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Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

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August 21st, 2016

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1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

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Wir präsentieren einen strategischen Plan und ein Protokoll zur Identifizierung nicht-kodierender genetischer Varianten, die die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors (TF) beeinflussen. Es wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) und den DNA-Affinitäts-Präzipitations-Assay (DAPA) der Genotyp-abhängigen TF-DNA-Bindung bereitgestellt.

Abstract

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Populations- und familienbasierte genetische Studien führen typischerweise zur Identifizierung genetischer Varianten, die statistisch mit einer klinischen Krankheit oder einem Phänotyp assoziiert sind. Bei vielen Krankheiten und Merkmalen sind die meisten Varianten nicht-kodierend und wirken daher wahrscheinlich, indem sie subtile, vergleichsweise schwer vorherzusagende Mechanismen beeinflussen, die die Genexpression steuern. Hier beschreiben wir einen allgemeinen strategischen Ansatz, um nicht-kodierende Varianten zu priorisieren und auf ihre Funktion hin zu screenen. Dieser Ansatz beinhaltet eine rechnergestützte Priorisierung unter Verwendung funktioneller genomischer Datenbanken, gefolgt von einer experimentellen Analyse der differentiellen Bindung von Transkriptionsfaktoren (TFs) an Risiko- und Nicht-Risikoallele. Sowohl für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) als auch für die DNA-Affinitätsfällungsassay (DAPA) von genetischen Varianten wird ein synthetisches DNA-Oligonukleotid (Oligo) verwendet, um Faktoren im Kernlysat von krankheits- oder phänotyprelevanten Zellen zu identifizieren. Bei EMSA werden die Oligonukleotide mit oder ohne gebundene Kernfaktoren (oft TFs) durch nicht-denaturierende Elektrophorese an einem Tris-Borat-EDTA (FSME)-Polyacrylamidgel analysiert. Bei DAPA werden die Oligonukleotide an eine magnetische Säule gebunden und die Kernfaktoren, die spezifisch an die DNA-Sequenz binden, werden eluiert und durch Massenspektrometrie oder mit einer reduzierenden Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse. Dieser allgemeine Ansatz kann in großem Umfang verwendet werden, um die Funktion nicht-kodierender genetischer Varianten zu untersuchen, die mit einer Krankheit, einem Merkmal oder einem Phänotyp verbunden sind.

Introduction

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Sequenzierung und Genotypisierung basierte Studien, einschließlich der genomweiten Assoziationsstudien (GWAS), Kandidaten-Locus Studien und tiefSequenzierungsUntersuchungen haben viele genetische Varianten identifiziert, die statistisch im Zusammenhang mit einer Krankheit, Zug oder Phänotyp. Im Gegensatz zu dem frühen Vorhersagen, die meisten dieser Varianten (85-93%) werden in nicht-codierenden Regionen und die Aminosäuresequenz von Proteinen nicht 1,2 ändern. Interpretieren der Funktion dieser nicht-kodierenden Varianten und Bestimmung der biologischen Mechanismen , um sie zu dem zugeordneten Krankheit verbindet, trait oder Phänotyp hat Herausforderung e....

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Protocol

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1. Herstellung von Lösungen und Reagenzien

  1. Bestellen Sie kundenspezifische DNA-Oligonukleotid-Sonden zur Verwendung in EMSA und DAPA.
    1. Zur Reduzierung der unspezifischen Proteinbindung, entwerfen kurze Oligos (zwischen 35-45 Basenpaare (bp) in der Länge) 30, und legen Sie die Variante von Interesse direkt in der Mitte , flankiert von seinen 17 bp endogene genomische Sequenz. Für EMSA Oligos, eine 5'-Fluorophor hinzuzufügen. Für DAPA Oligos, eine 5'-Biotin-Tag hinzufügen.
    2. Um sowohl die Sense-Strang und seine Umkehrkomplement Strang. Alternativ bestellen Duplex (vorgeglüht) Oligos. Wenn die Oligos zu benennen, stellen Sie....

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Results

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In diesem Abschnitt repräsentative Ergebnisse von dem, was zu erwarten, zur Verfügung gestellt, wenn ein EMSA oder DAPA Durchführung und die Variabilität in Bezug auf die Qualität des Lysats gekennzeichnet ist. Beispielsweise wurde vorgeschlagen, dass mehrere Male Einfrieren und Auftauen Proteinproben in Denaturierung führen kann. Um die Reproduzierbarkeit der EMSA-Analyse im Rahmen dieser "Frost-Tau" Zyklen, zwei 35 bp Oligos unterschiedlichen an einer genetischen Variante wurden mit ei.......

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Discussion

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Obwohl Fortschritte in der Sequenzierung und Genotypisierung Technologien stark unsere Fähigkeit, mit der Krankheit genetische Varianten assoziiert zu identifizieren verbessert haben, unsere Fähigkeit, die Funktionsmechanismen von diesen Varianten betroffen zu verstehen, hinkt. Eine wichtige Ursache des Problems ist, dass viele krankheitsassoziierten Varianten in n angeordnet sind on-kodierenden Regionen des Genoms, die wahrscheinlich Einfluss auf schwieriger zu sagen voraus Mechanismen Genexpression steuern. Hier.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Wir danken Erin Zoller, Jessica Bene und Lindsey Hays für ihren Input und die Leitung bei der Protokollentwicklung. MTW wurde teilweise durch NIH R21 HG008186 und einen Trustee Award Grant der Cincinnati Children's Hospital Research Foundation unterstützt. ZHP wurde teilweise von T32 GM063483-13 unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kundenspezifische DNA-OligonukleotideIntegrierte DNA-Technologienhttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
KaliumchloridFisher ScientificBP366-500KCl, für CE-Puffer
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080Für CE- und NE-Puffer
EDTA (0,5 M), pH 8,0Life TechnologiesR1021Für CE-, NE- und Annealing-Puffer
NatriumchloridFisher ScientificBP358-1NaCl, für NE-Puffer
Tris-HCl (1M), pH 8,0InvitrogenBP1756-100Für Glühpuffer
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, für die Zellwäsche
DL-Dithiothreitol-Lösung (1 M)Sigma646563Reduktionsmittel
Proteasehemmer CocktailThermo Scientific87786Verhindert den Katabolismus von TFs
Phosphatase-Hemmer Cocktail Thermo Scientific78420Verhindert die Dephosphorylierung von TFs
Nonidet P-40 SubstitutIBI ScientificIB01140NP-40, für die Kernextraktion
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Zur Messung der Proteinkonzentration
Odyssey EMSA Puffer KitLicor829-07910Enthält alle notwendigen EMSA-Puffer
FSME Gele, 6%, 12 WellsInvitrogenEC6265BOXfür EMSA
FSME Puffer (10x)Thermo ScientificB52für EMSA
FactorFinder StartkitMiltenyi Biotec130-092-318Enthält alle notwendigen DAPA
Puffer Licor Odyssey CLxLicorEmpfohlener Scanner für DAPA/EMSA
Antibiotikum-AntimykotikumGibco15240-062Enthält 10.000 Einheiten/ml Penicillin, 10.000 & Mikro; g/ml Streptomycin und 25 µ g/ml Fungizone® Antimykotisches
fötales RinderserumGibco26140-079FBS, für Nährmedien
RPMI 1640 MediumGibco22400-071Enthält L-Glutamin und 25 mM HEPES

References

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  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

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Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

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