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Stripe Assay die anziehende oder abstoßende Aktivität eines Proteins Substrat unter Verwendung Dissociated Neuronen im Hippocampus zu studieren

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DOI:

10.3791/54096

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19. Juni 2016

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1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Axonleitmoleküle regulieren die neuronale Migration und die gezielte Navigation des Wachstumskegels. Wir stellen eine leistungsfähige Methode, den Stripe-Assay, vor, um die Fähigkeit von Leitmolekülen zu beurteilen, Neuronen anzuziehen oder abzustoßen. In diesem Protokoll demonstrieren wir den Stripe-Assay, indem wir die Fähigkeit von FLRT2 zeigen, kultivierte Hippocampus-Neuronen abzustoßen.

Zusammenfassung

Wachsende Axone entwickeln an ihrer Spitze eine stark bewegliche Struktur, die als Wachstumskegel bezeichnet wird. Der Wachstumskegel kontaktiert extrazelluläre Umweltreize, um das axonale Wachstum zu steuern. Netrin, Slit, Semaphorin und Ephrine sind bekannte Leitmoleküle, die Axone anziehen oder abstoßen können, wenn sie an Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf dem Axon binden. Die aktivierten Rezeptoren initiieren verschiedene Signalmoleküle im Wachstumskegel, die die Struktur und Bewegung des Neurons verändern. Hier beschreiben wir das detaillierte Protokoll für einen Stripe-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit eines Leitmoleküls, Neuronen anzuziehen oder abzustoßen. Bei dieser Methode werden dissoziierte Hippocampus-Neuronen von E15.5-Mäusen auf lamininbeschichteten Schalen kultiviert, die mit abwechselnden Streifen der Ektodomäne von Fibronektin und leucinreichem Transmembranprotein-2 (FLRT2) und dem Immunglobulin-G (IgG)-Fragment kristallisierbare Region (Fc)-Protein verarbeitet wurden. Sowohl Axone als auch Zellkörper wurden nach 24 h Kultur stark von den FLRT2-beschichteten Streifenregionen abgestoßen. Die Immunfärbung mit tau1 zeigte, dass ~90% der Neuronen auf den Fc-beschichteten Streifen verteilt waren, verglichen mit den FLRT2-Fc-beschichteten Streifen (~10%). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass FLRT2 eine stark abstoßende Wirkung auf diese Neuronen hat. Diese leistungsstarke Methode ist nicht nur für primär kultivierte Neuronen anwendbar, sondern auch für eine Vielzahl anderer Zellen, wie z. B. Neuroblasten.

Einleitung

Axon Führung ist der Prozess , durch den neu gebildeten Neuronen Axone zu ihrem Ziel bei der Entwicklung des Nervensystems 1,2 senden. Die Entwicklung Axone tragen eine sehr bewegliche Struktur an ihrer Spitze der Wachstumskegel genannt. Der Wachstumskegel spürt extrazelluläre Signale des Axons in den Weg zu navigieren. Guidance Moleküle, wie Spalt, Semaphorin und Ephrinen kann Axone in Abhängigkeit von ihrer Wechselwirkung mit geeigneten Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Axon 1,3,4 anziehen oder abstoßen. Die aktivierten Rezeptoren übertragen Signale an den Wachstumskegel, der seine Organisation des Zytoskeletts für Axon und wachstums Kegel Bewegungen beeinflussen.

Verschiedene Verfahren wurden entwickelt, um die Wirkung der Lockstoff und abweisende Moleküle zu bewerten. Chemo-Lockstoffen und Repellentien können mit einem Gradienten - Konzentration (z. B. Dunn Kammer oder μ-Dias) 5,6, in einer hochkonzentrierten Stelle von Mikro-p in das Wachstum / Kulturmedium verabreicht werdenipette (z. B. Drehen assay) 7 oder mit einer homogenen Konzentration von Badanwendung (z. B. Wachstumskegel collapse assay) 8,9.

Andere Verfahren umfassen ein Streifentest oder Mikrokontakt- Drucken ( & mgr ; CP), in dem eine chemo-Lockstoff oder Repellent auf der Oberfläche einer Platte als Substrat 10-12 beschichtet ist. Thestripe Test wurde ursprünglich von Bonhoeffer und Kollegen im Jahr 1987 entwickelte 13 topographische Kartierung in den Küken retino-tectal System zu analysieren. Die ursprüngliche Methode benötigt, um ein Vakuumsystem zur Beschichtung von Proteinen auf Polycarbonat Nukleopore Membranen mit gestreiften und vermaschten Matrizen. In späteren Versionen wurden die rekombinanten Proteine ​​auf der Oberfläche einer Kulturplatte in einem Streifenmuster mit schmalen Schlitz Silizium - Matrizen 14,15 direkt gedruckt. In jüngster Zeit haben verschiedene Forschergruppen erfolgreich angewendet diesen Streifen - Assay auf die Analyse von Axon Führung Molekülaktivitäten 16-21.

Hier präsentieren wir die detaillierte Protokoll für einen Streifen Assay, der die Anziehung oder Abstoßung von Axon Führung Moleküle für die dissoziierten Neuronen im Hippocampus misst. Bemerkenswert ist, kann dieses Verfahren in der minimal ausgestatteten Labor-Einstellungen angewendet werden. Für diesen Assay abwechselnde Streifen aus einem fluoreszenzmarkierten Substrat und einem Kontrollprotein sind auf einer Kunststoffschale erzeugt eine Siliciummatrix mit 90 & mgr; m Schlitzen und beschichtet mit Laminin verwenden. In unserer Demonstration, distanzierte Neuronen im Hippocampus von E15.5 Mäusen auf abwechselnden Streifen von rekombinanten Ektodomäne von Fibronektin und Leucin-reichen Transmembranprotein-2 (FLRT2) und Kontroll - Fc - Protein 21 kultiviert. Nach 24 h der Kultur, sowohl die Axone und Zellkörper der Neuronen wurden aus den FLRT2 Streifen stark abgestoßen. Anfärbung mit einem Antikörper anti-Tau1 ergab, dass ~ 90% der Neuronen auf der Fc-beschichteten Bereiche verteilt wurden, im Vergleich zu ~ 10% auf die FLRT2-Fc, das anzeigt, daß eine starke Abstoßungs FLRT2 hatFunktion für Neuronen im Hippocampus 21.

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Protokoll

Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an Hamamatsu University School of Medicine zugelassen.

1. Herstellung von Matrices

  1. Sieden 4-8 Silikon-Matrices in einer Mikrowelle oder auf einer heißen Platte für 5 min und lassen sie für 1 h unter laminaren Strömungs (striped Seite nach oben) vollständig trocknen.
    Hinweis: Die folgenden Verfahren sollten unter laminaren Strömung durchgeführt werden.
  2. Preßluft oder verwenden transparente Klebeband Staub von der gestreiften Seite der Matrizen zu entfernen. Halten Sie die gestreifte Seite sauber, so dass es fest an der Plattenoberfläche haften.
  3. Vorsichtig die Matrizen auf 6 cm Plastikschalen, indem sie mit einem Finger (eine Matrix pro Schale; Streifen Seite nach unten) drücken. Vermeiden Sie Luftblasen zwischen der Matrix und zu dem Teller. Markieren die Lage der Streifen auf der Unterseite der Kulturschale.
  4. Wenn die Matrix zu befestigen fehlschlägt, wiederholen Sie die Schritte 1.2.

2. Streifen Erzeugung und Laminin Beschichtung für Neuron Kultur

  1. Bereiten fluoreszierend markiertes rekombinantes Protein (25 & mgr; l jeder Injektions [Schritt 2.2] bzw. 100 & mgr; l jeweils für die Platzierungsmethode [Schritt 2.2.1]) durch Mischen des Fc-tagged Protein (10-50 ug / ml) und einen fluoreszierenden Farbstoff konjugierten anti-human Fc Antikörper (1 bis 3 Verhältnis: 30-150 & mgr; g / ml) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Dann Inkubieren der Mischung für 30 min bei RT.
  2. Verwendung einer 22-G - Spritze, injizieren 25 & mgr; l des rekombinanten Proteins im vorherigen Schritt (2.1) durch das kleine Loch auf der Seite der Matrix (Pfeile in 1A, 1C und 1E).
    1. Alternativ setzen 100 ul des rekombinanten Proteins in den oberen Schlitz der Matrix und Aspirat etwa die Hälfte der Lösung aus dem kleinen Loch (Pfeile in 1A, 1C und 1E), so daß das rekombinante Protein bleibt in den Streifenbereichen.
  3. Inkubieren Sie die Schale für 30 min bei 37 ° C in einem Zellkulturbrutschrank.
  4. Platzieren 300 ul PBS in den oberen Schlitz (1B) und Aspirat aus dem kleinen Loch auf der Seite der Matrix angeordnet (Pfeile in Figur 1A, C und E) zu entfernen unattached rekombinanter Proteine. Sie nicht das PBS vollständig absaugen, weil die Proteine ​​trocken wird. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. (3-mal insgesamt)
  5. Vorsichtig die Matrix zu entfernen und sofort platzieren ~ 100 ul Kontrollprotein (10-50 ug / ml; Fc) den gesamten Streifenbereich abzudecken, eine alternative Beschichtung zu schaffen. Dann brüten die Schale für 30 min bei 37 ° C in der Zellkultur-Inkubator.
  6. Nach der Geschirroberfläche dreimal Waschen mit PBS, streicht es mit ~ 100 ul von 20 ug / ml Laminin in PBS.
    Hinweis: Laminin sollte auf Eis aufgetaut werden Erstarrung zu verhindern.
  7. Inkubiere die Schale für 1 h bei 37 ° C in der Zellkultur-Inkubator.
  8. Waschen Sie die Geschirroberfläche dreimal mit PBS und Kultur medi hinzufügenÄh. Legen Sie die beschichtete Schale mit Kulturmedium in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C bis zur Verwendung.

3. Anzucht Neuronen im Hippocampus von E15.5 Maus Embryonen

  1. Euthanize Mutter über Genickbruch und zu isolieren, drei E15.5 Embryonen.
  2. Schneiden Sie die Haut und Schädel sagital an der Mittellinie des Kopfes mit einer Schere, und entfernen Sie das Gehirn einen kleinen Löffel. Übertragen, das Gehirn vorsichtig zu einer 60-mm-Petrischale mit 3 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
  3. Mit einem Skalpell ausgeschnitten die Hemisphären einschließlich Cortex, Hippocampus und Striatum (2A). Dann sezieren aus dem Hippocampus - Region durch sorgfältig die Meningen zu entfernen, und übertragen Sie die seziert Hippocampus - Gewebe in ein 15-ml - Zentrifugenröhrchen mit 2 ml HBSS - Lösung, auf Eis (2B-C). Sammelt 6 Hippocampi von 3 Embryonen in der Röhre, die zum Züchten von Neuronen in 8 Geschirr ausreichend sind.
  4. Ersetzen Sie die HBSS-Lösung mit Trypsin / EDTA-Lösung (2 ml) und das Röhrchen bei 37 ° C für 15 min in einem Wasserbad inkubiert.
    Hinweis: Aspirate HBSS ohne Zentrifugation und nicht die HBSS-Lösung dekantieren, indem das Röhrchen Neigen.
  5. Neutralisieren des Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 500 ul fötales Rinderserum (FBS).
  6. Zentrifugieren der Mischung bei 100 g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und wäscht das Pellet mit 2 ml Kulturmedium. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
  7. Pipettieren die hippocampi nach oben und unten 10-mal in Kulturmedium, das eine 1000-ul Spitze mit einem großen Loch mit (Cut-Spitze), um das Gewebe zu distanzieren.
  8. Wechseln Sie zu einem regelmäßigen (uncut) 1000-ul Spitze und pipettieren die dissoziierten up Gewebe und unten eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
  9. Trennen Sie die einzelnen Zellen, indem sie durch eine 80-100-um-Mesh-Zelle Sieb vorbei.
  10. Zentrifugieren Sie die gefilterte Einzelzellsuspension bei 150 g für 5 min.
  11. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Pellet (Neuronen) in 2 ml Kulturmedium.
  12. Zählen Sie die Zellen einer Zählkammer mit Trypan-Blau-Färbung mit der Dichte und die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Dann Platte 10.000 Neuronen in 150 ul Kulturmedium für jede Gruppe von stripes.The Suspension sollte sorgfältig den gesamten Streifenbereich abzudecken platziert werden.

4. Visualisierung von Zellkörper und Axone durch Immunfluoreszenzanfärbung unter Verwendung eines Anti-Tau1 Antikörper

  1. Nach 24 Stunden Kultur absaugen Medium ohne die anhaftenden Zellen zu stören, und befestigen Sie die Neuronen, die mit vorgewärmter 4% Paraformaldehyd (PFA) / 4% Saccharose / PBS bei RT für 15 min.
  2. Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Falls gewünscht, verwenden Sie einen wasserabstoßenden Stift einen Kreis um den gestreiften Bereich zu ziehen benötigt, um die Menge an Antikörper zu verringern.
  3. Permeabilisierung die Neuronen mit 0,3% Triton X-100/5 min PBS.
  4. Inkubieren der Neuronen mit Blocking-Lösung enthaltend 3% Eselserum und 0,1% Triton X-100 für30 min, gefolgt von einer Inkubation mit einem Anti-Tau1 Antikörper (1: 200) in 1% Eselsserum / 0,1% Triton X-100 / PBS O / N bei 4 ° C.
  5. Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Inkubieren der Neuronen mit einem Fluorophor-konjugierten Anti-Maus-IgG-Antikörper in 1% Rinderserumalbumin (BSA) /0.1% Triton X-100 / PBS für 30 min.
  6. Waschen Sie die Plattenoberfläche 3-mal mit PBS. Decken Sie den Streifenbereich mit einer 18 mm x 18 mm Deckglas mit 50 ul Antifade-Lösung. vermeiden Luftblasen, die mit der Abbildungs ​​stören.
  7. Erhalten Fluoreszenzbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop das entsprechende System, beispielsweise x10 Objektivlinse, Filtersätze für GFP und RFP und 1000 msec Belichtungszeit (Abbildung 3).

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Ergebnisse

Dissociated Neuronen im Hippocampus von E15.5 Mäusen wurden plattiert und für 24 h auf Streifen von fluoreszenzmarkierten Kontroll - Fc (3A-C) oder FLRT2-Fc (3D-F) mit nicht-markierten Kontroll - Fc abwechseln. In beiden Fällen waren die Neuronen aggregiert und erweitert ihre Axone als Bündel. Auf der Kontroll - Fc / Fc Streifen wurden die Neuronen gleichmäßig auf die fluoreszenzmarkierten und nicht-markierten Streifen verteilt, und sie erweitert ihre Ax...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Streifen Assay, rekombinantes Protein und dissoziierte Neuronen aus dem Hippocampus E15.5 Maus verwendet. Dieser Assay ermöglicht die effiziente Beobachtung repulsive, attraktiv, oder neutrale Antworten von Neuronen auf ein rekombinantes Protein von Interesse in einem gestreiften Muster angeordnet. Ein wesentlicher Vorteil dieses Protokolls ist die einfache Methode für die Streifen zu erzeugen, in dem das Protein direkt auf die Oberfläche einer Kunststoffschale aufgedruckt ist, im Vergl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research von der Japan Society for the Promotion of Science (23700412, 25122707 und 26670090 to S.Y.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 ml ZentrifugenröhrchenViolamo 1-3500-01
4% Paraformaldehyd (PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Human-IgG-AntikörperThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Esel-Anti-Maus-IgG-AntikörperThermo ScientificA-21203Verdünnung 1/500
Anti-Tau1-AntikörperChemiconMAB3420Verdünnung 1/200
Anti-FadingThermo ScientificP7481Alternative Einbettmedien können verwendet werden
B27-ErgänzungThermo Scientific17504-044Verdünnung 1/50
RinderserumalbuminSigma01-2030-2
Zellsieb 100 umBD Falcon352360
ZentrifugationsmaschineKubota2410
Deckglas 18mmx18mmMatsunami18x18 mm Nr. 1
DAKO StiftDAKOS2002Alternativer wasserabweisender Stift kann verwendet werden
EinwegskalpellFeder2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
FluoreszenzmikroskopNikonE600
Pinzette Nr. 5Fine Science Tools11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Verdünnung 1/100
Hamilton SpritzeHamilton805N22 Gauge, 50 uL
HBSSThermo Scientific14170-112
Humanes IgG, Fc-FragmentJackson009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
NeurobasalThermo Scientific21103-049
Normales EselserumJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Penicillin-StreptomycinThermo Scientific15070-063Verdünnung 1/100
Kulturschale aus Kunststoff, 60 mmThermo Scientific150288
SilikonmatrizenErhältlich und käuflich erhältlich bei Prof. Martin Bastmeyer (bastmeyer@kit.edu)
StereomikroskopOlympusSZ61
Tip, 1000 uLWatson125-1000S
Transparentes KlebebandTesa57315Alternatives Klebeband kann verwendet werden
Triton X-100SigmaT8787
Trypanblau, 0,4%Bio-Rad145-0013
Trypsin/EDTAThermo Scientific25300-054
KulturmediumNeurobasal, ergänzt mit B27, GlutaMAX und Penicillin-Streptomycin.

Referenzen

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Axonf hrungProteinrepulsionFLRT2 Proteindissoziierte NeuronenLaminin BeschichtungTau1 Immunf rbungZellkulturProteinbindung

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