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Methodenartikel

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

8.4K Ansichten

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DOI:

10.3791/54026

⸱

9. Juni 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Von Patienten stammende Xenotransplantate von Glioblastoma multiforme können mit Hilfe eines humanen 3D-Biogel-Kultursystems in lebende Mikrotumoren miniaturisiert werden. Dieser in vivo-ähnliche 3D-Tumorassay eignet sich für Drug-Response-Tests und molekulares Profiling, einschließlich kinomischer Analysen.

Zusammenfassung

Die Verwendung von patienteneigenen Xenotransplantaten zur Modellierung von Krebserkrankungen hat wichtige Einblicke in die Krebsbiologie und das Ansprechen von Medikamenten geliefert. Sie sind jedoch zeitaufwändig, teuer und arbeitsintensiv. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben sich viele Forschungsgruppen Sphäroidkulturen von Krebszellen zugewandt. Tumor-Sphäroide oder -Aggregate sind zwar nützlich, replizieren aber keine Zell-Matrix-Wechselwirkungen, wie sie in vivo gefunden werden. Daher bieten dreidimensionale (3D) Kulturansätze, die ein extrazelluläres Matrixgerüst verwenden, ein realistischeres Modellsystem für die Untersuchung. Ausgehend von subkutanen oder intrakraniellen Xenotransplantaten wird das Tumorgewebe in eine Einzelzellsuspension dissoziiert, die den Neurosphären von Krebsstammzellen ähnelt. Diese Zellen werden dann in eine vom Menschen stammende extrazelluläre Matrix, das menschliche 3D-Biogel, eingebettet, um eine große Anzahl von Mikrotumoren zu erzeugen. Interessanterweise können Mikrotumoren mit hoher Lebensfähigkeit etwa einen Monat lang kultiviert werden und können für Arzneimittelreaktionstests mit Standard-Zytotoxizitätsassays wie 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und Lebendzellbildgebung mit Calcein-AM verwendet werden. Darüber hinaus können sie immunhistochemisch analysiert oder für die molekulare Profilierung geerntet werden, wie z. B. das Array-basierte Hochdurchsatz-Kinomische Profiling, das hier ebenfalls ausführlich beschrieben wird. 3D-Mikrotumoren stellen somit ein vielseitiges Hochdurchsatz-Modellsystem dar, das die In-vivo-Tumorbiologie besser replizieren kann als herkömmliche Ansätze.

Einleitung

Die häufigsten primären intrakraniellen bösartigen Hirntumoren sind Grad III Astrozytome und Grad IV Glioblastom (Glioblastom oder GBM). Diese Tumoren bieten schlechten Prognosen mit Median Ein-Jahres - Überlebensrate zwischen 12 bis 15 Monaten bei den derzeitigen Therapien für GBM in den USA 1-3. Multimodalität Therapien umfassen Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie einschließlich Temozolomid (TMZ) und Kinase-bezogenen Mittel. Kinase Signalgebung in GBM, einschließlich Teilmengen von Tumoren mit Amplifikation oder aktivierende Mutationen in den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), erhöht sich in Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) Signalisieren, erhöht Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K) häufig dysreguliert und Unterstützung Tumor 4-6 angiogenen Signalisierung durch Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR) sowie andere Kinase angetrieben Wege. Aktuelle In - vitro und in - vivo - Modellen diese repräsentativen Veränderungen häufig verlieren 7. Darüber hinaus hat genetische Profilierung nicht die erwarteten Vorteile angeboten, die die Tatsache, dass genetische und epigenetische Veränderungen Veränderungen auf der Ebene der Proteinaktivität vorhersagen, nicht immer widerspiegeln kann, wo die meisten Kinase Mittel wirken direkt und wo Therapien mit anderen Wirkmechanismen wirken können Targeting indirekt.

Die traditionelle immortalisierte Zelllinie, die ad infinitum agiert werden kann, ist seit langem der Standard für Drogentests aufgrund ihrer Wartungsfreundlichkeit und Reproduzierbarkeit. Jedoch leidet dieses Modell von einem hohen Nährstoff (und künstliche) Wachstumsumgebung, die Zellen für schnell wachsende, die sich stark von dem ursprünglichen Tumor auswählt. Als solches hat es bei der Entwicklung realistischer Modellsysteme ein beträchtliches Interesse, die ein komplexeres Tumor biologischen System reflektieren als in dem Patienten vorhanden ist. Tumorxenografte bei Mäusen gezüchtet direkt aus einem Primärtumor entwickelt ( "xenoline" Patienten stamm Xenotransplantat oder PDX) provide ein reflektierter Modellsystem, insbesondere im Rahmen von Krebstherapeutika, da sie zuverlässiger klinischer Erfolg vorhersagen , sind zu spüren. 8 Trotz der reflexions Biologie, diese Modelle sind teuer und schwierig herzustellen und aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sind sie Hochdurchsatz-Untersuchungen nicht zugänglich. Die Notwendigkeit, eine bessere biologische Modelle zu entwickeln, die genauer molekularen Veränderungen in den primären Tumoren reflektieren und zu profilieren und diese Modelle durch direkte Maßnahmen der Kinaseaktivität zu testen, nicht genetische Marker Surrogat, ist klar.

Es ist bekannt , dass im Gegensatz zu zweidimensionalen (2D) Monolayer - Kulturen, 3D oder mehrzelligen Testmodellen mehr physiologisch relevanten Endpunkten 9-11 bereitstellen kann. Gemeinsame 3D-Kultur Ansätze beinhalten Matrix beschichteten Mikrocarriern und Zell Sphäroidformation. Tumorsphäroide kann über zelluläre Aggregation mit Rührflasche, pHEMA Platte und Hänge Drop-Techniken erzeugt werden. Einschränkungen für tiese Ansätze umfassen: Unfähigkeit für einige Zellen stabil Sphäroiden, Variabilität in Wachstum und Herausforderungen mit gemischten Zelltypen zu bilden. Alternativ 12-14 viele synthetische (Hydrogel - Polymer) und tierischen Ursprungs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix aus Maus - Sarkome, Rinder - Kollagen) Matrizen entwickelt wurden , für die 3D - Kultur studiert. Maus - EHS - Matrix weitgehend verwendet wird , aber bekannten Zellwachstum und die Differenzierung in vitro zu fördern , und in vivo 15.

Um 3D - Tumorbiologie zu replizieren, wurde ein Mensch Biomatrix System von Dr. Raj Singh et al. Entwickelte 16. Die natürliche, Wachstumsfaktor-freien menschlichen Biogel ermöglicht 3D-Kultur Gerüste (Perlen, Scheiben), die Langzeitkultivierung von mehreren Zelltypen unterstützen. Eine Reihe von 3D menschlichen Biogel Kultur Designs sind für die Untersuchung von Tumorwachstum, Adhäsion, Angiogenese und Invasion Eigenschaften etabliert. Vorteile und Eigenschaften der menschlichen Biogel im Vergleich zu gemeinsamenMaus - EHS - Gele sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 zusammengefasst.

Quelle: Menschliche Amnion (gepoolte Gewebe)
Pathogen-frei, IRB frei / genehmigt
ECM Natur: Nichtdenaturierter Biogel (GLP-Produktion)
Schlüssel
Komponenten: 		Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin & HSPG (<3%)
GF frei: Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogenen, ungiftiger)

Tabelle 1: Eigenschaften der Menschen Biogel als Common EHS Gele verglichen.

Menschliche Biogel EHS - Gele
Natürliche menschliche Matrix Rekonstituierte Maus Matrix
Controlled Zellwachstum und Differenzierung Kann das Zellwachstum und Differenzierung fördern
Physiologische Genexpression Variable Genexpression
3D gewebeähnlichen Kulturmodell Plattenbasis Kulturmodell

Tabelle 2: Die Vorteile der Menschen Biogel als Common EHS Gele verglichen.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Xenotransplantat Therapie Auswertungen wurden unter Verwendung eines orthotopen Tumormodell für Glioblastom auf einem Protokoll getan genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee.

1. Isolierung von Patienten stammenden GBM Xenotransplantatzellen

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Wieder bilden Kollagenase-I in sterilem Wasser auf eine Konzentration von 5 mg / ml und Sterilfilter. Store in 1 ml Aliquots bei -20 ° C (Endkonzentration beträgt 50 & mgr; g / ml in 100 ml Enzymlösung).
    2. Man löst 100 ug Epidermal Growth Factor (EGF) in 2 ml steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Store in 100 ul (5 ug / 100 ul) Aliquots bei -20 ° C für eine Endkonzentration von 10 ng / ml.
    3. Man löst 100 ug FGF-β in 2 ml sterilem PBS. Store in 100 ul (5 ug / 100 ul) Aliquots bei -20 ° C für eine Endkonzentration von 10 ng / ml.
    4. Fügen Sie den folgenden auf eine 500 ml Flasche Neurobasal Media (NBM) herzustellen vollständige NBM: 10 ml B-27 Supplement ohne Vitamin A, 5 ml N2 ergänzen, 100 ul EGF, 100 ul Fibroblast Growth Factor (FGF) -Basic, 5 ml Amphotericin B, 0,5 ml Gentamycin, 5 ml L-Glutamin.
    5. Bereiten Sie frische Enzymlösung durch die Kombination: 98,5 ml PBS, 1 ml Kollagenase-1, 0,5 ml 10x Trypsin / EDTA und sterilisieren durch Filtration durch 0,22 um Porenfilter.
    6. Vorbereiten oder ein kleines Volumen steriler Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) / F12 Zellkulturmedium mit 7% fötalem Rinderserum (FBS) und 1x PBS ohne Calcium oder Magnesium erhalten.
  2. Tumor Disaggregation
    HINWEIS: athymischen nu / nu-Maus zuvor mit Tumorzellen in die rechte Flanke injiziert, und man ließ sie aus einer tastbaren Tumormasse ist für dieses Verfahren erforderlich. In den hier gezeigten Beispielen verwendeten wir Patienten stamm Xenotransplantat GBM Zellen, JX10 und JX12 17.
    1. Sterilisieren Arbeitsbereich durch Sprühen 2% Chlorhexidin und eingerichtet Arbeitsbereich Witzh notwendigen Instrumente / Lieferungen einschließlich Einweg - Bohrfutter, Pinzetten, Skalpell, Glas Petrischale, Enzymlösung, PBS und Chlorhexidin (siehe Abbildung 2A).
    2. Euthanize Maus / Mäuse eine Flanke Tumor beherbergen. Ziel für eine 20% / min Verschiebungsrate von CO 2 unter Verwendung von 30% CO 2. Nachdem der Maus Atemstillstand zeigt, für ca. 1 min (typischerweise 3 min gesamt) CO 2 Fluss aufrechtzuerhalten. Mäuse werden aus der Kammer entfernt und zervikale Dislokation wird als Sekundär Euthanasie Bestätigung ausgeführt. Sprühen Sie das Tier mit 3% Chlorhexidin Haut zu sanieren.
    3. Während die Maus stabil halten, machen halbkreisförmige Hautschnitt ~ 1,5 cm von Tumormasse (Flanke implantierte Tumor) beginnt kranial der Tumormasse mit einer sterilen Einweg-Skalpell mit # 11 Klinge und in Richtung Bauch der Maus Einschneiden und um auf die Schwanzende.
    4. Reflektieren Haut über Massentumor Finger mit leichten Zug am Schwanzende des Einschnitts mit und drücken Sie dann auf der HautOberflächen Tumor zu erhöhen besten Zugang zu haben , ohne den Tumor zu berühren (siehe 2B).
    5. Verwenden Sie mit einer Pinzette stumpfe Präparation vorsichtig frei Tumormasse von Peritonealwand und von der Haut (siehe Abbildung 2C).
    6. Transfer Tumormasse mit einer Pinzette in sterile Glaspetrischale (NICHT Plastikgeschirr verwenden, um zu verhindern während mincing Brechen) und ordnungsgemäß Karkasse verwerfen und diese Instrumente beiseite legen.
    7. Verwenden Sie neue Reihe von sterilen Instrumenten (Skalpell mit # 11 Klinge, halb gebogenen Pinzette) Tumorgewebe des nekrotischen Gewebes und membranösen Wirts Bindegewebe bedeckt Tumor debride.
    8. Legen 15 ml Enzymlösung in einem sterilen entlüftet-Trypsinisierung Kolben mit Rührstab und beginnen langsam in der Haube gerührt wurde.
    9. In einer sterilen Petrischale aus Glas, waschen geerntet Tumoren 3-5 mal mit sterilem PBS überschüssiges Blut zu entfernen (Spritze gießen oder verwenden Sie können sie mit dem PBS spülen). kippen vorsichtig Schale und Pipette oder das Waschmaterial absaugen. Mince finely zwei # 11 Skalpellklingen mit (siehe 2D).
    10. In 14 ml Enzymlösung auf gehacktes Tumor und pipettieren sanft auf und ab 2 - 3 mal. Transfer Gemisch entlüftet-Trypsinisierung Kolben und rühren langsam für 20 min. Bereiten 5 50 ml konische Röhrchen durch Zugabe von 1,5 ml FBS zu jeder um das Trypsin in Schritt 1.2.11 zu neutralisieren.
    11. Nach 20 min von Trypsinisierung Kolben 14 ml Zelllösung zu sammeln und mit FBS zu einem Röhrchen hinzufügen. In 14 ml frischer Enzymlösung in den Kolben und das Rühren fortgesetzt.
    12. Zentrifuge gesammelten Zellen bei 150 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. In 45 ml Komplett NBM zum Pellet, vorsichtig mischen und wiederholen Zentrifugation Serum auszuspülen. Re-suspend Pellet in 5ml komplette NBM und halten Sie auf dem Eis.
    13. Wiederholen Zellernte Schritte für insgesamt 5 Ernten, alle geernteten-Zellen in einem einzigen konischen Röhrchen auf Eis kombinieren.
    14. Legen Sie eine 40 & mgr; m Zellsieb auf der Oberseite eines 50 ml konischen Röhrchen. Prep ter Zellsieb von 10 ml DMEM / F12 + 7% FBS und dann durch Waschen mit 10 ml PBS geben.
    15. Langsam Zellsuspension Sieb hinzufügen, es (siehe Abbildung 2 M) zu durchtropfen ermöglicht. Das Register der Zelle Sieb zwischen jedem neuen Zusatz jedes Vakuum zu brechen und erlauben die suspendierten Zellen frei zu passieren (siehe Abbildung 2 N) vorsichtig anheben.
    16. Zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension wie oben. Re-suspend in 10 ml Voll-NBM und zählen Gesamtzahl der lebenden Zellen zu bestimmen, unter Verwendung von 0,04% Trypanblau und einer Zählkammer. Halten Sie Zellen auf Eis, bis microtumor Generation.

2. Alternative Tissue Disaggregation Protokoll

  1. Automatisierte Gewebe Dissociator und Disaggregation System.
    1. Legen Sie die Disaggregation Rohr in das zelluläre Dissociator, wählen Sie das Programm "Tumor _02_02" und drücken Sie auf Start und laufen für 32 Sekunden. Übertragungsrohr an Rotator, in 37 ° C Inkubator für 40 min.
    2. Zentrifuge suspendiert-Zellen bei 150 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. Während die Zellen zentrifugiert, Reagenzien für die Verarbeitung der Zellsuspension auf. 10 ml Serum-freien NBM und sanft verreiben Suspension.
    3. 30 x 10 6 lebende Zellen (~ 0,3 ml) - ein Zellpellet ~ 10 enthält Nach der Zentrifugation erhalten. Re-suspendierte das Pellet in 10 ml Serum-freien NBM (siehe Abbildung 2 O). Bestimmen Sie die lebenden Zellen durch Ausschluss-Assay (siehe Schritt 3.2.2).

3. Microtumor-Generation

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Bereiten Sie komplette NBM wie in 1.1.4 und bereiten neutralisierten High Density menschlichen Biogel (HuBiogel) (HDHG bei 3 mg / ml) pro internes Protokoll. Ähnliche Biogel Matrizen können ebenfalls verwendet werden.
  2. Microtumor Produktion und Kultur
    1. Erhalten Sie frisch gewonnenen PDX-Zellen als Einzelzellsuspension in Voll-NBM, auf Eis.
    2. Mischen Sie die Zelle suspension mit einem gleichen Volumen von Trypan - Blau - Lösung (0,4% in PBS) und zu analysieren Hämozytometer unter Verwendung von 18 Zellzahl und Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt werden . Entfernen notwendige Volumen 50.000 Zellen zu erzeugen / microtumor wo Volumen = (50.000 Zellen / Tumor * # Tumoren) / (Lebendzellzahl / 1 ml) und in einen frischen konischen Röhrchen.
    3. Konzentrat-Zellen durch Zentrifugation bei 150 xg für 8 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und Zellpellet mit eiskaltem HDHG Lösung in einem abschließenden Verhältnis von 1 Teil Zellen in FBS und 4 Teilen HDHG.
    4. Verwenden Sie eine elektronische Mehrkanalpipette 10 & mgr; l pro Pin zell HDHG Mischung auf einen 96-poligen Stahlplatte verzichtet werden (mit hydrophoben Beschichtung) microtumors (2 mm Perlen mit je 50.000 Zellen) zu erzeugen.
    5. Legen Sie 3D - Tumor Perlen innerhalb Gewebekultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, befeuchtete) für 15 min um die Perlen zu gelieren.
    6. Nach dem Gelieren, übertragen Sie die microtumors (10 μl) zu einer benutzerdefinierten Suspensionskulturkammer (50 ml) oder große Volumen Kulturschale (10 cm) mit vollständigen NBM mit Hilfe des elektronischen Mehrkanalpipette und benutzerdefinierte Pin-Gerät;.
    7. Nach 1 - 2 Tage in Kultur Inkubator Gewebe übertragen microtumors auf 96-Well-Kulturplatten 50 ul NBM / Vertiefung mit einem Weithals Pipette enthält Abgabe und verschiedene Assay und Analyseprotokolle durchführen.
  3. Medikamentöse Behandlung und Pflege von microtumors
    1. Wählen Sie Endkonzentrationen für Drogentests.
      HINWEIS: Wenn die Wirksamkeit von Medikamenten in 2D Kultur, wählen Sie 2x die IC 50 als die mittlere Dosiskonzentration bekannt ist , und wählen Sie 3-fach Reihenverdünnungen oben und unten für insgesamt 5 Dosen. Wenn beispielsweise die IC 50 9 & mgr; M für das Medikament in 2D Kultur ist, wählen Sie 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM und 162 uM als Endkonzentration für Drogentests.
    2. Bereiten Sie 2x Medikamentendosierung Lösung in Voll-NBM von Dimethyl sulfoxide (DMSO) Lager. Verdünnte Dosierung Lösung in 1% DMSO Medium, das eine 5-Dosis, 3-fach serielle Verdünnung herzustellen.
    3. Je 50 ul Dosierungslösung zur microtumor auch 50 & mgr; l in Assay-Platten, die eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,5% zu erreichen. Wiederholen für jede Wiederholung (beispielsweise 4) bei jeder Arzneimitteldosis in 3.3.1 bestimmt.
    4. Aufrechterhaltung Kulturen in 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Gewebekultur - Inkubator mit 1 - 14 Tagen. Feed-Kulturen zweimal wöchentlich von Medien und Medikamentenlösung wie oben erfrischend.

4. Morphologische und phänotypische Analyse von Microtumors

  1. Bestimmen Sie die Zellmorphologie in microtumors unter Verwendung von Standard Lebendzellfärbung.
    1. Bereiten Sie 1 mM Lager von Calcein-AM in DMSO. Aliquotieren und bei -20 ° C.
    2. In gewünschten Intervallen Kultur (1, 7 und 14 Tage), fügen Calcein-AM-Lösung in PBS hergestellt (ohne Ca / Mg) auf 96-Well-Platte für 1 & mgr; M Endkonzentration.
    3. bebrüten20 min in einem 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator und Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 2X, 4X und 10X (Anregung: 450-490 nm Bandpass, Emission: 515 nm Langpass dichroitische 500 nm) .
  2. Microtumor Wachstum / Proliferation Assay
    1. Löse MTT Pulver in PBS (ohne Ca / Mg) 12 mM Lager vorzubereiten. Sterilfilter, aliquoten, und bei -20 ° C.
    2. Bei gewünschten Kultur Intervallen (1, 7 und 14 Tage), fügen Sie 20 ul MTT-Lösung auf 96-Well-Platte pro 100 & mgr; l Kulturvolumen. Inkubieren 2 Std in Gewebekultur-Inkubator.
    3. Bereiten Sie frische Lyselösung von 10% SDS in 0,01 M HCl und fügen Sie die gleiche Menge an Kulturvolumen zu den Platten. versiegelten Platten Inkubieren über Nacht in 37 ° C Inkubator.
    4. Lesen Sie die Absorption bei 570 nm eine Mehrplattenleser.
  3. Microtumor Vorbereitung für Kinomic Analyse
    1. Bereiten Lysepuffer durch Vorkühlen auf 4 ° C und dann Zugabe einer 1: 100-Verhältnis von jedem 100x Protein Phosphataseinhibitor (PPI) und 100x Protein Protease-Inhibitor (PI). Gut mischen und auf Eis halten.
    2. Transfer 2 microtumors jedem von drei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Überstand entfernen und werden 40 & mgr; l Lyse-Puffer, der PPI und PI in jedes Röhrchen und lysieren, für 30 min bei 4 ° C.
    3. Pipette Proben kräftig Tumor Perlen zu brechen. Zentrifuge bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C und Proben bei -80 ° C bis kinomic Analyse.

5. Kinomic Profilieren von Microtumors

  1. Protein - Tyrosinkinase (PTK) Profilierungs
    1. Thaw Reagenzien (10x Protein Kinase (PK) Puffer und 2% Rinderserumalbumin (BSA)) bis 4 ° C Last PK - Puffer (300 ul 10x PK Puffer Lager in 2,7 ml dH 2 O) in die Spritze in die Position # 2 auf der Profilierung Plattform.
    2. Öffnen Sie die Kinase-Assay-Software-Programm und laden Sie die PTK-Protokoll-Datei und klicken Sie auf "START", mit Anmerkungen versehen Proben innerhalb Softwsind Programm nach dem Scannen Chips. Platz Chips auf Profilierungsplattform und Last 25 ul 2% Rinderserumalbumin (BSA) pro Array und dann LOAD drücken Sie die softwaregesteuerte Protokoll Blockierungsschritt zu beginnen.
    3. Verdünnen 6 uM 100 mM ATP Lager mit 54 & mgr; l dH 2 O 10 mM Adenosintriphosphat (ATP) zu machen. Wenn die Software die 3. beginnt und letzten Waschschritt (auf dem Bildschirm sichtbar) bringen 15 ug Lysat bis 28 & mgr; l mit dH 2 O gebracht, mischen und zu Array hinzufügen.
    4. Bereiten Sie PTK Master-Mix (MM) (für bis zu 12 Proben). Hinzufügen 32,6 & mgr; l dH 2 O zu rekonstituieren Dithiothreitol (DTT) und füge 6 ul DTT und 60 ul 10x - PK - Lösung zu PTK-MM1 Rohr (bereits 60 & mgr; l 10x BSA enthält).
    5. Warten Sie, bis "Load" Eingabeaufforderung in der Kinase-Assay-Software erscheint dann fügen Sie 126 ul von PTK-MM1, 60 ul PTK Additiv und 60 & mgr; l 10 mM ATP zu MM2 (enthält aliquotiert zuvor 4,5 ul PY20 FITC-Antikörper) und mischen.In 16 ul dieser PTK Master-Mix zu jedem Probenlysat Röhrchen und Pipette Mischung 5 mal.
    6. Stellen Sie sicher, Deckglas sauber ist und fügen Sie dann 35 ul Lysat / Master-Mix pro Array, in der Nähe Karussell Deckel und drücken Sie LOAD-Taste.
  2. Serin / Threonin - Kinase (STK) Profilierung:
    1. Auftau-Reagenzien (10x PK-Puffer, 10x STK-Puffer und 2% BSA) auf 4 ° C. Last PK - Puffer (300 & mgr; l in 2,7 ml dH 2 0) in die Spritze Position # 1, 1:10 und STK - Puffer (300 & mgr; l in 2,7 ml dH 2 0) in die Spritze Position # 2.
    2. Öffnen Sie die Kinase-Assay-Computer-Software-Programm und laden Sie die STK-Protokoll-Datei und drücken Sie START, mit Anmerkungen versehen Proben innerhalb des Programms nach dem Scannen Chips. Platz Chips auf Profilierungsplattform und Last 25 ul 2% BSA pro Array und dann LOAD drücken Sie die softwaregesteuerte Protokoll Blockierungsschritt zu beginnen.
    3. Verdünnen 6 uM 100 mM ATP mit 54 & mgr; l dH 2 O. Während Finale (3.) Waschschritt Mix2 ug Lysat und bringen bis 32,6 & mgr; l mit dH 2 O, mischen und zu Array hinzufügen.
    4. Make STK Master - Mix: In 70 ul 10x PK STK-MM1 Rohr (enthält 7 ul 100x BSA), und fügen Sie dann 42 & mgr; l dH 2 O zu STK-MM1 Rohr.
    5. Warten Sie, bis "Load" Eingabeaufforderung in der Kinase-Assay-Software dann: In 18 ul 10 mM ATP zu STK-MM1 und fügen 9 ul MM1 zu jedem Probenlysat. Gut mischen.
    6. Stellen Sie sicher, Deckglas ist sauber und fügen Sie 35 ul Lysat / Master-Mix pro Array, in der Nähe Karussell Deckel und drücken Sie LOAD.
    7. Während Final (3.) Waschschritt Hinzufügen 1,05 ul STK-FITC sekundären Antikörper zu DMAB Rohr (enthält 3,03 ul STK primärer Antikörper - Mix), fügen 39,6 ul AB - Puffer zu DMAB, fügen 356,0 ul dH 2 O zu DMAB, 30 & mgr; l DMAB zu jedem Array hinzuzufügen, und drücken Sie LOAD .
  3. Analyse von Kinomic Daten 19,20
    1. Offene-Analyse-Software und laden Sie die Bildanalyse App. Select Bildordner barcodierte und zeitgestempelt ganze Reihe Bilder für PTK oder STK Daten, wählen Sie Artikelnummer angepasst Array-Layout-Datei (86312 für PTK und 87102 für STK) enthält, und die Last vorher Array Anmerkungsdatei erzeugt.
    2. Stellen Sie sicher, korrekte Rasterung aller Bilder und laufen Belichtungszeit App Skalierung. Statistisch gesehen vergleichen Exposition / Steigung log2 transformierten Werte und 19-21 mit Vorwäsche Kinetikkurven validieren.
    3. Führen Sie Upstream - Kinase - Vorhersage - Software veränderte kinomic Profile zwischen den Bedingungen für die Upstream - Kinasen 22,23 abzufragen.

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Ergebnisse

Wir haben gezeigt, dass 3D-Biogel Kultursystem langfristige Wachstum und die Funktion von mehreren Zelltypen unterstützt. In diesem Verbundprojekt, Patienten stammenden GBM xenolines (PDX) werden zur Herstellung von Hunderten von microtumors verwendet. Dissociated Zellen (3 x 10 5) oder Neurosphären (40 - 50) wurden in Biogel Perlen (2 mm) eingebettet und nach dem schnellen Gelieren sie kultiviert werden in einem NB-Medium gefüllt benutzerdefinierte Bioreaktor. Die Lebensfähig...

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Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls betreffen überwiegend Generation zu microtumor sowie Medikamentendosierung und Wartung. Da die microtumor Perlen zerbrechlich sind und leicht zerrissen, ist äußerste Sorgfalt in den beiden Entwicklungsstadien eines Tests und Wartung erforderlich. Wenn ein Fehler während einer dieser Prozesse auftritt, kann experimentell Interpretation beeinträchtigt werden, was zu Nebenstelle oder eine unnötige Wiederholung der Experimente oder sogar Ausschluss von Daten.

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Offenlegungen

R.S. und R.S.S. sind Mitarbeiter von Vivo Biosciences. J.C.A. wird teilweise durch den UAB Kinome Core finanziert.

Danksagungen

Unterstützt von NIH R21 Zuschuss (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor SPORE Auszeichnung (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) und SBIR Vertrag (PI: R. Singh, N43CO-2.013-00.026).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kollagenase-I Sigma-AldrichCO130
Trypsin EDTA (10x)Invitrogen15400-054 
Neurobasal-ALife Technologies10888-022
N-2 SupplementLife Technologies17502-0481x Endkonzentration
B-27 Supplement ohne Vitamin ALife Technologies12587-0101x Endkonzentration
Rekombinant Human FGF-basicLife TechnologiesPHG026610 ng/ml Endkonzentration
Rekombinante humane EGFLife TechnologiesPGH031510 ng/ml Endkonzentration
L-GlutaminCorning Cellgro Mediatech25-005-CI2 mM Endkonzentration
FungizoneOmega ScientificFG-702,5 µ g/ml Endkonzentration
Penicillin StreptomycinOmega ScientificPS-20100 U/ml Penicillin G, 100 & Mikro; g/ml Streptomycin Endkonzentration
GentamicinLife Technologies15750-06050 ng/ml Endkonzentration
MTTLife TechnologiesM6494hergestellt auf 5 mg/ml in PBS und steril filtriert, 1 mg/ml in
Vertiefung SDSFisherBP166für MTT-Lysepuffer, hergestellt auf 10 % in 0,01 μm; M HCl, 5% in
Vertiefung HClFisherA144SI-212für MTT-Lysepuffer, vorbereitet auf 0,01  M mit SDS, 5 mM in der Vertiefung
Calcein AMLife TechnologiesC14301 mM in DMSO-Lager, 2  &Mikro; M in PBS-Färbelösung, 1  &Mikro; M in gut
Halt' s Protein Phosphatase Inhibitor Cocktail Pierce ThermoScientific78420Verhältnis 1:100 in MPER 
Halt's Protein-Protease-Inhibitor Pierce ThermoScientific87786Verhältnis 1:100 in MPER
Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen (MPER)Pierce ThermoScientificPI78501
TrypanblauPierce ThermoScientific15250-061
DMSOFisherBP231zum Auflösen von Calcein AM & Verbindungen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca/MgLonza17-517Qverdünnt auf 1x mit MiliQ Reinstwasser und steril filtriert (für Zellkultur)
Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Ca/MgCorning Cellgro Mediatech20-030-CVverdünnt auf 1x mit MiliQ Reinstwasser (für die Vorfixierung)
10% neutral gepuffertes FormalinProtokoll032-060
Trypan BluePierce ThermoScientific15250-061
HubiogelVivo BiosciencesHDHG-5
Halt's Protein PhosphataseInhibitor Pierce78420
Halt's Protein Protease InhibitorPierce87786
Reagenz zur Extraktion von Säugetierproteinen (MPER)Thermo Scientific78501
Protein-Tyrosinkinase (PTK) Array Profiling ChipPamGene86312
PTK-Kinase-PufferPamGene36000300 µ l 10x PK Pufferlager in 2,7  ml dH2O, Katalognummer für PTK-Reagenzkit
ATPPamGene36000Katalognummer für PTK-Reagenzienkit
PY20- FITC-konjugierter AntikörperPamGene36000Katalognummer für PTK-Reagenzkit
PTK AdditivePamGene32114
PTK-MM1 Röhrchen (10x BSA)PamGene36000Katalognummer für PTK-Reagenzienkit
Serin/Threonin-Kinase (STK) Array Profiling-ChipPamGene87102
STK-Kinase-PufferPamGene32205Katalognummer für STK-Reagenzienkit
STK Primary Antibody Mix (DMAB-Röhrchen)PamGene32205Katalognummer für STK-Reagenzkit
FITC-konjugierter SekundärantikörperPamGene32203
STK-MM1 Röhrchen (100x BSA)PamGene32205Katalognummer für STK-Reagenzienkit
STK AntikörperpufferPamGene32205Katalognummer für STK-Reagenzienkit
Ausrüstung
#11 Klingen, sterilFisher3120030
#3 Skalpellgriffe, sterilFisher08-913-5
100 mm Petrischalen aus GlasFisher08-748D
Halbgebogene PinzetteFisher12-460-318
TrypsinierkolbenFisher10-042-12B
MagnetrührerFisher14-490-200
3/4" RührstabFisher14-512-125
B-D ZellsiebFisher#352340
B-D 50 ml ZentrifugenröhrchenFisher#352098
PamStation 12PamGene
BioNavigator 6.0 kinomische Analysesoftware PamGene
Evolve Kinase Assay SoftwarePamGene
UpKin App Software (Upstream-Kinase-Vorhersage)PamGene
gentleMACS DissoziatorMiltenyi Biotec130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS)SyntheconRCCS-Dmit 10 ml Einweg-HARV
, ,

Referenzen

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
  16. Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , 7727550 B2 (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388(2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267(2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

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