Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Summary

Anhaltende Fibrose mit Ablagerung von übermäßigen extrazellulären Matrixproteinen führt zu Zirrhose. Alkoholmissbrauch ist eine der Hauptursachen für schwere Lebererkrankungen. Wir haben ein Ethanol-induziertes Zebrafisch-Modell für fibrotische Lebern etabliert, um die Mechanismen und Strategien zur Förderung der Hepatozytenregeneration nach alkoholinduzierten Verletzungen zu untersuchen.

Abstract

Anhaltende Leberfibrose mit Fortsetzung des Proteinaufbaus in der extrazellulären Matrix (ECM) führt zum Verlust der zellulären Kompetenz der Leber, was zu einer Zirrhose mit hepatozellulärer Dysfunktion führt. Neben mehreren Leberschäden kann Alkoholmissbrauch zu erheblichen gesundheitlichen Problemen wie Leberversagen und hepatozellulärem Karzinom führen. Nichtsdestotrotz wurde die Identität endogener zellulärer Quellen, die Hepatozyten als Reaktion auf Alkohol regenerieren, nicht richtig untersucht. Darüber hinaus haben nur wenige Studien die Regeneration von Hepatozyten bei alkoholinduzierten Verletzungen effektiv modelliert. Wir haben kürzlich über die Etablierung eines Ethanol (EtOH)-induzierten fibrotischen Lebermodells im Zebrafisch berichtet, in dem hepatische Vorläuferzellen (HPCs) bei nahezu vollständigem Hepatozytenverlust in Gegenwart eines fibrogenen Stimulus Hepatozyten hervorbrachten. Darüber hinaus haben wir durch chemische Screenings mit diesem Modell mehrere kleine Moleküle identifiziert, die die Regeneration von Hepatozyten verbessern. Hier beschreiben wir ausführlich die Vorgehensweisen zur Entwicklung eines EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodells und zur Durchführung chemischer Screenings mit diesem Modell im Zebrafisch. Dieses Protokoll wird ein wichtiges Instrument sein, um die molekularen und zellulären Mechanismen der Regeneration von Hepatozyten in der fibrotischen Leber zu beschreiben. Darüber hinaus werden diese Methoden die potenzielle Entdeckung neuartiger therapeutischer Strategien für chronische Lebererkrankungen in vivo erleichtern.

Introduction

Trotz der bemerkenswerten Regenerationsfähigkeit von Hepatozyten ^1, die die Haupt Parenchymzelle Typ der Leber sind, beeinträchtigt chronischem Leberversagen diese Fähigkeit, die zu Lebervorläuferzellen (HPC) -abhängigen Regeneration ^2.

Chronische Leberschäden wird hauptsächlich durch Alkoholmissbrauch, chronische Hepatitis - C - Virus (HCV) -Infektion ³ und nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ⁴ abgeleitet. Es führt zu einer nachhaltigen Leberfibrose, die mit der Akkumulation von extrazellulären Matrix (ECM) Proteinen assoziiert ist. Persistierende ECM Akkumulation verzerrt intakte Le....

Protocol

Zebrabärblinge wurden angehoben und unter Verwendung eines Standardprotokolls gezüchtet, die die Kriterien der National Institutes of Health erfüllt und vom Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Herstellung der Lösungen

1. Es werden 20 L Ei Wasser (austauschbar mit "Embryo Medium" verwendet) embryonale / Larven Zebrabärbling zu halten. Man löst 1,5 g CaSO ₄ und 6 g Instant Ocean Meersalz in 250 ml destilliertem Wasser. Gießen Sie in einen Kanister mit 20 l destilliertem Wasser gefüllt und agitieren.
2. Bereiten Sie 1 L 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) Stammlösung (20x). Man löst 0,6 g....

Results

Abbildung 1 zeigt die Entwicklung einer EtOH-induzierten fibrotischen Lebermodell in Larven Zebrabärbling. Um ein Protokoll zur Belichtung Zebrabärbling Larven EtOH optimieren wir zunächst EtOH Toxizität beurteilt. 2,5 Tage post-Fertilisation (dpf) Larven wurden auf 1% EtOH-Konzentration ausgesetzt, 1,5% bzw. 2% für 24 Stunden durch eine gleichzeitige 24 hr EtOH / MTZ Behandlung. Exposition gegenüber 2% EtOH verursacht hohe Mortalität, während fast alle Larven auf 1% EtO.......

Discussion

Wir beobachteten HPC-vermittelte Hepatozyten Regeneration in den EtOH / MTZ-behandelten Rückgewinnung Lebern, was nahe legt, dass selbst in Gegenwart von erheblichen Menge an ECM-Proteinen, einschließlich fibrillärem Kollagen Typ I, die HPCs ihre Kompetenz behalten als Hepatozyten zu regenerieren. Die MTZ nur Behandlung nicht zu einer Erhöhung der Abscheidung von ECM - Proteine ​​signifikant, während die EtOH nur Behandlung nicht HPC Aktivierung ¹⁵ induzieren. Durch die Nutzung der kombinierten EtOH / MTZ Beh.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calciumsulfat-Halbhydrat (CaSO4)	Acros	AC385355000
Magnesiumsulfat (MgSO4)		EMD MX0075
1,4-Piperazindiethansulfonsäure (PIPES)	Sigma-Aldrich	P6757
Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′ -Tetraessigsäure (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	200
proof Formaldehyd	Fisher Scientific	F79-500
Metronidazol (MTZ)	Sigma-Aldrich	M3761
1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
3-Aminobenzoesäureethylester (Tricain)	Sigma-Aldrich	A5040
Tablette mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)	Amresco	E404	Eine Tablette mit 100 ml destilliertem Wasser auflösen
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438
Rinderserumalbumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Niedrigschmelzend agarose	Amresco	BP165
Bibliothek für Stammzellsignalverbindungen	Selleck Chemicals	L2100	10  mM Lagerbestand in DMSO
ActiProbe-1K Bibliothek	Timtec	ActiProbe-1K	10  mM Lagerbestand an DMSO
SB 415286	Selleck Chemicals	S2729	Mit DMSO auflösen auf 10  mM
CHIR-99021	Selleck Chemicals	S2924	Mit DMSO auf 10  auflösen mM
Anti-Collagen I Antikörper	Abcam	ab23730	Verwendung bei 1:100 zur Immunfärbung, reagiert mit Fischen
AlexaFluor 647 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Molekulare Sonden	A31573	Verwendung bei 1:200 zur Immunfärbung
Einbettmedien (Vectorshield)	Vector Laboratories	H-1400
100 mm Petrischale	VWR	25384-088
24-well Platte	VWR	10062-896
Pinzette	Fine Science Tools	11255-20	Dumont #55
Objektträger	VWR	48312-003	75x25 mm
Deckglas	VWR	48366-045	18 mm
Frischhaltefolie	Fisher Scientific	22305654
Aluminiumfolie	Fisher Scientific	1213100
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Vibrotom	Leica	VT1000 S
Stereomikroskop	Leica	M80
Epifluoreszenzmikroskop	Leica	M205 FA
Confocol Mikroskop	Zeiss	LSM700