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Methodenartikel

Biolumineszenz-Bildgebung zur Erkennung von Late Stage-Infektion der afrikanischen Trypanosomiasis

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DOI:

10.3791/54032

⸱

18. Mai 2016

 , 
1Department of Infection and Immunity, London School of Hygiene & Tropical Diseases

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung eines biolumineszierenden Stammes afrikanischer Trypanosomen, um die Verfolgung von Infektionen im Spätstadium zu ermöglichen, und zeigt, wie in vivo Live-Bildgebung verwendet werden kann, um Infektionen im zentralen Nervensystem in Echtzeit zu visualisieren.

Zusammenfassung

Humane afrikanische Trypanosomiasis (HAT) ist eine mehrstufige Krankheit, die sich in zwei Stadien manifestiert: ein frühes Blutstadium und ein spätes Stadium, in dem der Parasit in das zentrale Nervensystem (ZNS) eindringt. In-vivo-Studien im Spätstadium waren bisher begrenzt, da traditionelle Methoden die Entfernung des Gehirns erfordern, um das Vorhandensein der Parasiten zu bestimmen.

Biolumineszenz-Bildgebung ist eine nicht-invasive, hochempfindliche Form der optischen Bildgebung, die die Visualisierung eines Luciferase-transfizierten Erregers in Echtzeit ermöglicht. Durch die Verwendung eines transfizierten Trypanosomenstammes, der in der Lage ist, bei Mäusen eine Krankheit im Spätstadium hervorzurufen, sind wir in der Lage, die Kinetik einer ZNS-Infektion bei einem einzelnen Tier im Verlauf der Infektion zu untersuchen sowie die Bewegung und Ausbreitung einer systemischen Infektion zu beobachten.

Hier beschreiben wir ein robustes Protokoll zur Untersuchung von ZNS-Infektionen unter Verwendung eines Biolumineszenzmodells der afrikanischen Trypanosomiasis, das nicht-invasive Beobachtungen in Echtzeit liefert, die mit optionalen Downstream-Ansätzen weiter analysiert werden können.

Einleitung

Humane afrikanische Trypanosomiasis (HAT) oder Schlafkrankheit wird durch die vektorübertragenen Protozoen-Parasiten des Trypanosoma brucei spp1 verursacht. Die geschätzte Zahl der aktuellen Fälle liegt bei weniger als 7.000 pro Jahr, wobei fast 70 Millionen Menschen auf dem afrikanischen Kontinent dem Risiko einer Parasiteninfektion ausgesetzt sind. Die Krankheit, die unbehandelt meist tödlich verläuft, umfasst ein frühes hämolymphhatisches Stadium, in dem Parasiten im Blut vorhanden sind, und ein Stadium, in dem Parasiten in das späte Stadium übergehen, in dem Parasiten in das Zentralnervensystem (ZNS) eindringen und nicht mehr anfällig für eine Behandlung mit trypanosomalen Arzneimitteln im Frühstadium sind2. Die derzeitigen medikamentösen Therapien für HAT im Spätstadium weisen sowohl komplexe, langwierige Behandlungsschemata und schwere Nebenwirkungen als auch berichtete Resistenzen auf, weshalb die Erforschung neuer medikamentöser Therapien unerlässlich ist3,4.

Die Untersuchung der humanen afrikanischen Trypanosomiasis (HAT) im Spätstadium in traditionellen Mausmodellen ist langwierig und komplex, wobei die Entfernung von Hirngewebe erforderlich ist, um die parasitäre Belastung zu überwachen5. Als Studienmodell für Trypanosomiasis wird der tierische infektiöse Stamm T. b. brucei verwendet, wobei das Spätstadium 21 Tage nach der Infektion (dpi) auftritt. Um die nicht-biolumineszierende Parasiteninfektion des Wildtyps im Mausmodell zu überwachen, sind periphere Blutfilme oder quantitative PCR die einzigen Methoden, um die Parasitenlast zu bestimmen. Für die Parasitenbelastung im Gehirn muss die Maus gekeult, das Gehirn herausgeschnitten und eine qPCR am Gewebe durchgeführt werden, was es unmöglich macht, Parasiten über mehrere Zeitpunkte im Spätstadium der Infektion zu verfolgen. Dies führt dazu, dass Infektionen im Zentralnervensystem (ZNS) nicht in Echtzeit verfolgt werden können.

In vivo Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) kann einen hochsensitiven, nicht-invasiven Nachweis der Parasitenverbreitung und des Krankheitsverlaufs in einem Mausmodell ermöglichen, der an einem einzigen Tier während des gesamten Experiments verfolgt werden kann6. BLI basiert auf der Emission von Licht im sichtbaren Spektrum, die durch eine Luciferase-katalysierte Reaktion erzeugt wird. Die emittierten Photonen werden dann von einer CCD-Kamera (Charge Coupled Device)7 detektiert. Zu diesem Zweck wird der Erreger genetisch so verändert, dass er ein Luciferase-Protein exprimiert, und das Substrat Luciferin wird zu interessierenden Zeitpunkten durch Injektion eingebracht. Der Hauptvorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, Längsschnittstudien durchzuführen, bei denen dasselbe Tier mehrmals mit minimalen Nebenwirkungen abgebildet werden kann. Das erfasste Biolumineszenzsignal kann quantifiziert werden und somit auf die Erregerlast hinweisen.

Die Optimierung und Validierung eines rotverschobenen biolumineszierenden T. b. brucei hat die Untersuchung der Infektion im Spätstadium durch nicht-invasive Verfahren ermöglicht, Parasiten früher als die Blutfilmmikroskopie erkannt und den Zeitaufwand, die Kosten und die Anzahl der Tiere, die für die Untersuchung der ZNS-Infektion und das Wirkstoffscreening bei Trypanosomiasis im Spätstadium benötigt werden, erheblich reduziert8,9. In diesem Protokoll zeigen wir die Infektion von Mäusen mit biolumineszierenden Trypanosomen und wie die Parasiten dann in vivo sichtbar gemacht werden können, um das Fortschreiten der Krankheit und die ZNS-Penetration zu quantifizieren.

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Protokoll

Ethik
Alle Arbeiten wurden im Rahmen der Genehmigung der britischen Home Office Tiere durchgeführt (Scientific Procedures) Act 1986 und der London School of Hygiene & Tropical Medicine Tierschutz und Ethik Review Board. ANKOMMEN Leitlinie werden in diesem Bericht folgt.

1. In - vivo - Passage von Biolumineszenz Trypanosoma brucei brucei

  1. Entfernen eines kryokonservierten Lager (genannt Stabilat) von T. b. brucei Stamm GVR35-VSL-2 (erhältlich von Professor John Kelly an der London School of Hygiene & Tropical Medicine durch MTA) 9 aus flüssigem Stickstoff und auf Raumtemperatur äquilibrieren. Verdünnte Stabilat bis 2 x 10 4 Trypanosomen / ml in steriler Phosphat - gepufferter Glukosesalzlösung (PBS-G) pH 8,0 (1 l PBS + 15 g Glucose) 10.
    Anmerkung: T. b. brucei GVR35-VSL-2 ist nicht infektiös für den Menschen und erfordert SAPO Einrichtungen lizenziert Experimente durchzuführen.
  2. inject 20-25 g weiblichen CD1-Maus mit 0,2 ml Trypanosomen über die intraperitoneale Injektion (ip) mit einer 25 G-Nadel verdünnt. Dies ist der "Spendermaus". Legen Sie die infizierte Maus in eine spezifische pathogenfreie (SPF) -cage und Futter ad libitum.
    Hinweis: CD1 - Mäuse sind ein Auszucht Stamm und T. b. brucei GVR35 - Infektionen sind in diesem Stamm gut charakterisiert. Jedoch ist dieses Protokoll auch für angeboren oder genetisch veränderte Stämme, aber es ist wichtig , dass die Fellfarbe zu beachten , kann auf die Empfindlichkeit der Bildgebung 6,9 auswirken.
  3. Überwachen peripheren Parasitämie durch Blutentnahme. Platzieren Sie die Maus in eine Plastik Verzögerer und nehmen 5 ul Blut aus dem Schwanz von venepuncture mit 21 G-Nadel oder Aderlässe und mischen 1/10 mit 0,85% sterilem Ammoniumchlorid roten Blutkörperchen zu lysieren und einfacher Zählung ermöglichen.
  4. Zählen Sie die verdünntes Blut in einer Neubauer-Zählkammer.
    1. Legen Sie das verdünnte Blut in beiden Kammern. Zählen Sie die gesamte zentrale grID von einer Kammer zu geben n Trypanosomen. Konzentration von Trypanosomen in Blut = n x 10 4 Trypanosomen / ml, für jede Verdünnungsfaktor einzustellen und die Mittel der beiden Kammern berechnen.
      Hinweis: Nach ca. 5-7 Tage nach der Infektion sollte peripheren Parasitämie steigen ausreichend um eine Infektion bei einer Konzentration von 2 x 10 4 Trypanosomen / ml durchzuführen.
  5. Wenn Trypanosomen ist hoch genug für die Anzahl der Mäuse erforderlich, bewegen sich auf 1,6 zu treten. Ein Parasitämie Niveau von 6 x 10 4 Trypanosomen / ml in einer Spendermaus ist für die Infektion von 10 Mäusen ausreichend.
    Hinweis: Für die statistisch signifikante Gruppengrößen, n = 6 für jede Behandlungsgruppe von Mäusen werden 8 benötigt. Für andere Modelle der Infektion, müssten Leistungsberechnungen angewandt werden, um geeignete Gruppengrößen zu bestimmen.
  6. Ort Mäuse in einem Wärmefeld (bei 28-30 ° C für etwa 5-10 min) die Schwanzvenen zu erlauben, zu dilatieren.Zur Auslösung einer Klemme Narkose verabreichen 20 mg / kg Pentobarbital iv mit einer 25 G-Nadel. Bestätigen Sie die Maus wird durch sanftes Drücken der Fußballen narkotisiert, um sicherzustellen, gibt es keine Rückzugsreflex ist.
  7. Heparinisierung eine 21 G Nadel durch Aliquotieren 5 ml Heparin bei 5000 USP-Einheiten / ml in einem Bijou Rohr und Saugen zweimal in die und aus der Nadel in eine 1 ml Spritze befestigt.
  8. Nehmen Sie die heparinisierte 21 G Nadel und 1-ml-Spritze und führen Herzpunktur auf der narkotisierten Passage Maus durch die Nadel mittig unter dem Brustkorb eingefügt (eine Perle von Blut wird in der Basis des Nadel Pool) und ziehen Sie vorsichtig zurück auf den Kolben um nicht die Kammer des Herzens zu kollabieren. Sammeln Sie ein Minimum von 0,7 ml Blut.
  9. Verdünnte infiziertem Blut ein Inokulum von 2 x 10 4 Trypanosomen / ml in PBS-G pH 8,0 als Schritt 1.1 oben zu erzeugen.
    Hinweis: An dieser Stelle kann das restliche Blut kryokonserviert werden Stabilat herzustellen, indem man mit 8% Glycerin mischen, 20% hitzeinaktiviertem fötalen calf Serum (hallo-FCS) und 72% infiziertem Blut. Langsam bei -80 ° C einfrieren ein langsam einfrieren Behälter mit einer Kühlrate von 1 ° C / min zu erreichen, bevor sie mit flüssigem Stickstoff übertragen.

2. Infektion von Versuchsmäusen

  1. Platzieren CD1 weibliche Mäuse (~ 21-25 g) in einen Heizkasten sanft warmen Venen zu dilatieren. Legen Sie die erwärmte Mäuse in eine Plastikstütze und injizieren 0,2 ml verdünnte Inokulum intravenös mit einer 25 G-Nadel in die Schwanzvene, das entspricht 4000 Trypanosomen pro Maus. Platzieren Druck an der Injektionsstelle danach die Blutung einzudämmen.
    Hinweis: Die intraperitoneale Infektion eine gültige Route der Infektion und wurde in früheren Studien verwendet worden , 10, aber wir haben festgestellt , diese weniger reproduzierbar als intravenöser Applikation.
  2. Randomize infizierten Mäusen und Käfig in Gruppen von 3 in SPF-belüftete Käfige. Als Kontrolle injizieren CD1 weibliche Mäuse mit Wildtyp nicht Biolumineszenz - Parasiten, T. b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Überwachen Sie die Infektion durch Blut Film Mikroskopie
    1. Spot 5 ul Blut aus venepuncture oder Aderlässe auf einen Glasträger und führen Sie einen Blutabstrich (mit einem zweiten Glasträger vorsichtig die Tropfen Blut schieben über die Rutsche einen dünnen Film zu erzeugen). Lassen Sie Folien an der Luft trocknen.
    2. Befestigen Sie den Blutabstrich mit 100% Methanol und Fleck mit Giemsa für 10 Minuten , bevor sie mit dH 2 O gespült und an der Luft trocknen lassen . Unter 100X Ziel zählen die Anzahl der Trypanosomen in 10 Bereichen (FOV).
      Hinweis: Blutdreharbeiten wird neben ganzen Tier nicht-invasive Bildgebung bereits einen Tag nach der Infektion durchgeführt. Wenn eine Anzahl von Tieren Verarbeitung dieses Verfahren der Trypanosomen Quantifizierung über Hämozytometer Zählen bevorzugt, da die Proben können später bei Raumtemperatur und gezählt gespeichert werden.

3. Biolumineszenz Imaging-Infektion zu verfolgen

Hinweis: Um die Infektion zu überwachen, ganze animal nichtinvasive Bildgebung verwendet werden.

  1. Vorbereitung einer Stammlösung von D-Luciferin, das Glühwürmchen-Luciferase-Substrat, in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) bei 30 mg / ml. Filter sterilisieren und in Aliquots bei -20 ° C einfrieren.
    Hinweis: D-Luciferin Licht empfindlich ist, daher schützen sie vor Licht von Aliquoten in Folie gewickelt wird. Nicht wiederholt Frost-Tau - Luciferin , wie es 11 - Aktivität beeinflussen können.
  2. Wärmen eines Aliquots von D-Luciferin auf Raumtemperatur. Entfernen Sie jede Maus aus dem Käfig (einschließlich Kontrollmäuse infiziert mit nonbioluminescent Stamm Wildtyp-Parasiten) und injizieren 150 mg / kg des erwärmten D-Luciferin (verdünnt in DPBS) intraperitoneal mit einer 25 G-Nadel. Legen Sie die Mäuse in eine Isofluran Kammer für ca. 5 min zu induzieren Anästhesie mit 2% Isofluran / O 2 Mix bei 2,5 l / min.
    Hinweis: Die Mäuse werden unbeweglich, wenn sie unter Narkose sind. Für den Bildaufnehmer hier verwendet, 3 Mäuse können gleichzeitig verarbeitet werden. Wenn Mäuse sind anesthetized länger als 30 min, können ophthalmische künstliche Tränen Salbe angewendet werden, um die Augen der Mäuse verhindert das Austrocknen.
  3. Verwendung der Software gemäß den Anweisungen des Herstellers für den Imager hier beschrieben, die Software öffnen und die Maschine zu initialisieren. Erwerben Sie Bilder einmal Kamera und beheizte Plattentemperatur erreicht haben.
    Hinweis: Dieses Gerät nicht in der Regel ausgeschaltet ist, so dass die Maschine über Nacht Hintergrund Kalibrierungen durchzuführen. Für den Fall, dass es neu gestartet werden muss, es muss eine Überprüfung der Kalibrierung laufen zuerst.
  4. Legen Sie die narkotisierten Mäusen in den Imager (siehe 3.5). Verwenden Sie große schwarze Trennzeichen zwischen den Mäusen zu minimieren bluten durch jedes helle Biolumineszenz-Signal. Bild Mäuse eine Reihe von Belichtungszeiten; 1, 3, 10, 30, 60 und 180 Sekunden, mit mittlerer Binning, 1 f / stop und einem offenen Filter und Sichtfeld E (12,5 x 12,5 cm 2).
    Hinweis: Die Kontrollmäuse infiziert mit den Wildtyp-nonbioluminescent GVR35 Parasiten bieten eine background Biolumineszenz Wert. Aus einem Luciferin Kinetik Experiment (Abbildung 6) mit diesem Modell haben wir die Biolumineszenz Signalspitzen bei 10 Minuten nach der Verabreichung und Imaging dauert ca. 5 min für 3 Mäuse gefunden. Nehmen Sie diesen Zeitplan in Betracht, wenn anesthetizing und Abbilden der Mäuse.
  5. Um sicherzustellen, gründliche Abbildung der Mäuse, drehen einen ventralen, dorsalen und Seitenansicht zu erhalten. Pflegen Sie die Konsistenz in der Reihenfolge der Orientierung für die Bildgebung zwischen aufeinanderfolgenden Tieren.
  6. Nach der Bebilderung erlauben Mäuse aus der Narkose unter Beobachtung zu erholen, bevor zu SPF-Käfig zurück.
  7. Weiter Mäuse Bildgebung alle 7 Tage bis zum Tag 21 nach der Infektion. Es sollte eine stetige Zunahme der Biolumineszenz-Signal über das gesamte Tier sein.
  8. Bei D21, Bild und Blut Film die Mäuse wie oben beschrieben, und der Dosis-Mäuse mit 40 mg / kg Diminazen aceturat intraperitoneal. Dieses Medikament wird die periphere Parasitämie klar, aber das Blut-brai nicht überquerenn-Schranke und ermöglicht somit eine bessere Visualisierung der ZNS-Infektion.
    Hinweis: Diminazen aceturat ist ein gut etabliertes Medikament zur Frühstadium nagana behandeln.
  9. Weiter Bildgebung und Überwachung bei D28 und D35.

4. Bestätigen ZNS-Infektion

  1. Bei D35, Bild Mäuse wie oben beschrieben (Schritte 3,1-3,4).
  2. Nach der Bebilderung erlauben Mäuse aus der Narkose und exsanguinate Mäuse in so detailliert Schritt 1,6-1,8, das Sammeln zur weiteren Analyse Blut zu erholen.
  3. Nach Herzpunktur, perfuse Mäuse, die mit 20 ml PBS (optional: add 3 mg / ml Luciferin zu Perfusionslösung) über das Herz das Blut aus den Organen zu löschen und Luciferin Etikett wieder einführen, die aus der Region des Gehirns über das Zeitintervall gelöscht haben könnte aus Schritt 4.1.
  4. Vorsichtig in das Gehirn zu entfernen, die durch gekrümmte Schere, die um den Umfang des Schädels von der Basisschneiden und das Oberteil des Schädels Abhebens, das Gehirn zu ermöglichen,sanft herausgehoben mit einer gebogenen Pinzette werden.
  5. Legen Sie das ausgeschnittene Gehirn auf einen Abschnitt aus schwarzem Kunststoff und Pipette 50 ul 15 mg / ml Luciferin über das Organ vor der Bildgebung, um sicherzustellen, ausreichende Luciferin hat ausgeschnittenen Gehirn hinzugefügt. Bild die Einstellungen wie oben. Dies wird die Lokalisierung der Infektion zu den Gehirnhälften demonstrieren.
    Hinweis: Downstream Quantifizierung von Parasitämie am exzidiert Gehirn kann durch qPCR , durchgeführt werden , wie zuvor 8 beschrieben. Andere alternative Downstream-Anwendungen könnte Histologie oder Immunhistochemie umfassen Parasiten im Hirngewebe folgenden Fixierung zu identifizieren.

5. Die Quantifizierung der Biolumineszenz-Bildgebung

Hinweis: Die Biolumineszenz quantifiziert werden können, die Region von Interesse (ROI) mit der Bildverarbeitungssoftware und für die Hintergrund Biolumineszenz korrigiert.

  1. den ROI-Tool verwenden, erstellen Sie einen rechteckigen ROI für ganze Tier Quantifizierung einnd positionieren sie über die Maus Bild der Nasenspitze zur Basis des Schwanzes der Maus zu decken. Verwenden Sie die gleiche Größe Box für jedes Tier und jeden Zeitpunkt. Bei der Betrachtung der ROI für das Gehirn suchen, verwenden Sie einen kreisförmigen ROI in der gleichen Art und Weise, sie über die Maus Kopfbereich in die Bildposition.
  2. Falls gewünscht, einstellen Bilder auf dem gleichen Spektrum für eine visuelle Darstellung der Infektion zu erscheinen.
    Hinweis: Die Software, die hier erzeugt eine Farbkarte für jedes Bild automatisch angepasst für minimale und maximale Photonenzählungen. Um einen visuellen Vergleich zwischen einer Reihe von Bildern zu ermöglichen, die Farbskala muss für alle Bilder auf die gleichen Werte eingestellt werden.
    1. Mit dem Bild mit der höchsten Biolumineszenz und der "Bild anpassen" Registerkarte auf der Werkzeugpalette, wählen Sie eine logarithmische Skala und eine entsprechende Farbskala Minimum und Maximum (empirisch ermittelt werden). Wenden Sie diese Skala auf alle Bilder während des gesamten Experiments.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll zeigt , wie Krankheitsprogression nach einer Infektion von Mäusen mit T. folgen b. brucei, ein Modell für die afrikanische Trypanosomiasis. 1 , die die Zeitleiste des Versuchsprotokoll zeigt, den Zeitplan für die Behandlung und Imaging - Schritte zeigt, Fig . 2 eine typische Sichtfeld in einer festen Giemsa-gefärbten Blutausstrich zeigt , verwendet periphere Parasitämie quantitativ zu bestimmen, mit Try...

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Diskussion

Die Entwicklung eines biolumineszenten T. b. brucei GVR35 Stamm ermöglicht die Visualisierung eines Trypanosomeninfektion von den frühen bis späten Stadium. Zurück Infektionsmodellen konnten die späten Stadium zu erkennen, wenn Parasiten im Gehirn, in Echtzeit aus dem Blut Film Mikroskopie sind und erforderlich , um die Keulung und Beseitigung von Gehirnen von der infizierten Mäuse Parasitenlast 12 zu bestimmen. Die Biolumineszenz reduziert inter Maus Variabilität als eine einzige Maus kann über die ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken John Kelly und Martin Taylor (London School of Hygiene & Tropical Medicine) für T. Bereitstellung b. brucei GVR35-VSL-2 und Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) für die Beratung über in - vivo - Bildgebung. Diese Arbeit wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation Global Health Program (Grantnummer OPPGH5337) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PBSSigma, UKP4417Tabletten pH 7,4
GlukoseSigma, UKG827099,5 % (molekular
Qualität AmmoniumchloridSigma, UKA943499,5 % (molekular
Qualität Heparin (Lithiumsalz)Sigma, UKH0878
Hi-FCSGibco, Life Technologies, UK10500-064500 ml
DPBSSigma, UKD4031Steril gefiltert
Mr. FrostyNalgene, UK
GiemsaSigma, UKG5637
D-LuciferinPerkin Elmer, UK
Sigma, UK115144-35-9
DiminazenaceturatSigma, UKD7770Analytische Qualität
IVIS Lumina IIPerkin Elmer, UKandere Bioimager erhältlich z.B. von Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2Perkin Elmer, UKproprietäre Software für Perkin Elmer IVIS-Instrumente; andere Instrumente können ihre eigene
1 ml SpritzeFisher Scientific, UK10142104
20 ml SpritzeFisher Scientific, UK10743785
25 g NadelnhabenGreiner Bio-oneN2516
21 G NadelnGreiner Bio-oneN2138
Twin-frosted ObjektträgerVWR, UK631-0117
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenStarLab, UKI1415-1000
7 ml Bijou RöhrchenStarLab, UKE1412-0710
Maus-RestrainerSigma, UKZ756903Unser Rückhaltesystem wurde im eigenen Haus hergestellt, dies ist ein ähnliches Modell
) )

Referenzen

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