Method Article

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

DOI:

10.3791/54055

⸱

May 13th, 2016

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

Abstract

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Die Dreistachliger Stichling Fisch hat sich als leistungsfähiges System entstanden, die genetische Basis einer Vielzahl von morphologischen, physiologischen und verhaltens Phänotypen zu untersuchen. Die bemerkenswert unterschiedlichen Phänotypen, die sich entwickelt haben als die Populationen im Meer zu unzähligen Süßwasser-Umgebungen anzupassen, kombiniert mit der Fähigkeit Meeres- und Süßwasserformen zu überqueren, bieten einen seltenen wirbel System, bei dem Genetik verwendet werden können genomische Regionen abzubilden Züge entwickelt steuern. Ausgezeichnete genomische Ressourcen sind ab sofort verfügbar, molekulargenetische Dissektion entwickelt Änderungen zu erleichtern. Während Kartierungsexperimente Listen interessante Kandidatengene erzeugen, sind funktionelle genetische Manipulationen erforderlich, um die Rolle dieser Gene zu testen. Die Genregulation können mit transgenen Reporter Plasmide und BACs integriert in das Genom untersucht werden, unter Verwendung des Tol2 Transposase-System. Funktionen von spezifischen Kandidatengene und cis - Aufsichtsrechtliche Elemente können durch Induktion gezielt beurteilt werdenMutationen mit TALEN und CRISPR / Cas9 Genome Editing Reagenzien. Alle Methoden erfordern Nukleinsäuren in befruchtete eine Zelle stickleback Embryonen Einführung machte eine Aufgabe, durch die dicke Chorion von stickleback Embryonen herausfordernd und die relativ kleinen und dünnen Blastomere. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Nukleinsäuren in stickleback Embryonen für transgene und Genombearbeitungsanwendungen beschrieben Genexpression und Funktion zu untersuchen, ebenso wie Techniken, um den Erfolg der Transgenese zu bewerten und stabile Linien wiederherzustellen.

Introduction

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Ein wesentlicher Bestandteil der das Verständnis, wie die biologische Vielfalt entsteht, wird die genetischen und entwicklungs Basen entwickelt phänotypische Veränderungen in der Natur zu bestimmen. Die Dreistachliger Stichling Fisch, Gasterosteus aculeatus hat als hervorragendes Modell entstand für die genetische Grundlage der Evolution zu studieren. Stichlinge haben viele adaptive evolutionäre Veränderungen erfahren , wie Meeresfische unzählige Süßwasser - Umgebungen auf der ganzen nördlichen Hemisphäre besiedelt haben, in dramatischen morphologischen resultierenden, physiologische und Verhaltensänderungen 1. Den Genomen von Individuen 20-1 stickleback Populationen sequenziert und zusammengesetzt wurden und eine hohe Dichte Kopplungskarte erzeugt wurde , um die Baugruppe 2,3 noch weiter zu verbessern. Die genetische Kartierung Experimente haben genomischen Regionen identifiziert entwickelt Phänotypen zugrunde liegenden 4 - 6, und in einigen Fällen haben die funktionelle Rolle von spezifischen Kandidatengene wurden 7,8 getestet. Eine Reihe von Genomregionen morphologischen Veränderungen zugrunde liegen , wurden mit vielversprechenden Kandidaten - Gene identifiziert, aber diese Kandidaten noch nicht funktionell 9 getestet - 12. Darüber hinaus Stichlinge sind gemeinsame Modelle für Untersuchungen der Populationsgenetik / Genomik 13,14, Speziation 15, Verhalten 1, Endokrinologie 16, Ökotoxikologie 17, Immunologie und Parasitologie 18 19. Zukünftige Untersuchungen in jedem dieser Felder wird von der Fähigkeit profitieren funktionelle genetische Manipulationen in sticklebacks auszuführen. Neben ihrer kodierenden Sequenzen zu manipulieren, können die Rollen von Kandidatengenen durch das Studium ihrer cis - Aufsichtsrechtliche Sequenzen und funktionell steigend, fallend oder Eliminierung der Expression des Kandidatengens zu beurteilen. Mikroinjektions und Transgene Methoden in Stichlinge sind gut 7,8,20 etabliert und wurden ursprünglich entwickelt , unter Verwendung einer Meganuclease-vermittelte21 Verfahren zuerst in Medaka 22 beschrieben. Das modifizierte Mikroinjektions hier vorgestellten Verfahren ist gleichermaßen für Tol2-vermittelte Transgenese optimiert und vor kurzem Genome Editing Reagenzien einschließlich Talens und CRISPRs entwickelt.

Änderungen an cis Aufsichtsrechtliche Elemente sind gedacht , um morphologische Entwicklung kritisch zu sein, als cis Aufsichtsrechtliche Veränderungen 23 die negativen pleiotrope Auswirkungen von Codierungs Mutationen vermeiden. Aus diesem Grund hat die Prüfung und den Vergleich mutmaßliche cis Aufsichtsrechtliche Sequenzen ein zentrales Ziel einer zunehmenden Zahl von Evolutionsstudien werden. Darüber hinaus sind die meisten Menschen eine Krankheit Varianten regulatorischen Varianten 24,25 und Modellwirbel Systeme sind sehr cis Aufsichtsrechtliche Element Funktion und Logik erforderlich , um zu studieren. Fische , die ihre Embryonen von außen in großer Zahl befruchten bieten leistungsstarke wirbel Systeme cis -Regelung zu studieren. Die Tol2 Transposon System, bei dem foreign DNA in das Genom integriert werden soll , wird flankiert von Tol2 Transposase Websites und Bindung koinjizierten mit Tol2 Transposase mRNA arbeitet, mit hoher Effizienz für die erfolgreiche Integration von Plasmid in Fisch - Genome - Konstrukte 26 - 28. Typischerweise wird ein potentieller Enhancer stromaufwärts von einem basalen Promotor kloniert (wie hsp70l 29) und fluoreszierendes Reportergens wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder mCherry in einem Tol2 Rückgrat und injizierte mit Transposase mRNA 26. Die Beobachtung der Expression des fluoreszierenden Reporter, entweder in injizierten Embryonen oder Nachkommen mit stabil integrierten Transgene, liefert Informationen über die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression durch die vermeintliche Enhancer angetrieben. In weiteren Experimenten validiert Enhancer verwendet werden gewebespezifische Überexpression von Genen von Interesse zu fahren.

Für die Analyse von größeren cis Aufsichtsrechtliche Regionen, hochwertige Großeinsatz genomic Bibliotheken bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) verwendet haben 30 für beide Meeres- und Süßwasser Stichlinge gebaut. Diese BACs kann recombineered ein Gen mit einem fluoreszierenden Reporter - Gen in Zusammenhang mit einer großen (150-200 kb) genomischen Region 31 zu ersetzen. Die fluoreszierenden Reporter wird dann in einem Raum-Zeit-Muster ausgedrückt als durch regulatorische Sequenzen innerhalb des BAC bestimmt. Für Studien in Fisch kann Tol2 Sites zur BAC hinzugefügt werden 32,33 genomische Integration zu erleichtern. In späteren Stadien der Entwicklung , wenn in situ Hybridisierung technisch anspruchsvoll ist, kann die Fluoreszenz Auslesen des BAC verwendet werden , um Muster der Genexpression zu untersuchen, wie sie für stickleback Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) 20 gezeigt. Zusätzlich können fluoreszierende Expressionsmuster in einem Individuum über die Zeit verfolgt werden, die nicht mit in situ Hybridisierung durchgeführt werden. BACs auch eine additiona hinzuzufügen verwendet werdenl Kopie einer genomischen Region Dosierung eines Gens von Interesse zu erhöhen.

Zur Untersuchung der Genfunktion, Genom Bearbeitung ist eine explosionsartig expandierenden Bereich, der verwendet werden kann , gezielt Änderungen an genomische Sequenzen in einer Vielzahl von Organismen , 34 zu erzeugen. Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens) sind modular aufgebaut, sequenzspezifische Nukleasen ursprünglich aus Pflanzenpathogene isoliert , die genau direkt zu einer genomischen Sequenz der Wahl zu binden , konstruiert werden können , und ein Doppelstrang 35,36 brechen erzeugen. Clustered regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS - Systeme wurden ursprünglich in Bakterien gefunden und eine Führung RNA verwenden und die Cas9 Protein eine Pause in einer Ziel - DNA - Sequenz , die komplementär zu der Führung 37 zu erzeugen. Die anschließende Reparatur des Doppelstrangbruchs beiden erstellt von TALENS und CRISPRs hinterlässt häufig eine kleine Insertion oder Deletion, die die Funktion der Zielsequenz stören können35-37. In Stichlinge wurden Talens verwendet Genexpression stören durch einen Verstärker 20 Targeting, und beide Talens und CRISPRs wurden in kodierenden Sequenzen (nicht veröffentlichte Daten) erfolgreich Mutationen erzeugt. Ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von CRISPRs für den Einsatz in Zebrabärbling als Richtlinie verwendet werden 38 CRISPRs für Stichlinge zu entwickeln.

Transgene und Genombearbeitungs Experimente erfordern Einführung von Nukleinsäuren in eine neu-Zellen embryo gedüngt. Durch Einführen des Transgens oder Genom-Bearbeitungswerkzeug früh in der Entwicklung, die Anzahl von genetisch manipulierten Tochterzellen im Embryo maximiert. Injizierten Embryonen werden dann visuell auf Fluoreszenz abgeschirmt oder molekular für Genom-Modifikationen durchmustert. Wenn Zellen zu der Keimbahn beitragen erfolgreich ausgerichtet sind, kann das Transgen oder Mutation werden, um eine Untergruppe von Nachkommen weitergegeben, auch wenn Nacheinspritzung Lethalität hoch ist. Die Mosaik-Fisch kreuzt werden kann, oderintercrossed und deren Nachkommen gesiebt, um die mutierten Allele oder ein stabil integriertes Transgen von Interesse zu erholen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für Transgene und Genom Bearbeitung von Reagenzien in einer Zell stickleback Embryonen und Überwachung für eine erfolgreiche genomischen Änderungen.

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Protocol

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Alle Fische Arbeit wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of California-Berkeley (Protokollnummer R330) zugelassen.

1. Bereiten Sie Nukleinsäuren für die Injektion

  1. Tol2 Plasmid Transgenese (Angepasst von Fisher 26).
    1. Schnitt 10 ug Transposase Plasmid (pCS-Tp) 39 mit 10 U NotI in mitgelieferten Puffer für 1 Stunde bei 37 ° C zu linearisieren.
      Hinweis: Materialtransfervereinbarungen erforderlich sein können, Tol2 Plasmide zu erhalten.
    2. Extrahieren des geschnittenen Plasmids mit einem 25: 24: 1 Gemisch aus Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol und Ethanolniederschlag mit Natriumacetat nach Standardprotokollen 40. Resuspendieren Plasmid in 50 & mgr; l RNase-freiem Wasser.
      Hinweis: Phenol-Chloroform sollte in einer Haube verwendet werden und die Abfälle müssen entsprechend den Richtlinien des Instituts entsorgt werden.
    3. Richten Sie Anweisungen des einen Sp6 Transkriptionsreaktion nach Hersteller.
    4. Verwenden Sie eine RNA isolation Kit aufzuräumen Reaktion Transkription nach den Anweisungen des Herstellers; RNA in 50 & mgr; l RNase-freiem Wasser suspendieren.
    5. Entfernen eines 1 ul aliquote Menge von RNA. Erhitzen auf 65 ° C für 5 min denaturiert Sekundärstrukturen dann chillen sofort auf Eis. Gefriert verbleibenden Transkriptionsreaktion bei -80 ° C.
    6. Führen Sie die RNA-Aliquot auf einem 1% Agarose-Gel in 0.5x TAE (Tris-Base, Essigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure) Laufpuffer mit einer RNA-Größenstandard in einer Spur. Das erwartete Produkt ist 2200 bp; verwerfen , wenn> 5% der gesamten RNA in einem Abstrich erscheint kleiner als 2.200 bp, die umfangreiche Abbau (Figur 1) zeigt.
    7. Quantifizieren RNA mit einem Spektralphotometer bei 260 nm verwendet wird. Die Lösung wird bis 350 ng / ul in RNase-freiem Wasser und Speicher 1 ul Aliquots bei -80 ° C (gut für mindestens zwei Jahre).
    8. Klon Tol2 Reporterplasmid (beispielsweise unter Verwendung pT2HE 8 oder Plasmiden vom Tol2 Kit 41) mit cis- Regulatorische Element von Interesse. Kurz gesagt, PCR Amplifikation einer genomischen DNA - Sequenz von Interesse mit Primern gefunden Restriktionsstellen in das Plasmid enthält, das PCR - Produkt und Vektor mit dem Enzym verdaut (s), das Insert in den Vektor zu ligieren, und resultierende Plasmid in kompetente E. Transformation coli 40. Isolieren Plasmid mit einem Kit, der eine Endotoxin-rinse nach Herstellerprotokoll umfasst.
    9. Durchführen einer zweiten Reinigung des Tol2 Plasmids mit einem Reinigungs-Kit PCR nach dem Protokoll des Herstellers. Eluieren in 30 & mgr; l RNase-freiem Wasser.
      Hinweis: Die Ausbeute aus diesem Schritt niedrig sein kann (manchmal weniger als 50% des Eingangs Plasmid).
    10. Verdünnen Plasmid ~ 125 ng / ul in RNase-freiem Wasser.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Transposase mRNA - Gel. Gereinigtes Transkriptionsreaktion proKanal (1 ul) wurde auf 65 ° C erhitzt, auf Eis gekühlt, und auf einem 1% Agarosegel mit 0,5 x TAE-Puffer bei 100 V. Die Grßen der RNA-Leiter in Kilobasen (kb) ausgeführt sind links angegeben . Die volle Länge Transposase mRNA ist ein helles Band bei ~ 2,2 kb. Eine kleine , aber akzeptable Menge an abgebauter oder unvollständige mRNA wird unter 2,2 kb zu sehen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. BAC Transgenese (Siehe Suster 32,33 für BAC Recombineering Techniques)
    1. Bereiten Sie BAC von E. coli unter Verwendung von Kit BAC Reinigung nach dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Ethanolfällung DNA mit einem Standard - Natriumacetat-Ethanol - Extraktion 40 und resuspendieren DNA bei ~ 250 ng / ul in RNase-freiem Wasser zu erholen.
    2. Bereiten Sie Transposase mRNA, wie in Abschnitt 1.1.
  2. Mutation Induktion mit Talens (siehe Cermak
  3. Nutzen Sie die Web-basierte Anwendung Talens für das Gen von Interesse 42 zu entwerfen. Wenn möglich, Design Talens zu stören molekulare Analyse eine Restriktionsenzym-Schnittstelle zu erleichtern.
  4. Clone Talens und bereiten Plasmide für die Transkription folgenden veröffentlichten Protokoll 35.
  5. Transkribieren TALEN mRNA mit einer Sp6 Transkriptionsreaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers und aufzuräumen mRNA für Transposase in Abschnitt 1.1.4 beschrieben. Quantifizieren mit einem Spektralphotometer und mit Wasser auf 200 ng / ul in RNase freiem Wasser. Führen Sie TALEN mRNA auf einem Gel zu gewährleisten, ist es die richtige Größe ist und nicht abgebaut, wie in Schritt 1.1.6 beschrieben.
  6. Entwerfen Sie ein Paar PCR - Primer zur Amplifikation etwa 100-200 bp rund um das TALEN Zielsequenz mit einem Primer - Design - Tool und die Ziel - DNA - Sequenz 43. Um die geeignete Restriktionsenzym für Läsionen an der Zielstelle zu testen, auf Basis von Schritt 1.3.1.
  • CRISPR Transgenese (Siehe Talbot und Amacher 38 zum Aufbau und zur Herstellung von CRISPRs):
    1. Design und bereiten CRISPRs und Cas9 mRNA gemäß Protokoll 38, und um entsprechende Überprüfung Primer und Restriktionsenzyme , wie in Schritt 1.3.4 beschrieben.

    • 2. Bereiten Sie Injection Reagenzien

    1. Verwenden Borosilikat Kapillaren Nadeln herzustellen, wie im Folgenden beschrieben.
      Hinweis: Diese Kapillaren sind nicht die Standard-Kapillaren für Zebrabärbling Mikroinjektions eingesetzt und sind aus einem dickeren und stärkeren Glas, die kritisch ist die harte stickleback Chorion zu durchstechen.
      1. Tragen Sie immer Nitril oder Latex-Handschuhe, wenn Nadeln ziehen, und nicht erlauben, Nadeln Haut oder Hautöle zu kontaktieren.
      2. Bestimmen Mikro Parameter empirisch durch Rampentests ziehen Anschluss an die Mikropipette Abzieher des Herstellers. Beispielsweise mit einem Kasten Filaments wurden die folgenden Parameter abzuschreckenabgebauten optimal zu sein: (Heat = 515, Pull = 60, Geschwindigkeit = 60, Delay = 85, Druck = 500). Diese Einstellungen erzeugen eine Nadel , die steil auf etwa 12 ° für ~ 2 mm verjüngt und dann eine lange Verlängerung , die bei etwa 2 ° für ~ 6 mm (Figur 2) hin verjüngt.
        Hinweis: Die richtigen Parameter variieren von Abzieher und Faden, und blind mit einem Programm, ohne die Parameter zu bestimmen zuerst durch Rampentests permanent das Filament der Abzieher zerstören kann, was schwierig und teuer ist, zu ersetzen.
      3. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers aus Borosilikatglas mindestens 4 Mikro Nadeln ziehen mit den in Abschnitt 2.1.2 bestimmt Einstellungen.
      4. Shop Nadeln vertikal in der Kapillar-Vorratsglas mit dem scharfen Ende nach unten zeigt.
      5. Vor der Injektion, legen Kapillare Vorratsglas auf Eis Nadeln zu kühlen. Fügen Sie ein Stück feuchtes Papiertuch in das Gefäß Verdunstung zu verhindern, sobald die Nadeln gefüllt sind.
    2. Düngung Eier (AllSchritten bei RT)
      1. Streifen Ei Kupplung von trächtigen weiblichen stickleback durch sanft den Bauch drückte und in einer vorderen Streicheln Richtung posterior , die Eier zu schieben durch die Kloake und in eine 35 x 10 mm 2 Petrischale. Fügen Sie ein feuchtes Stück Papiertuch auf einer Seite der Petrischale (nicht die Eier zu berühren) Feuchtigkeitskammer zu schaffen. Deckel auf Petrischale so Eier feucht bleiben.
      2. Euthanize männliche Stichlinge in 0,025% Tricaine-S mit 0,1% Natriumbicarbonat gepuffert.
      3. Schneiden Sie den Bauch öffnen, entfernen Hoden und gären in 250 ul Hanks-Lösung (siehe Wester 44 für die vollständige Protokoll für Hank-Lösung Vorbereitung).
      4. Düngung höchstens 100 Eier mit 50 ul Spermienlösung und vorsichtig umrühren mit Pipettenspitze alle Eier, um sicherzustellen, befruchtet. Wenn die Kupplung> 100 Eier, späteren Hälfte der Eier zu befruchten, um sicherzustellen, dass alle Embryonen zum Zeitpunkt der Injektion in einer Ein-Zell-Stadium sind. Eier können unfertilized gelassen werdenbei RT für bis zu einer Stunde, und Samenzellen dauert in der Regel für 1-7 Tage bei 4 ° C in Hank-Lösung.
      5. Halten Sie bedeckt Embryonen mit Petrischale Deckel nach der Befruchtung Austrocknen zu verhindern. Lassen Sie 20-25 Minuten für die erste Zelle entstehen und aufquellen (bereiten Injektionsmaterialien während dieser Zeit).
      6. Füllen Sie eine 150 mm x 15 mm Petrischale mit stickleback Wasser. (Um stickleback Wasser machen, bereiten Sie zunächst 10% Natriumbicarbonat in entmineralisiertem Wasser gelöst. Dann wurden 3,5 g künstlichem Meerwasser Mischung hinzufügen und 0,217 ml 10% Natriumbicarbonat pro 1 l VE-Wasser, und rühren / kräftig schütteln Salz zu lösen.)
    3. Bereiten Sie Injektionslösung (Während Eier werden Dünge-)
      1. Bereiten Injektionslösung gemäß Tabelle 1 und auf Eis lagern.
        Anmerkung: Die Konzentrationen einiger Nukleinsäuren von denen für Zebrabärbling veröffentlicht erhöht aufgrund des erhöhten Volumens des stickleback Blastomere.
    Reagens Tol2 Injektion BAC - Injektion TALEN Injektion CRISPR Injektion
    Tol2 mRNA 350 ng 350 ng - -
    DNA 150-200 ng Plasmid 200-300 ng BAC - -
    TALEN mRNA - - 200 ng jeder -
    CRISPR Führung RNA - - - 200 ng
    Cas9 mRNA - - - 400 ng
    0,5% Phenol PBS roten inDulbecco 0,5 ul 0,5 ul 0,5 ul 0,5 ul
    RNAse freies Wasser bis 5 & mgr; l bis 5 & mgr; l bis 5 & mgr; l bis 5 & mgr; l

    Tabelle 1:. Injection Reagenzien Alle Mischungen sollten auf ein Gesamtvolumen auf 5 ul und auf Eis gelagert , hergestellt werden.

    1. Füllen Nadeln (On Ice, lassen Sie mindestens 10 Min für Needles to Fill).
      1. Verfüllung von mindestens drei Nadeln durch Pipettieren von 0,5 & mgr; l-Injektionslösung auf dem stumpfen oberen Ende der Nadel während Nadeln vertikal in der Kapillar-Vorratsglas hängen. Achten Sie darauf, dass die Tropfen oben bleibt und tropft nicht die Seite nach unten und Blasen zu vermeiden.
      2. Nachdem die rote Flüssigkeit meist auf die Spitze der Nadel, fügen Sie eine weitere 0,5 ul mit dem stumpfen Ende der Nadel ist entleert und abtropfen lassen.

    3. Bereiten Sie Inject Rig und Nadel für Mikroinjektions

    Hinweis: Diese Schritte cein in der Regel nach der Düngung der Eier erfolgen.

    1. Schalten Sie Durchleuchtung Licht für das Binokular und legen Sie eine ~ 13 cm x 13 cm Glasplatte auf dem Mikroskoplichtbasis mit 15 cm Gips Sägeblatt auf der Oberseite der Glasplatte 7. Ausrichten der Säge senkrecht zu der Einspritzvorrichtung mit den Vertiefungen in Richtung des Nadelhalters weist.
    2. Schalten Sie Luftzufuhr und sorgen für Druck auf ~ 200 kPa vom Regler eingestellt ist.
    3. Schalten Sie das Kontrollkästchen und passen Sie die Einstellungen. Stellen Sie Druck auf ~ 150-175 kPa. Stellen Sie die Einspritzdauer auf 180 ms.
    4. Lösen Sie die Nadelhalter, legen Sie eine gefüllte Nadel in die Halterung, bis der Widerstand des Gummihalter fühlbar, und ziehen Sie, bis handfest.
    5. Stellen Sie die Nadel Winkel auf etwa 45 °.
    6. Verwenden Mikromanipulators steuert die Nadel einzustellen, so das Ende in dem Sichtfeld zentriert ist. Vergrößern Sie ~ 40-facher Vergrößerung und konzentrieren sich auf die Spitze der Nadel, die nicht berühren solltedas Glas unten.
    7. brechen Sie vorsichtig die Spitze der Nadel indem sie sie mit Uhrmacherzange greifen. Idealerweise brechen nicht senkrecht, sondern in einem ~ 60 ° Winkel. Aufenthalt an der Spitze (nicht mehr als 2-3 Zange Breiten von dem Ende, Abbildung 2).

    figure-protocol-2
    Abbildung 2. Unbroken und gebrochenen Mikroinjektionsnadeln. Die obere Nadel ist ungebrochen , und die Spitze der unteren Nadel hat mit einer Pinzette (Pfeil) gebrochen. Nadeln werden mit einer Lösung, die 0,05% Phenolrot gefüllt. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    1. Drücken Sie den Injektions Fußpedal mehrmals zu testen, ob die Nadel gebrochen ist. Nach ein paar Hähne sollten, winzige rote Tröpfchen beginnen aus t zu kommener endet. Wenn nicht, versuchen Sie die Nadel bricht etwas höher.
    2. Wenn die Nadel eine Luftblase hat, erhöhen Sie die Gegendruckeinheit und drücken Sie das Pedal mehrmals schnell die Blase zu trainieren.
    3. Stellen Sie den Gegendruck:
      1. Verwenden Sie die Einweg-Transferpipette ein paar Tropfen stickleback Wasser auf der Glasplatte zu platzieren.
      2. senken Sie vorsichtig die Nadel in das Wasser.
      3. Erhöhen Sie den Gegendruck, bis ein schwacher Strom von rosa Flüssigkeit aus der Nadel austritt (unter Angabe positiver Druck).
        Hinweis: Wenn nicht genügend Gegendruck ist, wird die Nadel in das Cytoplasma durch Kapillarwirkung erstellen. Wenn es zu viel Gegendruck ist, kann das Injektionsvolumen versehentlich zu groß sein.
      4. Einzufahren die Nadel so weit wie möglich, so dass es nicht beschädigt wird, während die Embryonen vorbereitet (siehe unten).
    4. Alternativ stellen Sie den Gegendruck auf einen höheren Druckeinstellung, so dass ein konstanter starken Strom von Flüssigkeit, die die Nadel austritt wenn es in Wasser getaucht. Dann injizieren das Fußpedal gedrückt wird überflüssig; jedoch muss die Injektion schnell über injizierende zu vermeiden durchgeführt werden.
      Hinweis: Verwenden Sie diese Technik nicht versuchen, wenn zuerst zu injizieren zu lernen.

    4. Mikroinjektions

    1. Etwa 25 Minuten nach der Befruchtung, verwenden Sie zwei 10 ul Pipettenspitzen 5-10 Embryonen aus der Kupplung und Übertragung auf die Glasplatte zu entfernen.
    2. Immer noch mit den Pipettenspitzen sanft die Embryonen in einzelne Vertiefungen des Sägeblattes trennen. Seien Sie vorsichtig, nicht Embryonen zu durchstechen.
    3. Unter Verwendung einer Transferpipette mit Ende innen abgeschnitten, so stickleback Embryonen passt, fügen Sie genug Wasser stickleback die Embryonen zu bedecken, lassen Sie das Wasser auf 3-5 sec, dann entfernen Sie das überschüssige Wasser mit der Pipette, ein kleines Wasservolumen Beschichtung verlassen jeder Embryo.
      Hinweis: Zu viel Wasser wird die Chorion führen zu härten und die Nadel brechen, aber ein kleines Volumen von Wasser ist notwendig, um die ch zu hebenorion weg von der Zelle und Dotter (3A - B).
    4. Beginnend mit dem Embryo am weitesten entfernt, schieben Sie die Glasplatte und vergrößern, so dass der erste Embryo etwa 25% des Sichtfeld ausfüllt.
    5. Senken Sie die Nadel in das Blickfeld, dann verwenden Sie die 10 ul Pipettenspitze vorsichtig drehen , um den Embryo die Blastomere zu identifizieren, um eine körnige, leicht gelb höckerförmige Erhebung des Zytoplasma auf der Oberseite des Dotters (3B), und dann drehen , so dass die Blastomere direkt senkrecht zu dem Ende der Nadel (während der Embryo in der Einbuchtung des Sägeblattes, 3C halten).
      Anmerkung: Die yolk Tröpfchen bewegen kann als der Embryo gedreht wird, so kann sie nicht als ein Referenzrahmen verwendet werden für den Standort der Blastomere.
    6. Senken Sie die Nadel in das Zytoplasma, aber nicht schieben, um die zugrunde liegende Dotter durch. Wenden Sie Druck langsam und gleichmäßig, wenn das Chorion piercing Brechen der Nadel zu vermeiden. wenn derstreng, zurückziehen und versuchen Sie es erneut in einer etwas anderen Stelle Nadel biegt.
    7. Drücken Sie das Fußpedal 3-4 mal zu injizieren , so dass ein roter Bolus mit leicht verschwommenen Rändern füllt etwa ~ 08.01 den Durchmesser des Zytoplasma (siehe 3D).
      1. Vermeiden eines roten Bolus mit scharfen Kanten zu erhalten , die nicht diffundieren beginnen, die sich unterhalb des Zytoplasmas (3E) Injektion in den Dotter anzeigt.
      2. Wenn ein helles rosa-roter Fleck schnell diffundiert, legen Sie die Nadel weiter die Blastomere zu durchstechen.
      3. Wenn die Injektion Bolus sofort gelb wird, drehen Sie den Embryo die Blastomere , um sicherzustellen , wurde gezielt und injizieren wieder (Abbildung 3F).

    figure-protocol-3
    Abbildung 3. Aussehen von stickleback Embryonen vor und nach der Injektion. Alle Embryonen werden gezogen von the Perspektive sucht das Mikroskop nach unten durch ( mit Ausnahme von C 'und G). (A) Vor Zugabe von Wasser befruchtet Embryonen haben ein einheitliches Erscheinungsbild mit Öltröpfchen in der Nähe der Spitze der Dotter schwimmt. (B) Nach der Zugabe von Wasser, das Chorion schwillt an , eine Blastomere enthüllt , die aus dem Dotter herausragt und im Profil sichtbar. (C) Rotation des Embryos so daß die Nadel tritt senkrecht zur Chorion und Blastomere. (C ') Seitenansicht einer Nadel, die das Chorion mit der Spitze im Zytoplasma durchstochen hat. (D) Injektion in das Zytoplasma führt zu einem roten Fleck mit verschwommenen Rändern , die im Laufe der Zeit verblassen. (E) Die Injektion in den Dotter das Zytoplasma führt zu einem roten Fleck mit definierten Kanten zu Grunde liegen. (F) Injektion in den Dottergegenüber dem Zytoplasma führt zu einem pH-induzierte Farbverschiebung von rot nach gelb. (G) LateralAnsicht der Injektion Ergebnisse, mit Xs über Unter ideal Injektionsstellen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    1. Verwenden Sie die Mikromanipulator steuert die Nadel zurückzuziehen, mit dem 10 ul Pipettenspitze den Embryo niedrig zu halten, wenn es um die Nadel klebt.
    2. Nachdem die Nadel zurückgezogen wird, schieben Sie die Glasplatte das nächste Embryo mit der Nadel auszurichten.
    3. Nachdem alle Embryonen eingespritzt wird, verwenden Sie die Transferpipette Wasser zu den Embryonen hinzuzufügen, so dass sie dann in 150 mm Petrischale voller stickleback Wasser in der Transferpipette und Ort zu sammeln.
    4. Trocknen Sie die Glasplatte mit einem Papiertuch zu vermeiden, dass zu viel Wasser ansammelt.
    5. Verteilen Sie frischen Embryonen auf die Säge und wiederholen 4.4 bis 4.10 Schritte.
    6. Halten ~ 10% der Embryonen als nicht injizierte Kontrollen, um sicherzustellen, dass die injizierten Embryonen entwickeln sich normal und zu verwenden, wie Wildtyp-Kontrollen für ter Molekular unten beschriebenen Assays.

    5. Nacheinspritzung Pflege

    1. Inkubieren Embryonen in Petrischalen bei 18 ° C nach der Injektion bis 10 Schlüpfen. Nach Schraffur, hinten Larven in Aquarien als 10 beschrieben.
    2. abgießen vorsichtig die stickleback Wasser einen Tag nach der Injektion und ersetzen mit frischen stickleback Wasser. Ersetzen mit frischem stickleback Wasser mindestens jeden zweiten Tag danach.
    3. Überprüfen Sie, ob tot oder ungültiges Embryonen täglich. Entfernen solcher Embryonen Zerfall von Verunreinigung des Wassers zu verhindern.

    6. Analyse der Injektions Ergebnisse

    1. Für die Injektion von fluoreszierenden Reportern, überwachen Embryonen täglich in einem abgedunkelten Raum ein fluoreszierendes Binokular mit einem GFP oder RFP-Filter (abhängig von fluoreszierenden Transgen) verwendet wird. Nehmen Sie anatomische Muster der Genexpression mit digitalen Fotos und / oder schriftliche Beschreibungen und tabellarische Darstellung der Anzahl der Fische mit verschiedenen Expression Domänen (4 und 5).
      Hinweis: Stichlinge haben autofluoreszenten, stelPigmentZellen, die unter GFP Filter beginnend bei 4 Tage nach der Befruchtung sichtbar sind (dpf).
      1. Zur Erzeugung stabiler Linien, speichern Embryonen mit detektierbaren Fluoreszenz und wachsen , wie beschrieben bis zum Erwachsenenalter 10.
      2. Outcross injiziert wachsene Fische zu Wildtyp - Fisch mit der in - vitro - Fertilisation Verfahren in Abschnitt 2.2 und Bildschirm Nachkommen für Fluoreszenz als 6.1 in Schritt beschrieben für fluoreszierende Nachkommen zu sehen, was auf erfolgreiche Transgen - Übertragung.
      3. freischwimmenden Larven, 500 & mgr; l 0,8% Tricaine auf die 150 mm Petrischale zu visualisieren Fluoreszenz in ausgebrütet, Fische zu betäuben und warten, bis Fisch Anschlag Bild bewegt. sofort gründlich mehrmals mit frischem Wasser stickleback folgende Beobachtung und Bildgebung.
      4. Optional Fluoreszenz für weitere Abbildung zu erhalten, einschläfern Larven in0,025% (250 mg / L) Tricaine mit 0,1% Natriumbicarbonat gepuffert und fixieren 4 Stunden in 4% Paraformaldehyd in 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° C. Speichern in 1x PBS für bis zu zwei Wochen.
        Hinweis: Hintergrundautofluoreszenz der Zeit zunimmt.
    2. Diagnostische PCR / Verdauung Genotypisierung für Mutation Induktion mit CRISPRs oder Talens - am besten ab mit 2 Tagen nach der Befruchtung.
      1. Verwenden Sie eine Transferpipette 10 injizierten Embryonen zu platzieren (2 dpf, noch in Chorion) in den ersten 10 Vertiefungen einer 12-Well-PCR-Streifen Rohr. Setzen Sie nicht injizierten Kontrollfische in den letzten zwei Brunnen.
      2. Entfernen Sie überschüssiges stickleback Wasser.
      3. Werden 50 & mgr; l Lysepuffer (10 mM Tris pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% Tween-20 und 0,3% NP-40) zu jeder Vertiefung.
      4. Platz Kappen auf Rohren und für 20 min in einem Thermocycler bei 95 ° C inkubieren.
        Hinweis: Das Eigelb wird weiß und gummiartig nach dem Kochen Schritt.
      5. Entfernen Sie Deckel und verwenden Sie einen anderen cleein 1000 ul Pipettenspitze den Embryo in jedem Röhrchen aufzuweichen.
        Hinweis: Weiße Trümmer am Boden des Röhrchens sammeln.
      6. Hinzufügen, 2,5 ul 10 mg / ml Proteinase K zu jeder Vertiefung.
      7. Ersetzen Deckel und Inkubieren bei 55 ° C für 1 h Protein zu verdauen, gefolgt von 95 ° C für 20 min Proteinase K. Lagerung bei -20 ° C zur Inaktivierung von Schimmelwachstum zu vermeiden.
      8. Führen PCR unter Verwendung eines High-Fidelity-Polymerase folgenden Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie den Embryo-Lysat als DNA-Vorlage.
        Hinweis: Achten Sie darauf, die Flüssigkeit zu entfernen von der Oberseite der Röhre für die DNA-Vorlage, sichtbare Chorion oder Eigelb Trümmer am Boden des Rohres zu vermeiden.
      9. Mischen das PCR-Produkt in gleichen Volumen mit einem Restriktionsenzym Mastermix, enthaltend 1x enzymspezifischen Puffer und 0,25 & mgr; l Enzym pro Probe. Speichern Sie immer die Hälfte der ungeschnittenen PCR-Produkt auf einem Gel zu testen PCR-Produkte sind die vorhergesagte Größe zu bestätigen. Inkubieren Sie die PCR an den geeigneten Bedingungen mit dem Enzym gemischtdas Restriktionsenzym.
        Hinweis: Einige Enzyme andere Verhältnisse von Enzym-Puffer PCR-Produkt erfordern; nicht die Pufferkonzentration einstellen, wenn die nicht-injizierten Kontrollen vollständige Verdauung zeigen.
      10. Nach der Verdauung, führen Produkte auf einem 1% Agarose-Gel neben einer Leiter DNA Größe erwarteten Produktgrößen zu bestätigen.
        Hinweis: Uncut Bänder in injizierten Embryonen zeigen die Anwesenheit von molekularen Läsionen (Abbildung 6) und nicht - injizierten Kontrollen müssen vollständig zu interpretieren Ergebnisse verdaut werden.
      11. Um zu bestätigen, Läsionen, ausschneiden ungeschnittenen Banden aus Agarosegelen und reinigen DNA mit einem Gel-Extraktions-Kits. Verwenden Sie Sanger-Sequenzierung, idealerweise einen Sequenzierungsprimer im Inneren der PCR-Primer verwendet werden, um Läsionen bestätigen. In F 0 Embryonen injiziert, wird wahrscheinlich eine Mischung aus Läsionen vorhanden sein, um die Qualität des Sanger verursacht lesen in der Nähe des Zielortes zu verschlechtern.
      12. Um eine stabile Linie erzeugen, speichern Sie alle injizierten Embryonen von Kupplungen, die für die molekulare Läsionen positive screenen. GZeile nach oben Fisch, Auskreuzung und Bildschirm dann eine Teilmenge von F 1 Embryonen für die molekulare Läsionen wie in den Schritten 6.2.1 bis 6.2.11 beschrieben. Wenn heterozygote Träger identifiziert werden, wachsen die restlichen F 1 Embryonen bis zum Erwachsenenalter und heterozygote Individuen identifizieren DNA aus einer Schwanzflosse Clip extrahiert.

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    Results

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    Für Reportergen Transgenen , die Enhancer - Aktivität aufweisen, führt erfolgreiche Injektion in spezifische, zelluläre Expression des Transgens (4A, 4C). Eingespritzte Fische können dann kreuzt werden , um stabile Linien (Beispiel einer BAC stabilen Linie in 4B gezeigt) zu erzeugen. Die Injektion von DNA in stickleback Embryonen führt in der Regel weit höher Letalität als RNA allein. Es ist typisch auf 50% zu sehen , nach oben (manchmal...

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    Discussion

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    Injizieren einer Zell stickleback Embryonen für die Transgenese oder Genom Bearbeitung präsentiert drei wichtigsten Herausforderungen. Zuerst in Bezug auf Genaktivität, die stickleback embryonalen Chorion ist hart und wird oft Nadeln brechen. Dieses Problem kann teilweise durch Verwendung dicker und stärker Glasmikropipetten und Einspritzen senkrecht zur Chorion (siehe Protokoll, 2) überwunden werden. dass so wenig Wasser wie möglich sichergestellt wird, zu den Embryonen hinzugefügt (gerade genug, um da...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH R01 # DE021475 (CTM), ein NIH Predoctoral Ausbildungsbeihilfe 5T32GM007127 (PAE) und ein NSF Graduate Research Fellowship (NAE) gefördert. Wir danken Kevin Schwalbach für die Durchführung BAC Recombineering und Injektionen, Nick Donde zur Erzeugung von Sequenzierungsdaten CRISPR Sanger und Katherine Lipari für hilfreiche Rückmeldung über die Injektionsprotokoll.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Stereomikroskop mit DurchleuchtungLeicaS6e/ KL300 LED
    Manueller MikromanipulatorAngewandte Wissenschaftliche InstrumentierungMM33Marzhauser M33 Mikromanipulator
    DruckinjektionssystemAngewandte Wissenschaftliche InstrumentierungMPPI-3
    GegendruckeinheitAngewandte Wissenschaftliche InstrumentierungBPU
    Mikropipettenhalter-KitAngewandte Wissenschaftliche InstrumenteMPIP
    Magnetfußhalter AngewandteWissenschaftliche InstrumenteMagnetfuß
    FußschalterAngewandte Wissenschaftliche InstrumenteFSW
    Eisenplatte (Magnetfuß)NarishigeIP
    Flaming/Braun Mikropipette AbzieherSutter InstrumentP-97
    Einweg-TransferpipettenFisher13-711-7M
    0,5% Phenolrot in DPBSSigma P0290Injektions-Tracer
    #5 Pinzette, biologie dumoxel Fine Science Tools11252-30zum Brechen
    Nadeln Mikropipetten-VorratsdoseWorld Precision InstrumentsE210hält Nadeln
    6", 6 Zähne pro Zoll Gips-TrockenbausägeLenox20571 (S636RP)Hält Eier für die Injektion
    13 cm x 13 cm Glasplattejeder Baumarkt-
    Borosilikatglas Kapillaren, 1,0 mm OD / 0,58 mm ID & nbsp;World Precision Instruments1B100-F4*härteres Glas als Zebrafisch-Injektionskapillaren
    150 x 15 mm PetrischaleFisherFB0875714Aufzucht von Stichlingsembryonen
    35 mm x 10 mm PetrischaleFisher08-757-100ALagerung von Eiern vor
    Injektion Instant Ocean SaltInstant OceanSS15-10
    NatriumbicarbonatSigmaS5761-500G
    Tricain-Methansulfonat/MS-222Western Chemical IncMS222Fischanästhesie/Euthanasie
    Sp6 TranskriptionskitAmbionAM1340Für die Transkription von TALENs und Transposase mRNA
    RNeasy Cleanup KitQiagen74104Aufreinigung von Transposase oder TALEN RNA
    QiaQuick PCR Cleanup KitQiagen28104Aufreinigung von Plasmiden für Injektion
    Proteinase K 20 mg/mlAmbionAM2546für die DNA-Aufbereitung
    Nukleobond BAC 100 KitClontechfür die BAC DNA-Vorbereitung
    NotINEBR0189L
    Phusion PolymeraseFisher F-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi KitQiagen12943enthält Endotoxin-Spülpuffer
    QIAQuick Gel-ExtraktionQiagen28704 zur Sequenzierung induzierter Mutationen
    Phenol:Chloroform:IsoamylalkoholSigmaP2069-100ML
    NatriumacetatSigmaS2889-250G
    Ethanol (molekularbiologische Qualität)SigmaE7023-500ML
    AgaroseSigmaA9539
    50x Tris-Acetat-EDTA-PufferThermoFisherB49
    0,5-10 Kb RNA-LeiterThermoFisher15623-200
    Nanotropfen  SpektralphotometerThermo ScientificNanodrop 2000
    ParaformaldehydSigma158127-500G
    10x PBSThermoFisher70011-044
    1 kb Plus DNA LeiterThermoFisher10787-018
    KaliumchloridSigmaP9541-500G
    MagnesiumchloridSigmaM8266-100G
    NP-40ThermoFisher28324
    Tween 20SigmaP1379-500ML
    Tris pH 8,3TeknovaT1083
    12-Streifen-PCR-RöhrchenThermo ScientificAB-1113
    von der 740579

    References

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