Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Summary

Optische Clearing-Techniken revolutionieren die Art und Weise, wie Gewebe visualisiert wird. In diesem Bericht beschreiben wir Modifikationen des ursprünglichen CLARITY-Protokolls (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), das konsistentere und kostengünstigere Ergebnisse liefert.

Abstract

Traditionell erforderte die Gewebevisualisierung, dass das Gewebe von Interesse seriell geschnitten und abgebildet wird, wodurch jeder Gewebeschnitt einzigartigen nichtlinearen Verformungen unterzogen wurde, was die Fähigkeit, die zelluläre Morphologie, Verteilung und Konnektivität im zentralen Nervensystem (ZNS) zu beurteilen, dramatisch behinderte. Optische Clearing-Techniken verändern jedoch die Art und Weise, wie Gewebe visualisiert wird. Diese Ansätze ermöglichen es, tief in intakte Organpräparate einzudringen, was einen enormen Einblick in die strukturelle Organisation von Geweben bei Gesundheit und Krankheit bietet. Techniken wie Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) erreichen dieses Ziel, indem sie eine Matrix bereitstellen, die wichtige Biomoleküle bindet und gleichzeitig lichtstreuende Lipide frei diffundieren lässt. Die Lipidentfernung, gefolgt von der Anpassung des Brechungsindex, macht das Gewebe transparent und lässt sich leicht in 3 Dimensionen (3D) abbilden. Nichtsdestotrotz kann es schwierig sein, das elektrophoretische Gewebeclearing (ETC), das im ursprünglichen CLARITY-Protokoll verwendet wurde, erfolgreich zu implementieren, und die Verwendung einer proprietären Lösung zur Anpassung des Brechungsindex macht es teuer, die Technik routinemäßig anzuwenden. Dieser Bericht demonstriert die Implementierung eines einfachen und kostengünstigen optischen Clearing-Protokolls, das passives CLARITY für eine verbesserte Gewebeintegrität und 2,2′-Thiodiethanol (TDE), eine zuvor beschriebene Lösung zur Anpassung des Brechungsindex, kombiniert.

Introduction

Die Fähigkeit, komplette neuroanatomische Strukturen abzubilden, ist immens wertvoll für das Verständnis des Gehirns in Gesundheit und Krankheit. Traditionell war bei der 3D-Bildgebung ein Gewebeschnitt erforderlich, um die axiale Auflösung zu gewährleisten und tiefe anatomische Strukturen sichtbar zu machen. Dieser Ansatz kann hochauflösende Datensätze erzeugen, erfordert jedoch ausgefeilte Bildrekonstruktionstechniken und ist sehr arbeitsintensiv. Infolgedessen war es auf die Bildgebung kleiner Gewebevolumina^1-3 beschränkt. Das optische Schneiden hingegen eignet sich gut, um hochauflösende 3D-Bilder von fluoreszenzmarkierten Geweben zu erstellen. Da der o....

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt. THY1-YFP, PLP-EGFP und PV-tdTomato Mäuse wurden für diese Experimente verwendet, aber alle Mäuse fluoreszierende Proteine ​​exprimieren erfolgreich gelöscht werden kann und abgebildet.

1. Gewebepräparation

Achtung: Paraformaldehyd (PFA) und Acrylamid sind giftig und Reizstoffe. Führen Sie Experimente diese Reagenzien in einer Abzugshaube und mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung verwendet (Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille).

1. Sacrifice das Tier in Euthanasie Kamme....

Results

die strukturelle Organisation des Gehirns sichtbar machen ist entscheidend für das Verständnis, wie die Morphologie und Konnektivität Gehirnfunktion in Gesundheit und Krankheit beeinflussen. Optische Clearing-Techniken machen es möglich, Bildzellpopulationen in 3D in intakten Geweben, so dass wir kohäsiv Morphologie und Konnektivität zu studieren.

Mäuse, die fluoreszierende Proteine ​​exprimieren, angetrieben durch spezifische.......

Discussion

Passive Clearing von Hydrogel eingebettet Gewebe (passive CLARITY) ist eine einfache und kostengünstige Methode für große Gewebestücke zu löschen. Dieser Ansatz erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann leicht in einem temperaturgesteuerten Schüttler durchgeführt werden. Über den Zeitraum von einigen Wochen, auch große, hoch myelinisierten Gewebe, wie eine gesamte Gehirn oder Rückenmark, werden für die Mikroskopie transparent und geeignet sind. Auch wenn dieser Bericht über das Clearing von ZNS-Gewebe konzentriert h.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Fisher	BP399-1	Puffer
32% Paraformaldehyd (PFA)	Elektronenmikroskopie Sciences	15714-5	Perfusion und Hydrogel
2,2'-Thiodiethanol (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	Brechungsindex-Matching-Lösung
40%	Acrylamid Bio-Rad	161-0140	Hydrogel
2% Bis-Acrylamid	Bio-Rad	161-0142	Hydrogel
VA-044 Initiator	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	Hydrogel
Borsäure	Sigma-Aldrich	B7901	Clearing-Puffer
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Fisher	BP166-5	Clearing-Puffer
Natriumhydroxid	Fisher	55255-1	Puffer
Natriumazid	Sigma-Aldrich	52002-100G	Konservierungsmittel
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G	Puffer
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393-50KU	Perfusion
Natriumnitrat	Fisher	BP360-500	Perfusion
DAPI	Molecular Probes	D1306	Kernfärbung
99,9% Isofluran	Phoenix	57319-559-06	Anästhetikum
Hydrocholorinsäure	Fisher	A1445-500	Puffer
Glasbodenschale	Willco	HBSB-5040 Willco	Schalen
Wiederverwendbarer Klebstoff	Bostick	371351	Blu-Tack
Silikonelastomer	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
Fusselfreies Tuch	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Maus Gehirn Matrix	Roboz	SA-2175	Gewebe schneiden
Matrixklingen	Roboz	RS-9887	Gewebe schneiden
Peristaltische Pumpe	Cole-Parmer	77122-24	Pefusion
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Leica	SP5	Mikroskopie
Bildgebungssoftware	Leica	LAS AF	Mikroskopie