Method Article

Entwicklung und Charakterisierung von In Vitro Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca 2+] i Und die Produktion von Stickoxid

DOI:

10.3791/54014

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May 19th, 2016

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1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

In This Article

Summary

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Primäre humane Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurden innerhalb eines mikrofluidischen Netzwerkgeräts zur Konfluenz gezüchtet. Die Endothelzellübergänge und F-Aktin-Verteilungen wurden dargestellt und die Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der Stickoxidproduktion als Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) wurden in Echtzeit auf Einzelzellebene quantifiziert.

Abstract

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Endothelzellen (ECs) sind die Wände der Blutgefäße in vivo Futter ständig fließen ausgesetzt, aber kultiviert ECs werden oft unter statischen Bedingungen gezüchtet und eine pro-inflammatorischen Phänotyp aufweisen. Obwohl die Entwicklung von Mikrofluidik-Vorrichtungen hat von den Ingenieuren mehr als zwei Jahrzehnten, ihre biologischen Anwendungen beschränkt bleiben gut angenommen. Eine physiologisch relevanten in vitro microvessel Modell durch biologische Anwendungen validiert ist wichtig , um das Feld zu fördern und um die Lücken zwischen in vivo- und in vitro - Studien überbrücken. Hier präsentieren wir detaillierte Verfahren für die Entwicklung von kultivierten microvessel Netzwerk eine Mikrofluidik-Vorrichtung mit einer langfristigen Perfusions-Fähigkeit verwenden. Wir zeigen auch , ihre Anwendungen für die quantitative Messung von Agonist-induzierter Veränderungen in EC [Ca 2+] i und Stickstoffmonoxid (NO) Produktion in Echtzeit konfokale und konventionelle Fluoreszenzmikroskopie. Das gebildete microvessel NetzArbeit mit kontinuierlicher Perfusion zeigte gut ausgebaute Verbindungen zwischen ECs. VE-Cadherin war Verteilung zu beachten, dass eine engere in intakten microvessels als statisch kultivierten EC Monolayern. ATP-induzierte vorübergehende Erhöhung des EC [Ca 2+] i und NO - Produktion wurden bei einzelnen Zellebenen quantitativ gemessen, die die Funktionalität der gezüchteten microvessels validiert. Diese mikrofluidischen Vorrichtung ermöglicht ECs unter einer gut kontrollierten, physiologisch relevanten Strömungs zu wachsen, die die Zellkulturumgebung näher an in vivo als bei den herkömmlichen, statischen 2D - Kulturen macht. Das Mikrokanalnetzdesign ist sehr vielseitig, und der Herstellungsprozess ist einfach und wiederholbar. Das Gerät kann einfach an die konfokale oder konventionellen mikroskopischen System integriert werden ermöglicht hochauflösende Bildgebung. Am wichtigsten ist, weil das kultivierte microvessel Netzwerk kann durch primären humanen ECs gebildet werden, wird dieser Ansatz als ein nützliches Instrument dienen zu untersuchen, wiepathologisch veränderten Blutkomponenten aus Patientenproben beeinflussen menschliche ECs und Einblick in die klinische Fragen bieten. Es kann auch als Plattform für Arzneimittelscreening entwickelt werden.

Introduction

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Endothelzellen (ECs) , um die Wände der Blutgefäße in vivo Futter ständig fließen ausgesetzt, aber kultiviert ECs werden oft unter statischen Bedingungen gezüchtet und weisen eine pro-inflammatorischen Phänotyp 1,2. Die Mikrofluidik - Technologie ermöglicht eine präzise gesteuerte Fluid durch eine geometrisch eingeschränkten mikroskaligen (Submillimeterbereich) Kanäle 3, die die Möglichkeit für die kultivierten Zellen bietet, insbesondere für vaskulären ECs unter gewünschten Strömungsbedingungen zu wachsen. Diese Eigenschaften machen die Zellkulturbedingungen näher an in vivo als die herkömmlichen, statischen 2D - Zellkulturen.....

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Protocol

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1. Mikrofluidikvorrichtung Fabrication

  1. Standard-Lithografie Herstellung eines SU-8 50 Master-Mold
    1. Reinigen Sie den Siliziumwafer vor Spin-Coating. Spülen mit einem nackten 2 inch Siliciumwafer mit Aceton für 15 min, gefolgt von Isopropylalkohol (IPA) für 15 min. Dehydratisieren des Wafers, indem es auf einer Heizplatte bei 150 ° C für 1 Stunde platziert. Nach der Dehydratisierung, Abkühlen des Wafers bei Raumtemperatur.
    2. Spin-Beschichtung der Silizium-Wafer mit SU-8 Photoresist. 2 ml SU-8 Photoresist auf dem Wafer. Rampe des Wafers auf 500 Upm bei 100 rpm / sec Beschleunigung für 10 sec, gefolgt von 1000 Umdrehungen pro Minute bei 300 rpm....

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Results

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Dieser Abschnitt zeigt einige der Ergebnisse mit dem kultivierten microvessel Netzwerk mit diesem Protokoll entwickelt erhalten. Die Mikrokanalmuster ist ein Dreipegel - Verzweigungsnetzwerk (1A). In diesem Entwurf ein 159 & mgr; m breiten Mutterkanal verzweigt sich in zwei 126 & mgr; m breite Kanäle und Äste wieder in vier 100 & mgr; m breit Tochter Kanäle. Eine 3D numerische Simulation wurde durchgeführt , um die Scherspannungsverteilungen unter der Strömun.......

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Discussion

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In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Entwicklung von kultivierten microvessel Netzwerk, die Charakterisierung von EC Kreuzungen und Zytoskelett F-Actin - Verteilung und die quantitative Messungen der EG [Ca 2+] i und NO - Produktion eine Mikrofluidik - Vorrichtung verwendet wird . Perfundierten mikrofluidischen Vorrichtung stellt ein in vitro - Modell , das eine enge Simulation der in vivo mikrovaskulärer Geometrien und Scherströmungsbedingungen.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen oder Interessenkonflikte offen zu legen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde von National Heart, Lung unterstützt, and Blood Institute gewährt HL56237, National Institute of Diabetes und Magen-Darm-und Nierenerkrankungen Institut DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 und EPS-1.003.907).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATPSigma-AldrichA2383
AcetonFisher ScientificA929
BiopsiestempelMiltex33-31 AA
RinderalbuminMP Biomedicals810014
Rinderhirnextrakt (BBE)LonzaCC-4098
DeckglasFisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
Esel Anti-Ziegen-IgG (H+L) Sekundäre AntikörperLebenstechnologienA-11055
DPBS, kein Calcium, kein MagnesiumGibco14190-250
DRAQ5 (Zellkernfärbung) Cell Signaling Technology4084
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
Fötales RinderserumGibco16000-044
FibronektinGibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
Gelatine aus SchweinehautSigma-AldrichG1890-100G
Gentamicin (50 mg/ml)Gibco15750-078
GlasdeckglasFisher Scientific12-548B
Glaspasteur-PippetteVWR14672
Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut des SchweinsSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES gepufferte KochsalzlösungLonzaCC-5024
Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVECs)LonzaCC-2517
Isopropylalkohol (IPA)VWR89125
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030-081
Säugetier-Ringer-Lösung Inhaltsstoff
NaCl (132 mM)Fisher ScientificS671-3
KCl (4,6 mM)Fisher ScientificP217-500
CaCl2 & middot; 2H2O (2,0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 · 7H2O (1,2 mM)Fisher ScientificM63-500
Glukose (5,5 mM)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5,0 mM)Fisher ScientificS233-500
Hepessalz (9,1 mM)Forschung Organische Stoffe6007H
Hepessäure (10,9 mM)Forschung Organische Stoffe6003H
MCDB 131 NährmediumLebenstechnologien10372-019
Paraformaldehyd-Elektronenmikroskopie15710
Phalloidin (F-Aktin-Färbung)Sigma-AldrichP1951
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung Life technologies14040-133
Polydimethylsiloxan (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
ScalpelExel Int29552
Scotch tape3M34-8711-3070-3
SiliziumwaferVWR14672
SU-8 FotolackMicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 EntwicklerMicroChemY020100
GewebekulturflaschenSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
Trypsin Neutralisator LösungGibcoR-002-100
Trypsin/EDTA Lösung (TE)GibcoR-001-100
SchlauchCole-ParmerPTFE-Mikroschlauch, 0,012" ID x 0,030" OD
VE-CadherinSanta Cruz BiotechnologySC-6458
Name des GerätsUnternehmen<strong>KatalognummerKommentare/Beschreibung
Biosicherheit LaminarhaubeNuAireNU-425 Klasse II, Typ A2
CCD-KameraHamamatsuORCA
Konfokales MikroskopLeicaTCS SL
ExsikkatorBel-ArtF42022
KochplatteWenescoHP-1212
InkubatorForma Scientific3110
Isotemp OfenBarnstead3608-5
Lithographie BankKarl SüssMA6 Kontaktlithographie
Optisches MikroskopNikonL200 ND & Diaphod 300
Shutter für die CCD-KameraSutter InstrumentLambda 10-2
PlasmareinigerPVA TePla/Harrick PlasmaM4L/PDC-32G
Spin CoaterBrewer ScienceCee 200X
SpritzenpumpensystemHarvard Apparatus703005
Name der Software CompanyKatalognummerKommentare/BeschreibungCAD-Software
AutodeskAutoCAD 2015
CFD-SimulationssoftwareCOMSOLCOMSOL Multiphysics 4.0.0.982
Bilderfassung und -analyse für die NO-Produktion Universelle BildgebungMetafluor

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

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Microvessel NetworkEndothelial CellsMicrofluidic DeviceShear FlowCalcium ImagingNitric Oxide ProductionConfocal MicroscopyFluorescence MicroscopyVE cadherin StainingATP Stimulation

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