Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Zusammenfassung

Es besteht ein wachsendes Interesse an der quantitativen Charakterisierung von intestinalen Lymphozyten, da zunehmend erkannt wird, dass diese Zellen eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Darm- und systemischen Erkrankungen spielen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten für die anschließende durchflusszytometrische Charakterisierung isoliert werden können.

Zusammenfassung

Der Darm -, die die größte Anzahl von Immunzellen von jedem Organ im Körper enthalten - sind auf fremde Antigene ständig ausgesetzt sind, sowohl mikrobielle und Nahrungs. Gegeben helfen ein zunehmendes Verständnis, dass diese luminale Antigene, die Immunantwort zu gestalten und dass Bildung von Immunzellen im Darm für eine Reihe von systemischen Erkrankungen kritisch ist, hat es bei der Charakterisierung des intestinalen Immunsystems erhöht Interesse. viele veröffentlichte Protokolle sind jedoch mühsam und zeitraubend. Wir präsentieren hier ein vereinfachtes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus dem kleinen intestinalen Lamina propria, intraepitheliale Schicht und Patches Peyer, die eine schnelle, reproduzierbar ist, und erfordert keine mühsamen Percoll Gradienten. Obwohl das Protokoll auf den Dünndarm konzentriert ist es auch für die Analyse des Kolons geeignet. Darüber hinaus stellen wir einige Aspekte, die auf die spezifische wissenschaftliche ques je eine zusätzliche Optimierung benötigention. Dieser Ansatz führt zu der Isolierung einer großen Anzahl von lebenden Lymphozyten, die anschließend für die durchflusszytometrische Analyse oder alternative Mittel zur Charakterisierung verwendet werden können.

Einleitung

Die Hauptaufgabe des Dünndarms wird oft als ¹ , um die Verdauung und Resorption von Nährstoffen ist. Während diese Stoffwechsel - Funktion deutlich von wesentlicher Bedeutung ist, hat der Dünndarm eine ebenso bedeutende Rolle in den Host aus dem ständigen Flut von Umweltantigene innerhalb des Lumens ² gefunden zu schützen. Der Darmtrakt trennt die Außenwelt (z. B. luminale Antigene) aus der inneren Umgebung des Wirts mit einer Epithelschicht , die nur eine einzige Zellschicht dick ist. Als solche hat die kleine-Darm Immunsystem die gewaltige Aufgabe seine Schwelle auf Reaktivität auszugleichen, so dass fremde Antigene aus der Ernährung und commensal Mikroben die Schleimhaut mit minimal, wenn überhaupt, Immunantwort zu aktivieren, während eine robuste Antwort gegen eindringende Pathogene Montage und andere "schädlich" Antigene. Übermäßige oder unangemessene Immunantworten gegen diese Antigene zu pathologischen Krankheit führen können (z. B. inflammatory Darmerkrankung, Typ - I - Diabetes, Multiple Sklerose) , und ^3-6 vermieden werden muss.

Insgesamt ist der Gastrointestinaltrakt das größte Immunorgan im Körper darzustellen gedacht, mit über 70% der Antikörper-sezernierenden Zellen ^7. Die Klein intestinale Immunsystem besteht aus 3 Hauptfächer - die lamina propria (LP), der intraepithelialen Schicht und Peyer-Plaques (PPs) - dass jede ² eine besondere Gruppe von Lymphozyten enthält. Die LP - Lymphozyten (LPLs) sind in erster Linie TCRαβ ⁺ T - Zellen mit ~ 20% B - Zellen; intraepitheliale Lymphozyten (IELs) enthalten nur sehr wenige B - Zellen mit mehr TCRγδ ⁺ T - Zellen als TCRαβ ⁺ T - Zellen; und PPs, die in der kleinen Darmwand eingebettet sekundären lymphatischen Organe sind, die ~ 80% B-Zellen. Obwohl jede dieser anatomischen Regionen leicht unterschiedliche Funktionen und ontologischen Basen hat, funktionieren sie in aharmonized Art und Weise den Wirt vor pathogenen Beleidigungen zu schützen.

Darüber hinaus gibt es wachsende Anerkennung , dass die Mikrobioten eine kritische Determinante für die Entwicklung des Darm Immunsystems, mit Anerkennung der kognaten Beziehung zwischen spezifischen Mikroben erhöht und die Ontogenese von bestimmten Zelllinien ^8,9. Da darüber hinaus die Bildung des intestinalen Immunsystems in anatomisch entfernten Stellen Immunreaktionen beeinflusst (z. B. Arthritis, Multiple Sklerose, Lungenentzündung), ist es klar geworden , dass die Entwicklung des intestinalen Immunsystems zu mehr Krankheitsprozesse relevant ist , als bisher ¹⁰ erkannt ^-12. Als solches Interesse an quantitativ die intestinale Immunsystem Beurteilung hat sich über Wirt-Pathogen-Interaktionen erweitert jetzt Host-symbiotischer Interaktionen und die Pathogenese vieler systemischen Erkrankungen sowie umfassen.

die Variabilität der derzeitigen Methoden in der gegebenenIsolierung von Darm-Lymphozyten, eine Methode, die während Ausgleich erforderlich, um die Zeit für den Ertrag, Rentabilität und Konsistenz optimiert wird zunehmend kritisch. Protokolle, die Percoll Gradienten sind zeit- und arbeitsintensiv und möglicherweise anfällig für menschliche Fehler, was zu einer variablen Ausbeute und Lebensfähigkeit ¹³ beinhalten. Hierin stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von Lymphozyten, die aus allen drei kleinen intestinalen Immun Abteilen. Zusätzlich, da ein zunehmendes Interesse an mikroben induzierte Veränderungen in der mukosalen Immunsystems beziehen wir Schritte, die verwendet werden können, für die horizontale Übertragung von Mikroorganismen zwischen Mäusen zu ermöglichen zu beurteilen, wie diese Veränderungen quantitativ die intestinale Immunsystem beeinflussen.

Protokoll

Alle Untersuchungen wurden unter strengen Überprüfung und Richtlinien durchgeführt nach der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Harvard Medical School, die die Veterinär Standards, die von der American Association for Laboratory Animal Science (AALAS) erfüllt.

1. Horizontale Übertragung von Bakterien über Co-Gehäuse (optional)

1. Zur Minimierung von exogenen Kontamination (insbesondere, wenn gnotobiotischer Mäusen), üben aseptischen Bedingungen während sterile Einweg-Käfige montieren, mit Nahrung und Wasser, die haben beide autoklaviert worden.
2. Verwenden Ohr Schläge oder Tags einzeln markieren 6 Wochen alten C57BL / 6-Mäuse, die unterschiedliche microbiotas Hafen und beherbergen sie im selben Käfig. Da Mäuse sind Koprophagie und essen fäkalen Pellets aus dem Käfigboden, Mikroben wird natürlich horizontal zwischen den Mäusen übertragen werden.
3. Co-Hausmäuse für ≥1 Woche Zeit für die mikrobielle Transfer und immunologischer Veränderungen vor der Analyse zu ermöglichen.

2. Herstellung einer Einzelzellsuspension aus dem Small-Darm-Intraepitheliale Schicht und Lamina Propria

1. Herstellung von Lösungen
   1. Bereiten Extraktionsmedien (pro Dünndarm): 30 ml RPMI + 93 & mgr; l 5% (w / v) Dithiothreitol (DTT) + 60 & mgr; l 0,5 M EDTA + 500 ul fötales Rinderserum (FBS). Fügen Sie den DVB-T unmittelbar vor der Verwendung.
   2. Bereiten Sie die Verdauung Medien (pro Dünndarm): 25 ml RPMI + 12,5 mg Dispase + 37,5 mg Kollagenase II + 300 ul FBS. Fügen Sie die Dispase und Kollagenase unmittelbar vor dem Gebrauch.
   3. Für alle Inkubationen bei 37 ° C, vorwärmen Lösungen bis 37 ° C durchgeführt wird.
2. Euthanize die Maus durch CO ₂ Ersticken durch Genickbruch folgte.
3. Platzieren Sie die Maus dorsalen Seite nach unten und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Mit einer Schere eine Laparotomie durchzuführen, indem der Reihe nach in die Haut schneiden und dann Peritonealdialyse Faszie entlang der ventralen Mittellinie herm die Schambeinfuge zum Xiphoidbasis, wodurch die Bauchhöhle ausgesetzt wird.
4. Mit einer Schere in den Dünndarm aus dem Magen zu trennen, indem Sie den Magenpförtner durchschneidet. Entfernen Sie vorsichtig den Dünndarm aus dem Peritoneum, necken die mesenterialen Fett weg.
   1. Um voll und ganz in den Dünndarm zu entfernen, machen einen zweiten Schnitt am ileo-cecal Kreuzung. Platzieren Sie den isolierten Dünndarm in kaltes (dh., 4 ° C) RPMI 10% FBS enthält , die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren.
5. Entfernen Sie vorsichtig große Stücke von Fett mit einer gebogenen Pinzette. Seien Sie vorsichtig, zu vermeiden, dass die Darmgewebe reißen sich während Fett zu entfernen versuchen.
6. Zum Entfernen von Darminhalt, sanft spülen Darm mit 15 bis 20 ml kaltem PBS unter Verwendung einer 18 G Fütterung Nadel an einer Spritze befestigt.
7. Mit einer Schere PPs auszuschneiden, und legen Sie sie in kaltem RPMI mit 5% FBS. PPs sind auf der antimesenteriale Seite des Dünndarms befindet und erscheinen als mehr gelappte whiteMasse. Je nach dem spezifischen Stamm hat eine Maus typischerweise 8 bis 12 PPs.
8. Schneiden Sie den Dünndarm sich in 3 - 4-Zoll-Segmente.
9. Entfernen Restfett durch jede kleine-Darm-Segment auf einem Papiertuch rollen mit RPMI befeuchtet, ein stumpfes Skalpell, das Fett zu necken aus dem Gewebe entfernt.
10. Schalten Sie das Gewebe von innen nach außen durch die Darmsegmente mit einer gebogenen Pinzette Kanülierung und das distale Ende des Gewebes zu erfassen. Dann mit einem Paar von geraden Pinzette vorsichtig auf die Gewebesegment aus den gebogenen Pinzette entfernen (am proximalen Ende beginnend), die sich in das Gewebe invertiert wird.
11. Legen Sie Gewebesegmente in einer Schale mit 30 ml Extraktionsmittel und einen Rührstab. Sichern Sie den Deckel auf den Becher, und rührt bei 500 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten bei 37 ° C; Rühren sollte kräftig, aber nicht turbulent sein.
12. Nach der Inkubation verwenden, um ein Wannensieb Gewebestücke aus dem Epithel enthaltenden Überstand zu trennen, die trübe erscheinen soll. Dieser Überstand enthält intraepithelial Lymphozyten, die weiter analysiert werden können, falls gewünscht, durch fortgefahren wird, die Probe in Schritten Filterung 2,18-2,23.
13. die Gewebestücke in RPMI manuell agitieren Restextraktionsmittel abzuwaschen.
14. Legen Sie Gewebe auf ein trockenes Papiertuch und drehen Sie sie über das Ende mehrmals am Ende Entfernung von Rest Schleim zu erleichtern, die nicht durch das Extraktionsmittel befreit wurde.
15. Platzieren Gewebefragmente in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 600 ul Digestionsmedium.
16. Mit einer Schere das Gewebe zu zerkleinern, bis Stücke nicht mehr auf die Schere halten, und die Lösung erscheint homogen. Dieser Schritt ist entscheidend vollständige enzymatische Verdauung des Gewebes zu gewährleisten.
17. Fügen Sie den gehackten Dünndarm zu einer Tasse, die 25 ml Verdauung Medien. Rühre bei 500 rpm für 30 min bei 37 ° C. Auf halbem Weg durch die Verdauung (dh., 15 min), pipettieren nach oben und unten mit einer serologischen Pipette alle großen Brocken von Gewebe brechen zu helfen.
18. Filter verdaute Gewebe (oder EpithElial Schicht aus Schritt 2.12, wenn die Verarbeitung IELs) durch ein 100 & mgr; m Zellsieb in ein 50 ml Röhrchen. Spülen Sie das Sieb mit 20 ml RPMI 10% FBS enthält.
19. Zentrifugieren der filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C.
20. dekantieren sorgfältig den Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 10% FBS enthielt.
21. Filter resuspendierten Zellen durch ein 40 & mgr; m Zellsieb in ein 50 ml Röhrchen. Spülen Sieb mit 20 ml RPMI 10% FBS enthielt.
22. Zentrifuge filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C.
23. dekantiert vorsichtig Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 2% FBS enthielt.

3. Herstellung einer Einzelzellsuspension von Peyer-Plaques

1. Transfer PPs zu einer Tasse mit 25 ml Verdauung Medien und einem Rührstab herausgeschnitten. Sichere Deckel und Schleudern bei 500 UpM für 10 min bei 37 ° C.
2. Filter verdaut PPs durch ein 40 & mgr; m Zelle Sieb in einen 50-ml-Tube. Wenn jeder Klumpen REMAin, drücken sie durch das Sieb aus einer 1-ml-Spritze das flache Ende des Kolbens verwendet wird.
3. Spülen Sieb mit 10 ml RPMI 10% FBS enthielt.
4. Zentrifuge filtrierten Lösung bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C.
5. dekantiert vorsichtig Überstand und Pellet in 1 ml RPMI 2% FBS enthielt.

4. Oberflächenfärbung für die Durchflusszytometrie

1. Aliquotieren entsprechende Volumen von Zellen (z. B. 200 ul LPLs) in einer 96-Well - Rundbodenplatte.
2. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte.
3. Resuspendiere Zellen in 90 & mgr; l von RPMI, enthaltend 2% FBS und eine 1: 100-Verdünnung von anti-CD16 / 32 (Fc-Block). Inkubieren für 10 min bei 4 ° C.
4. In 10 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte.
5. Die Zellen in 250 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Decant Stand durchUmdrehen der Platte.
6. (Optional) Stain Zellen mit Lebensfähigkeit Farbstoff, falls gewünscht, durch das Protokoll des Herstellers folgen.
7. Die Zellen in 100 ul 1% Formalin, die Zellen zu fixieren. Inkubieren für 1 Stunde im Dunkeln bei 4 ° C.
8. In 200 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte.
9. Die Zellen in 250 ul PBS. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren Stand durch Umdrehen der Platte.
10. Die Zellen in 200 ul PBS. Analysieren Sie die Zellen unter Verwendung eines Durchflusszytometers.

Ergebnisse

Die durchflusszytometrische Analyse von Einzelzellsuspensionen von kleinen intestinalen Lymphozyten sollte eine diskrete Population von Zellen ergeben , die ähnliche haben Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften als Splenozyten (1A und 1B). Die Lymphozyten können beginnen zu sterben , wenn das Gewebe nicht bei 4 ° C während der ersten Phasen der Isolation gehalten, was in der Lymphozyten - Population eine niedrigere Vorwärtsstreuung aufweisen und schwierig zu trennen von ...

Diskussion

Wir stellen ein Protokoll für die Isolierung und durchflusszytometrische Charakterisierung von kleinen intestinalen Lymphozyten, einschließlich der LPLs, IELs und Lymphozyten in die PPs. Für Interessenten bei der Bewertung, wie sich Änderungen in der Mikrobiota die kleine-Darm-Immunsystem beeinflussen, wir ausführlich die einfachen Schritte in der horizontalen Übertragung von Organismen zwischen Mäusen beteiligt verschiedenen microbiotas beherbergen. Obwohl dieses Protokoll auf den Dünndarm konzentriert, ist das Verfahr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sterile Handschuhe	Kimberly-Clark	555092
steriler Mäusekäfig	Innovive	MS2-AD	enthält Deckel, Käfigboden und Alpha-Dri-Einstreu
Zuführung aus Metall	Innovive	M-FEED
Wasserflasche	Innovive	M-WB-300
Kartenhalter	Innovive	CRD-HLD-H
Autoklavierbares Nagetier chow (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI medium 1640	Gibco	11875-119
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545-5G
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Ambion	AM9262
Fötales Rinderserum (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	Die Konzentration im Protokoll basiert auf einem Aktivitätsniveau von 1,878 U/mg
Kollagenase, Typ II	Invitrogen	17101-015	Die Konzentration im Protokoll basiert auf einem Aktivitätsniveau von 245 U/mg
Präparierschere	Roboz	RS-5882
Zuführnadel (18 G, 2" Länge)	Roboz	FN-7905
10 ml Spritze	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Einweg-Skalpell (15 Klingen)	Miltex	4-415
Gebogene Pinzette	Roboz	RS-5211
Gerade Pinzette	Roboz	RS-5132
Mehrzweckbecher, 120 ml	VWR	89009-662
Rührstab	VWR	58949-062
Rührplatte mit mehreren Positionen, 9 Positionen	VWR	12621-048
Edelstahl konisch Sieb, 3 Zoll	RSVP
1,5 ml Tube	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m Zellensieb	Falcon	08-771-19
40 μ m Zellsieb	Falcon	08-771-1
50 ml Konisches Röhrchen	Falcon	352098
1 ml Spritze	BD	309659
96-Well-Platte, runder	Boden Corning	3799
Anti-Maus CD16/32 (Fc-Block)	Biolegend	101320
(Optional) Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% Formalin, neutral gepuffert	Thermo Scientific	5725