Screens in EtOH / MTZ-behandelten Larval Zebrabärbling

  1. Bringen Sie die 96-Well-Platten, die 10 mM chemische Bestände in DMSO (beziehen sich auf die Materialliste für Angaben zu den kommerziellen chemischen Bibliotheken) von -80 ° C-Gefrierschrank. Mit Alufolie abdecken zu photokatalytischen Abbau von Chemikalien zu verhindern. Tauen Sie die Stammlösungen bei RT unter leichtem Schütteln.
  2. Bereiten chemische Lösungen durch Verdünnen von 10 mM Stammlösungen mit Embryo Medium bis zu einer Endkonzentration von 50 & mgr; M (in 96-Well-Platten: initial screen; in 1,5-ml-Röhrchen: Wiederholung der Prüfungen). Kontroll Larven wurden mit gleichen Konzentrationen von DMSO in Embryo Medium behandelt.
  3. Transfer Larven mit nahezu vollständigen Hepatozyten-Ablation, die mit 1,5% EtOH / 15 mM MTZ und sortiert, wie oben erwähnt behandelt wurden, zu beiden 96-Well (Einstiegsbild) oder 24-Well (Wiederholung der Prüfungen) Platten mit einer Dichte mit Embryo Medium vorbefüllt von 5 Larven pro Vertiefung. Verwenden Sie doppelte Vertiefungen für jede Chemikalie.
  4. Entfernen Embryo Medium und fügen Sie entweder 250 & mgr; l (96-Well-Platten) oder 500 & mgr; l (24-Well-Platten) chemischen Lösungen in jede Vertiefung. Abdeckplatten mit Aluminiumfolie und behandeln Larven für 50 Stunden bei 28 ° C. Untersuchen Sie chemisch-Einweichen Larven täglich und entfernen Sie alle toten Larven aus den einzelnen Vertiefungen.
  5. Am Ende der chemischen Behandlung, beachten Sie die Anzahl und / oder die Intensität der GFP-exprimierenden Hepatozyten unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit dem GFP-Filter bei einer Vergrößerung von 80X. Fotografie lebenden Larven zeigt verstärkt oder reduzierend Zahl und / oder Intensität der GFP-exprimierenden Hepatozyten mit einer Digitalkamera für Datensätze.
  6. Preserve Larven von Formaldehyd Fixierung für die konfokale Abbildung, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
  7. Um die Chemikalien erneut zu testen, die Hepatozyten-Regeneration im Einstiegsbild zu erleichtern, prüfen ihre Wirksamkeit bei höheren und niedrigeren Konzentrationen die wirksamste Konzentration mit den Verfahren in 4,1-4,5 ( "die Wiederholung der Prüfung ') beschrieben zu finden.

5. Larval Zebrabärbling Fixation, Immunostaining und konfokale Bildgebung

  1. Anästhesieren Larven von Tricaine bis zu einer Endkonzentration von 0,02% hinzugefügt wird. Übertragen 10-15 Larven in ein 1,5-ml-Röhrchen und wasche einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen PBS und 1 ml frisch zubereitet 2% Formaldehyd in PEM-Puffer O / N bei 4 ° C zu beheben.
    VORSICHT: Formaldehyd führt zu Reizungen und ist bekannt als ein menschliches Karzinogen zu sein. Griff in einer chemischen Abzugshaube.
  2. Entsorgen Lösung Fixierung richtig und dann wash 3 mal mit PBS bei RT. Feste Larven können in PBS bei 4 ° C aufbewahrt werden bis zu mehreren Tagen. Geht zum nächsten Schritt gibt prompt bessere Immunfärbung Ergebnisse.
  3. Entfernen Sie vorsichtig Dotter und die Haut für den Bereich der Leber ein # 55 Pinzette unter einem Stereomikroskop verwendet wird.
  4. Permeabilisierung und Block Larven in Blockpuffer (4% Rinderserumalbumin und 0,3% Triton X-100 in PBS) O / N bei 4 ° C.
  5. Inkubieren mit Kaninchen-Anti-Collagen I-Antikörper in einer Verdünnung von 1: 100 in Blockpuffer O / N bei 4 ° C. Waschen 5 mal für jeweils 15 Minuten mit Waschpuffer (0,3% Triton X-100 in PBS).
  6. Inkubieren mit AlexaFluor 647 konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 200 in Blockpuffer O / N bei 4 ° C. Waschen 5 mal für jeweils 15 min mit Waschpuffer. Dann waschen Sie einmal mit PBS.
  7. übertragen vorsichtig Larven auf Glasplättchen mit einer Glaspipette, und orientieren festen Larven mit der linken seitlichen Seite nach oben verwendet wird. Überschüssigen PBS Kimwipes. Fügen Sie einen Tropfen EindeckmittelUnd Dichtung Deckglas mit Nagellack. Die Durchführung konfokaler Bildgebung sofort stark empfohlen.
  8. Verwenden Sie ein konfokales System, ausgestattet mit einem 40X / 1.3 Öllinse zum Erfassen von Bildern. Verwenden Sie Laserstärke bei 20-50%. Erfassen Z Stapel Bilder bei 1 & mgr; m-Intervallen.

6. Herstellung von Adult Zebrafisch

  1. Richten Sie Paarung von [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 erwachsenen Zebrafisch in Paarungstanks. Ernte-Embryonen am nächsten Morgen durch das System Wasser belasten und die Embryonen in 100 mm Petrischalen mit Embryo Medium zu übertragen.
  2. Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale. Unter einem Stereomikroskop, entfernen Sie unbefruchteten Eiern mit einer Glaspipette. Wachsen Embryonen bei 28 ° C und fügen PTU auf eine Endkonzentration von 0,003% nach 10 hpf Pigment Entwicklung zu hemmen.
  3. Bei 4 dpf, verwenden Tricaine Larven zu betäuben und sortieren [Tg (fabp10a: GFP-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] Larven. Waschen Sie Tricaine durch frisches Embryo Medium mehrmals verändert. Lassen Sie Larven bei 28 ° C zu erholen , bis sie pro Minute 18 normale Herzfrequenz von 120-180 Schlägen erreichen.
  4. Heben Sie sortierte Larven 6-12 Monate alt basierend auf dem Standardverfahren 19.

7. Ethanol, Metronidazol Behandlung und Leberregeneration in Adult Zebrafisch

  1. Übertragen 6-12 Monate alt [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] erwachsenen Zebrafisch zu Paarungs Tanks mit einem Netz verwendet wird . Halten Sie Fisch mit einer Dichte von nicht mehr als 10 Fische pro Tank.
  2. Bereiten frische EtOH-Lösung von EtOH im System Wasser auf eine Endkonzentration von 1% hinzugefügt wird. Behandeln Sie wachsene Fische mit 500 ml EtOH-Lösung in jedem Tank und halten sie in einem 28 ° C Inkubator.
  3. Transfer wachsene Fische an die frische EtOH-Lösung täglich, Discard tote Fische propErly als Biohazard. Kontinuierlich behandeln Tiere für 72 Stunden vor der MTZ-Behandlung.
  4. Bereiten Sie frische 10 mM MTZ Lösung in System Wasser in 0,1% DMSO. Pre-warm die MTZ-Lösung in einem 28 ° C Inkubator. Behandeln Sie Fisch mit 500 ml MTZ Lösung in 1 L Kreuzung Tank für 8 Stunden bei 28 ° C, vor Licht schützen Aluminiumfolie.
  5. Beachten Sie stündlich während der Behandlung und entfernen Sie sofort tote Fische. Entsorgen toter Fisch richtig als Biohazard. Am Ende der Behandlung MTZ, auswaschen MTZ von Tieren frisches System Wasser zweimal übertragen.
  6. Lassen Sie Tiere erholen und pflegen sie in einem Inkubator bei 28 ° C. Futtermittel und übertragen Fisch frisches System Wasser täglich bis zu dem Zeitpunkt für Analysen.

8. Adult Zebrafisch Leber Fixierung, Immunostaining und konfokale Imaging

  1. in Eiswasser für 15 min Anesthetize wachsene Fische mit 0,02% Tricaine und einschläfern. Pat der Fisch trocken auf einem Papiertuch und legen Sie es auf einer Sezieren Matte.
  2. Expose Magen - Darm - Organe durch das Entfernen der Haut und Muskeln , wie zuvor beschrieben 20. Mit einer Schere die Haut und darunter liegende Muskulatur entlang der Bauch von der Afterflosse zum operculum zu schneiden, und dann nach hinten entlang der Seite des Fisches zurück in die Afterflosse.
  3. Setzen Sie den Fisch in einem 15 ml konischen Röhrchen und waschen Sie einmal mit PBS. Entfernen PBS und 4 ml frisch zubereitet 2% Formaldehyd in PEM-Puffer O / N bei 4 ° C zu beheben.
  4. Entsorgen Lösung Fixierung richtig, und waschen Sie 3-mal mit PBS bei RT. Festen Proben kann in PBS bei 4 ° C mehrere Tage lang aufbewahrt werden. Geht zum nächsten Schritt gibt sofort eine bessere Immunfärbung Ergebnisse.
  5. Sezieren die ganze gut mit Leber aus der Körperhöhle des Fisches durch die Speiseröhre zu schneiden. Einbetten der Magen-Darm-Organe mit 4% niedrig schmelzenden Agarose in einer Schnittform.
  6. Verwenden Sie ein Vibratom geschnitten Proben in Querschnitten bei 50 & mgr; m Intervallen in eiskaltem PBS, vom vorderen Ende beginnt. Übertragen secten bis 6-Well-Platte mit PBS ein # 1 Pinsel verwenden.
  7. Permeabilisierung und Blockabschnitte in Blockpuffer O / N bei 4 ° C.
  8. Inkubieren mit Kaninchen-Anti-Collagen I-Antikörper in einer Verdünnung von 1: 100 in Blockpuffer O / N bei 4 ° C. Waschen Sie 5-mal, jeweils 15 min mit Waschpuffer.
  9. Inkubieren mit AlexaFluor 647 konjugierten Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 200 in Blockpuffer O / N bei 4 ° C. Waschen 5 mal, jeweils 15 min mit Waschpuffer und einmal mit PBS.
  10. Sanft übertragen Schnitte an den Glasobjektträger ein # 1 Pinsel verwenden. Überschüssigen PBS Kimwipes, einen Tropfen Eindeckmittel und Dichtungsdeckel Glas mit Nagellack. Die Durchführung konfokaler Bildgebung sofort wird dringend empfohlen.
  11. Verwenden Sie ein konfokales System, ausgestattet mit einem 40X / 1.3 Öllinse zum Erfassen von Bildern. Verwenden Sie Laserstärke bei 20-50%. Erfassen Z Stapel Bilder bei 1 & mgr; m-Intervallen.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Entwicklung einer EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodell in Larven Zebrabärbling. Um ein Protokoll zur Belichtung Zebrabärbling Larven EtOH optimieren wir zunächst EtOH Toxizität beurteilt. 2,5 Tage post-Fertilisation (dpf) Larven wurden auf 1% EtOH-Konzentration ausgesetzt, 1,5% bzw. 2% für 24 Stunden durch eine gleichzeitige 24 hr EtOH / MTZ Behandlung. Exposition gegenüber 2% EtOH verursacht hohe Mortalität, während fast alle Larven auf 1% EtO...

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Diskussion

Wir beobachteten HPC-vermittelte Hepatozyten Regeneration in den EtOH / MTZ-behandelten Rückgewinnung Lebern, was nahe legt, dass selbst in Gegenwart von erheblichen Menge an ECM-Proteinen, einschließlich fibrillärem Kollagen Typ I, die HPCs ihre Kompetenz behalten als Hepatozyten zu regenerieren. Die MTZ nur Behandlung nicht zu einer Erhöhung der Abscheidung von ECM - Proteine ​​signifikant, während die EtOH nur Behandlung nicht HPC Aktivierung 15 induzieren. Durch die Nutzung der kombinierten EtOH / MTZ Beh...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus der GTEC (2731336 und 1411318), der NIH (K01DK081351) und der NSF (1.354.837) zu CHS unterstützt Wir Alem Giorgis für das kritische Lesen des Manuskripts danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Calciumsulfat-Halbhydrat (CaSO4)AcrosAC385355000
Magnesiumsulfat (MgSO4)EMD MX0075
1,4-Piperazindiethansulfonsäure (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-
N,N,N′,N′ -Tetraessigsäure (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
EthanolSigma-AldrichE7023200
proof FormaldehydFisher ScientificF79-500
Metronidazol (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-Aminobenzoesäureethylester (Tricain)Sigma-AldrichA5040
Tablette mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)AmrescoE404Eine Tablette mit 100 ml destilliertem Wasser auflösen
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD2438
RinderserumalbuminFisher ScientificBP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Niedrigschmelzend agarose AmrescoBP165
Bibliothek für StammzellsignalverbindungenSelleck ChemicalsL210010  mM Lagerbestand in DMSO
ActiProbe-1K BibliothekTimtecActiProbe-1K10  mM Lagerbestand an DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729Mit DMSO auflösen auf 10  mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924Mit DMSO auf 10  auflösen mM
Anti-Collagen I AntikörperAbcamab23730Verwendung bei 1:100 zur Immunfärbung, reagiert mit Fischen
AlexaFluor 647 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)Molekulare SondenA31573Verwendung bei 1:200 zur Immunfärbung
Einbettmedien (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
100 mm PetrischaleVWR25384-088
24-well PlatteVWR10062-896
PinzetteFine Science Tools11255-20Dumont #55
ObjektträgerVWR48312-00375x25 mm
DeckglasVWR48366-04518 mm
FrischhaltefolieFisher Scientific22305654
AluminiumfolieFisher Scientific1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
VibrotomLeicaVT1000 S
StereomikroskopLeicaM80
EpifluoreszenzmikroskopLeicaM205 FA
Confocol MikroskopZeissLSM700

Referenzen

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