Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

Satoru Yamagishi; Gandhervin Kesavamoorthy; Martin Bastmeyer; Kohji Sato

doi:10.3791/54096

Methodenartikel

Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

10.4K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/54096

⸱

19. Juni 2016

Satoru Yamagishi¹ , Gandhervin Kesavamoorthy¹ , Martin Bastmeyer² , Kohji Sato¹

¹Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, ²Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Axonleitmoleküle regulieren die neuronale Migration und die gezielte Navigation des Wachstumskegels. Wir stellen eine leistungsfähige Methode, den Stripe-Assay, vor, um die Fähigkeit von Leitmolekülen zu beurteilen, Neuronen anzuziehen oder abzustoßen. In diesem Protokoll demonstrieren wir den Stripe-Assay, indem wir die Fähigkeit von FLRT2 zeigen, kultivierte Hippocampus-Neuronen abzustoßen.

Zusammenfassung

Wachsende Axone entwickeln an ihrer Spitze eine stark bewegliche Struktur, die als Wachstumskegel bezeichnet wird. Der Wachstumskegel kontaktiert extrazelluläre Umweltreize, um das axonale Wachstum zu steuern. Netrin, Slit, Semaphorin und Ephrine sind bekannte Leitmoleküle, die Axone anziehen oder abstoßen können, wenn sie an Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf dem Axon binden. Die aktivierten Rezeptoren initiieren verschiedene Signalmoleküle im Wachstumskegel, die die Struktur und Bewegung des Neurons verändern. Hier beschreiben wir das detaillierte Protokoll für einen Stripe-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit eines Leitmoleküls, Neuronen anzuziehen oder abzustoßen. Bei dieser Methode werden dissoziierte Hippocampus-Neuronen von E15.5-Mäusen auf lamininbeschichteten Schalen kultiviert, die mit abwechselnden Streifen der Ektodomäne von Fibronektin und leucinreichem Transmembranprotein-2 (FLRT2) und dem Immunglobulin-G (IgG)-Fragment kristallisierbare Region (Fc)-Protein verarbeitet wurden. Sowohl Axone als auch Zellkörper wurden nach 24 h Kultur stark von den FLRT2-beschichteten Streifenregionen abgestoßen. Die Immunfärbung mit tau1 zeigte, dass ~90% der Neuronen auf den Fc-beschichteten Streifen verteilt waren, verglichen mit den FLRT2-Fc-beschichteten Streifen (~10%). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass FLRT2 eine stark abstoßende Wirkung auf diese Neuronen hat. Diese leistungsstarke Methode ist nicht nur für primär kultivierte Neuronen anwendbar, sondern auch für eine Vielzahl anderer Zellen, wie z. B. Neuroblasten.

Einleitung

Axon Führung ist der Prozess , durch den neu gebildeten Neuronen Axone zu ihrem Ziel bei der Entwicklung des Nervensystems ^1,2 senden. Die Entwicklung Axone tragen eine sehr bewegliche Struktur an ihrer Spitze der Wachstumskegel genannt. Der Wachstumskegel spürt extrazelluläre Signale des Axons in den Weg zu navigieren. Guidance Moleküle, wie Spalt, Semaphorin und Ephrinen kann Axone in Abhängigkeit von ihrer Wechselwirkung mit geeigneten Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Axon ^1,3,4 anziehen oder abstoßen. Die aktivierten Rezeptoren übertragen Signale an den Wachstumskegel, der seine Organisation des Zytoskeletts für Axon und wachstums Kegel ....