Summary
이 문서에서는 성공적으로 항균 약물 발견 및 화합물 테스트를위한 새로운 강력한 도구를 제공, 녹농균에 순환 디 GMP의 세포 수준을 조작 할 수있는 잠재적 능력을 작은 분자의 큰 라이브러리를 스크리닝하기 위해 설립 된 높은 처리량 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
기존의 항생제에 대한 세균의 저항은 최근에 발견 된 규제 경로에 새로운 약물 표적을 식별하는 연구 시도를 주도하고있다. 두 번째 메신저로 세포 내 순환 디 GMP (C 디 GMP)를 이용 규제 시스템은 목표의 하나의 클래스입니다. C 디 GMP는 항생제 내성, 바이오 필름 형성 및 독성을 포함한 프로세스의 광범위한 범위를 조절하는 작용을 거의 모든 세균에서 발견되는 신호 분자이다. C 디 GMP는 항생제 내성 바이오 필름 개발의 제어 측면을 신호 방법의 이해는 뉴클레오티드 또는 이러한 신호 전달 경로의 중단의 세포 농도의 변화가 감소 biofilm 형성 또는 항생제에 생물막의 증가 감수성으로 이어질 수있다 접근 방식을 제안했다. 우리는 녹색 형광 단백질 발현을 c 디 GMP 응답 CDRA 프로모터의 제어하에 (GFP)에 기초하여, 간단한 높은 처리량 bioreporter 프로토콜을 설명, 녹농균 (P. aeruginosa의)에서 C 디 GMP 세포 수준을 조절 할 수있는 잠재력을 가진 작은 분자 빠르게 화면입니다. 이 간단한 프로토콜은 48 시간 내에 상향 3,500 화합물의 화면을 복수의 미생물에 적용 할 수있는 능력을 가지고있다.
Introduction
임상 적으로 중요한 항생제에 대한 박테리아의 내성의 급속한 발전은 현재 전 세계적으로 보건 전문가가 직면하고있는 주요 문제 중 하나입니다. 기존의 항생제이 오류는 독성과 질병의 진행 일에 관여하는 세균 프로세스를 방해 할 수있는 화학 물질에 대한 새로운 검색을 주도하고있다. 활용 한 이러한 규제 체계 세포 내 디 GMP (C 디 GMP)는 최근 유망 유효 2-4와 대상이되었다 순환 두 번째 메신저. 이 글로 제 톡 신호 분자는 항생제 내성, 접착 성 바이오 필름 형성 및 질환 2-4 포함한 여러 기능을 조절하는 것으로 확립되어있다.
이제 박테리아 세포에서 C 디 GMP의 세포 수준은 GTP 두 분자 GGDEF 도메인 함유 diguanylate cyclases (DGCs) WH 의해 C 디 GMP를 합성하는 데 사용된다 합성과 분해에 의해 제어됨을 알 수있다ereas C 디 GMP 저하가 EAL 또는 HD-GYP 도메인 중 하나가 포스 포 디에스 (하는 PDE)에 의해 촉매된다 ((3 검토, 5)). 이러한 도메인을 포함하는 단백질은 종종 C 디 GMP 매출에서의 활동이 환경 또는 휴대 단서 3,5에 의해 직접 또는 간접적으로 조절되는 것을 건의, 다른 신호 도메인이 포함되어 있습니다. 따라서, C 디 GMP는 세균 표현형의 수정에 다양한 환경 단서의 감지를 연결하는 기능을 신호. C 디 GMP는 다양한 메커니즘 (4)에 의해 전사, 이후 전사 및 사후 번역의 수준에서 박테리아의 규제 효과를 발휘한다.
많은 박테리아 세포에서 C 디 GMP의 주요 영향은 생물막의 다세포 구조의 표면에 부착 또는 조직 운동성 플랑크톤 세포와 고착 세포 사이의 전환의 제어에, 특히 박테리아 '라이프 스타일'과의 결정에 3,5. 일반적으로, 높은 휴대낮은 세포 수준은 많은 세균 병원균 3,5의 운동성 및 독성 인자의 합성을 촉진하는 동안 C 디 GMP 수준은 biofilm 형성 및 sessility과 연결되어 있습니다. 따라서, C 디 GMP 신호의 동작의보다 상세한 기술은 병원성 세균의 바이오 필름 형성 및 독성 억제 전략을 수득 할 수있다. 이것은 대부분의 박테리아 게놈이 GGDEF, EAL 및 / 또는 HD-GYP 도메인 (예를 들어, 녹농균이 40 단백질이) 여러 이펙터 6,7 수많은 단백질을 인코딩 주어진 어려운 작업입니다.
그러나, 이러한 복잡성으로, 최근의 증거는 C 디 GMP 시그널링 조작 전략 항생제 내성 감염 현상을 방지하거나 고전 항생제 (2)의 병용 투여에 의한 면역 시스템 또는 효과적인 치료에 취약하게 하나에 개발 될 수 있음을 시사한다. 이와 라인에서, 실험적 인공 감소하는 것이 증명되었다체외 -grown P.의 세포 내 C 디 GMP의 P. aeruginosa의 동안은, 바이오 필름 형성을 감소 항균제에 대한 감수성 증가에 이르게 마우스의 복강에 위치한 실리콘 보형물에 루기 노사 -developed 생물막은, 유사한 방식으로 8-11에 분산 될 수있다.
여기서는 잠재적 P.에서 셀룰러 C 디 GMP 수준을 조절할 수있는 작은 분자를 스크리닝하기 위해 높은 처리량, 형광 기반 리포터 분석을 서술 녹농균 (그림 1). 상기 분석은 C 디 GMP를 발현 전사적 ㄴ 디 GMP 응답 CDRA 촉진제 (12)에 연결되어있는 이전에 개발 된 GFP 리포터를 사용하여 세포 농도를 측정에 기초한다. 이 프로토콜은 P.의 리포터 구조물의 발현을위한 방법을 설명 관심 aeruginosa의 변형, 화합물 판 준비, 우리로 384 웰 플레이트, 성장 조건으로 배양 접종데이터 수집, 관리 및 분석 (그림 1)에 대한 세부 사항과 같은 게요. 전반적으로,이 프로토콜은 박테리아에 신호 C 디 GMP를 대상으로 새로운 화합물을 식별 잠재적으로 연구를 돕기, 연구에 사용 P.의 생물학을 이해를 목표로합니다 녹농균.
Protocol
참고 : 정제 된 C 디 GMP 기자 플라스미드의 복제 및 변환을위한 절차는 다른 12 설명되어 있습니다.
C 디 GMP 기자 P. 태그 GFP의 1 세대 aeruginosa의 스트레인
- P.의 단일 식민지와 원성 국물의 5 ㎖ (LB) 배지에 접종 녹농균은 200 rpm으로 진탕 하룻밤에 37 ° C를 부화합니다.
- 전송이 1 L 플라스크에 신선한 LB 배지 200㎖에 밤새 배양 mL 및 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 배양한다.
- 600 nm의 (OD 600) 플라스크에서 1 ml의 샘플을 복용하고 (이전 12 설명) 분광 광도계를 사용하여 검사하여 매 30 분에서 광학 밀도를 모니터링합니다.
- 외경 (600)는 0.3 사이에 도달 할 때 - 0.5, 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 문화의 40 ml에 배치합니다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 8,000 rpm에서 원심 분리하여 세포를 펠렛 뜨는 및 R 폐기빙냉 멸균, 300 mM의 수크로오스 용액 40 ㎖ 중의 세포를 일시 전자.
- 단계 150에서 설명하고 빙냉 멸균, 300 mM의 수크로오스 용액 20ml에 다시 대기로 원심 분리하여 세포를 두 번 펠렛.
- 단계 150에서 설명하고 빙냉 멸균, 300 mM의 수크로오스 용액 400 μL에 재현 탁으로 원심 분리하여 세포를 최종 시간 펠렛.
참고 :이 시점에서 세포 밀도가 밀리리터 당 약 1 × 11 집락 형성 단위 (CFU / ㎖)해야한다. - 그들은 전기에 대한 준비 후 30 분 동안 얼음에 세포를 진정.
- P. 40 μL에 0.2 μg의 / μL pCdrA :: GFP의 C 플라스미드 (12) 용액 1 μl를 추가 녹농균 전기 적격 세포를 얼음에 미리 냉각되어있는 1.5 ml의 마이크로 원심 관에 상기 제조. 현탁액을 혼합하고 미리 냉장, 2mm 전극 간격, 전기 큐벳에 전송합니다.
참고 : pCdrA :: GFP C : P.에서 C 디 GMP의 세포 내 수준의 형광 판독을 제공 pUCP22Not-P CDRA -RBSII-의 GFP (MUT3) -T 0 -T 1, 앰프는 GM의 r에 r에, aeruginosa의 균주 개발 및 Rybtke 등. (12)에 의해 확인되었다. - 휴지와 큐벳의 외부에 수분을 제거하고 electroporator의 샘플 실에 큐벳을 놓습니다. 2.5 kV의 25 μF의 커패시턴스, 200 Ω의 저항 전압 펄스.
- 큐벳을 제거하고 LB 배지 1 ㎖를 추가합니다. 이어서, 멸균 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송하고 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 2 시간 동안 배양한다.
- 10 μL, 50 μL 및 (100 μg / ml의 농도)의 암피실린이 보충 된 멸균 된 LB 한천 플레이트 상에 배양 물 100 ㎕ 분액을 확산하고, 밤새 37 ℃에서 플레이트 배양한다.
- (excitati을 GFP 발현을 확인의 단일 콜로니를 표준 GFP 채널과 형광 현미경 검사 판 및 선택에 의해 485 내지 520 nm에서 방출)에서 5 ㎖ (LB)을 접종 단계 1.1에 설명 된대로 밤새 품어. -80 ° C에서 최고 튜브 및 저장 나사 2 ml의 0.5 ml의 50 % 글리세롤과 하룻밤 문화의 0.5 ml의 혼합.
예방 접종에 대한 스타터 문화 2. 준비
- 이틀 화면 전에 P.를 판 루기 노자 균주합니다 (pCdrA :: GFP C 플라스미드 함유) -80하는 LB 아가 플레이트 상 C 스톡 ° 부드럽게 무균 접종을 사용하여 플레이트를 통해 박테리아를 확산로 (100 μg / ml의 농도의 앰피 실린이 보충 된) 고리. 37 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
- 심사 전에 저녁, P.의 단일 콜로니를 접종 LB 배지 10 ㎖에 접시에서 녹농균은 TU의 (100 μg / ml의 농도의 앰피 실린이 보충 된)수 200 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 예비 - 배양에서 밤새 배양한다.
- 화면의 일에 추가로 OD 5 % LB 희석 OD 후 1.0 600 신선한 LB 배지로 먼저 희석 밤새 예비 배양에서 배양을 준비 0.04 (1시 25분 비) 600 .
주 : 접종 배지 전량 테스트 할 플레이트의 개수에 의존한다. 5 % LB는 필요한 농도로 인산 완충 식염수 (PBS)으로 100 % LB 희석하여 이루어진다. 중요한 것은, 미디어 (5 % LB)는 pCdrA의 구성 적 활성화 : P.에서 GFP C를 할 수 있습니다 녹농균. - 그들은 384 웰 플레이트에 분배되기 전에 박테리아가 미디어에 순응하게하고 실온에서 30 분 동안 자기 교반기에 최소한의 속도로 배양을 용기에 무균 자기 교반 막대를 첨가하고 교반 하였다.
포함 된 384 웰 플레이트 3. 접종 및 배양작은 분자
참고 : 무균 좋은 무균 기술은 다음 단계에 중요하다.
- 양성 대조군 (100 % 저해)을 제조하기 위해, 단계 230에서 제조 한 배양의 10 ㎖ (12 판에 적합) 20 μL 토 브라 마이신 설페이트 (25 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 온화하게 혼합한다. 피펫 우물 A23에 양성 대조군 문화의 40 μL - P23 (그림 2).
- 음성 대조군 (0 % 억제)을 제조하기 위해, 단계 230에서 제조 한 배양의 10 ㎖ (12 판에 적합) 30 ㎕의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 첨가하고, 온화하게 혼합한다. 피펫 우물 A24에 음성 대조군 문화의 40 μL - P24 (그림 2).
- P22 (그림 2) - 작은 분자 각인 플레이트의 각 들어, 우물의 A1에 (단계 2.3에서 설명) 희석 하룻밤 문화의 40 μL의 볼륨을 접종.
주 :이 액체 핸들러 로브를 사용하여 달성 될 수있다오티. 인해 세균 배양의 이질적인 성질, 분배 동안 꾸준히 미디어 배포 박테리아를 유지하는 연속 적당한 교반을 유지하는 것이 중요하다. 이렇게하려면 자기 분배 동안 단계 2.4에서 순응 문화를 교반 유지. - 통기성 커버 씰 플레이트를 밀봉하고 37 ℃에서 6 시간 동안 품어.
주 : 통기성 시일 모든 384 웰에 걸쳐 변하지 않는 상태를 유지하고, 상기 플레이트를 통해 산소 구배의 전위 현상을 회피하는 것이 중요하다.
4. 성장률 (OD 600) 및 세포 내가 C 디 GMP 수준의 측정 (GFP)
- 약 30 분 분광 측정 전에 응축을 방지하기 위해 37 ° C로 플레이트 리더 미리 가온.
- 부드럽게 읽기 전에 통기성 커버 씰을 제거합니다. 웰 당 10 점멸의 설정을 600 nm의 파장에서 흡광도를 측정0.2 초의 안정화 시간.
- 형광을 측정하기 전에, A24 웰 (음성 대조군)에 기초하여 자동 이득 및 초점 조정을 75 % (도 2)에서 이득 타겟 값을 설정한다.
- 플레이트 리더 제어 소프트웨어에서 시작 측정을 클릭하고 '클릭'초점 및 게인 조정 / 플레이트 ID가 ''탭.
- 윈도우의 오른쪽에 '초점 조정' '와' '채널 A' '를 선택합니다.
- '게인 조정'을 '을 선택하고' ''잘 선택 '과'목표 값 ''로 ''75 ''를 입력합니다. 마지막으로, ''조정 시작 '을'클릭하기 전에 플레이트 레이아웃에서 잘 A24을 선택합니다. 조정이 수행되면, '' '측정 시작'을 클릭합니다.
- 잘하고 settli 당 10 깜박의 설정으로 520분의 485 나노 미터의 여기 / 방출 최대의 GFP 기자의 형광을 측정0.2 초 NG 시간.
- 검사 모든 판에서 데이터를 수집합니다. 참고 : 데이터 측정 값이 자동 플레이트 리더 제어 소프트웨어에 의해 기본값으로 저장됩니다.
- 통계 분석 패키지를 엽니 제어 소프트웨어 내에서 "화성"아이콘을 클릭하여보기 독서.
- 분석을 위해 데이터에 액세스 할 관심의 판 번호에 "더블 클릭"하여 데이터를 검색합니다.
5. 데이터 분석
- 높은 처리량 스크린에 대해보고 된 가장 일반적인 품질 메트릭 강인 Z '분석을 사용하여 분석의 균일 성 및 재현성을 평가한다. 강력한 Z '공식을 사용하여 계산한다 :
MAD (중앙값 절대 편차) 표준 편차의 추정이고, p는 양의 대조군 (100 % 억제)이고, n은 음성 대조군 모두 OD 600 GFP의 V (0 % 억제) 인alues. 참고 :보다 크거나 0.5 같음 (모두 OD 600 GFP 원시 데이터에 대해 계산) 강력한 Z '값을 가진 분석이 탁월한 분석으로 간주됩니다. - 수식을 이용하여 성장 억제율 (%)을 계산한다 :
어디 사이 OD600 각 샘플의 반복 된 OD 600 값은 물론이다. % 억제 OD600> 0, 성장 억제제; % 억제 OD600 <0, 성장 촉진제. - 수식을 이용하여 C-디 GMP의 세포 내 수준의 억제율 (%)을 평가한다 (임의의 형광 강도의 단위 변화를 셀 밀도의 변화에 대해 보정 됨) :
여기서 GFP 사이 각 샘플의 반복 된 GFP 값은 물론이다. % 억제 GFP> 0, C 디 GMP 억제제; %# 160; 억제 GFP <0, C 디 GMP 촉진제. - 샘플로부터 계산 된 평균 (평균 ± 3 MAD), 3 MAD에서 히트 검출을위한 임계 값을 설정하는 것은 물론 데이터 포인트의 정규 분포를 가정하고, 각 판의 아웃을 참조하십시오. 주 : 필요한 경우, 그러나, ± 50 % 억제 컷오프보다 재현성 정확한 투여 량 반응 분석을 위해 선택 될 수있다.
Representative Results
여기서 설명하는 방법은 효과적이고 성공적으로 48 시간 이내에 3,500 화합물의 평균을 선별 한 연구를 허용한다. 고 처리량 스크리닝 프로토콜의 개요는도 1의 순서도로 도시된다. 현재의 문서를 들어, 600 μM의 최종 농도에서 전위 C 디 GMP 변조 화합물 룰의 다섯 호환 화합물 라이브러리를 스크리닝 . 그러나, 상기 분석에 사용될 수있는 화합물의 세트와 같은 많은 상업적으로 이용 가능한 약물 형 및 비 약물이있다. 이 세트는 박테리아에 초점을 맞춘 화합물 또는 임의의 풀링 된 화합물이 될 수 있지만, 각 라이브러리는 극성 작용기 여러 입체 센터를 가지고 여기에 상영 세트, 등의 할당 물리 화학적 성질과 특성을 전제로 한 것입니다. 이 프로토콜에서, 박테리아는 함께 화합물과 접시, 항생제 양성 대조군 및 DMSO 차량에 접종제어,도 2에 도시 된 레이아웃에 따라.도 3은 하나의 라이브러리 플레이트 예로 일차 스크리닝의 결과를 보여주고있다. 주제 OD 600 GFP 미가공 데이터는 각각도 3a 및도 3b에 도시된다. 높은 OD 600 / GFP 값을 나타내는 낮은 열 (적색)와 컬러 그라디언트 열 맵을 냉각 (녹색) 컬러는 물론 값에 적용되고있다. 히트 맵은 가장 낮은 OD에서 걸쳐 3 색 규모 조건부 서식을 적용하여 스프레드 시트 소프트웨어에서 생성 된 600 / GFP 판독 가장 높은 OD 600 / GFP 판독까지. DMSO 대조군에 상대적으로 높은 값을 각각 성장 및 C 디 GMP 수준의 촉진에 대응하는 동안 DMSO 대조군에 상대적으로 낮은 OD 600 GFP 값은 각각 성장 및 C 디 GMP 수준의 억제에 대응 . OD 600 GFP 아칸소의 강력한 Z '값프로토콜 E (5.1)에서 제공된 공식에 따라 계산 하였다. 그들은 0.5 (각각 0.694 및 0.761) 상기 둘 다 같이 분석 품질 강력한 것으로 간주하고, 상기 데이터를 분석 하였다. 성장률 (OD 600) 및 C 세포 디 GMP 수준 (GFP)의 억제율 (%)은 프로토콜 (5.2, 5.3)에 제공하는 식으로 계산된다. 대표 데이터는 각각도 4a 및도 4b에 도시된다. 높은 억제율 (%)을 나타내는 고온 저 (적색)와 컬러 그라디언트 열 맵을 냉각 (녹색) 컬러는 물론 값에 적용되고있다. 기본 화면에 따라 각각의 우물에서 % 억제 (OD600 / GFP)의 산점도는도 5a에 그려진 각각 OD 600 GFP 데이터 5B된다. ± 50 % 컷오프는 (점선으로 표시) 히트 감지 선택됩니다. 이 컷오프를 기반으로 잠재적 인 히트는 빨간 점으로 표시됩니다. 관심있는 화합물은 두 종류의 수 거라고분석에서 iscerned. 도 5b에서 식별 된 잠재적 히트 C 디 GMP의 세포 내 수준을 조절하는 능력을 보유하는 화합물이다하면서도 5a에서 식별 된 히트는 박테리아의 성장을 억제하는 화합물이다. 두 화합물은이 분석을위한 대표적인 히트 곡으로 확인되었다. 이러한 화합물 A, 잠재적 인 성장 억제제 및 화합물 B, 잠재적 인 C 디 GMP 억제제이다. 화합물 (A)는도 3에 잘 F8에 대응하고, (4) 성장에 72.5 % 억제했다. 순환 디 GMP 수준의 예상 대응 억제가 발생했습니다. 화합물 B는도 3에 잘 K3에 대응하고, (4) 성장 변화없이 환상 디 GMP 수준에서 61 % 저해했다. 선택 횟수 화합물은 상기 2 mM의 두 배 희석 시리즈의 최고 농도가 10 점 투여 량 - 반응 분석으로 시험 하였다. IC 50 값은 용량 - 반응에 기초하여 계산되고커브 (도 6a 및도 B).
그림 1. 개요 : P.에서 C 디 GMP의 세포 레벨을 조절하는 그들의 잠재력에 대한 작은 분자를 상영 높은 처리량 설정 녹농균.이 개요는 본 분석에서 사용되는 프로토콜을 단계별로 나타낸 것이다. P.의 세균성 식민지 녹농균은 LB 스타터 문화에서 하룻밤 성장한다. 시약 디스펜서를 사용하여 세포를 선택된 화합물을 함유하는 384- 웰 플레이트에 접종한다. 플레이트는 OD 600 GFP 값을 측정 한 후, 6 시간 동안 배양한다. 이러한 읽기 아웃, 식별 할 수 있습니다 C 디 GMP의 세포 수준에 영향을 미치는 화합물을 사용. 을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
. 그림 2. 분석을 심사 소형 분자에 사용되는 384 웰 플레이트지도 라이브러리 (하늘색)의 화합물은 웰 A1로 분주된다 - P22를. DMSO는 웰 A24 추가 1 %의 최종 농도를 함유 P23과 "대조군"(초록색) -은 "양성 대조"(적색) (50) / ml의 토 브라 마이신 설페이트 웰 A23에 첨가 μg의 최종 농도로 이루어지는 - P24. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
한 384 잘 선별 플레이트 그림 3. 대표 결과. Representative 원시 데이터는 OD 600 (A) 및 GFP (B)에 대한 것입니다. 뜨거운와 컬러 그라데이션 열지도 (적색 : OD 600 = 0.65 GFP = 25)의 냉각 (녹색 : 600 = 0.10 GFP = 40,000 OD) 높은 값을 둘러 나타내는 색상이, 잘 값에 적용되었습니다. DMSO를 제어에 비해 높은 OD 600 / GFP 판독이 우물은 녹색으로 될 경향이있는 동안 DMSO 대조군에 낮은 OD 600 / GFP 판독 상대가 우물 빨간색으로하는 경향이 있습니다. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.
384 웰 플레이트에 대한 계산 된 억제율에 대한도 4는 대표 결과. 분석 된 억제율 (%) 데이터는 OD (60)의 모두에 표현되는0 (A) 및 GFP (B) 아웃 판독. 뜨거운와 컬러 그라데이션 열지도 (적색 : OD 600 = -150 % 또는 GFP = 20 %)이 (녹색 : OD 600 = 100 % 또는 GFP = 100 %) 냉각 색상이 높은 억제 값을 둘러 나타내는되었습니다 웰 값을 적용 하였다. 잠재적 성장과 세포를 억제하는 작은 분자, C 디 GMP 잠재적 성장과 세포 내 C 디 GMP 수준을 촉진 작은 분자가 빨간색으로되는 경향 반면 녹색 경향이 있습니다. 여기를 클릭하세요 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 이 그림의.
각 테스트 작은 분자. 각각의 작은 분자에서 획득 %의 억제 (OD600 / GFP) 그림 5. 대표 분산 형 플롯은 점과 % 억제 분포로 표현된다외경 600 (A) 및 GFP (B)의 각각에 대해 읽기 사를받습니다. ± 50 % 차단은 히트 식별을 위해 선택됩니다. 잠재적 인 안타가 빨간색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도즈에서도 6 대표 결과 -. 이전 화면에서 확인 응답 분석 두 화합물 (전위 성장 억제제 A 및 전위 C 디 GMP 억제제 B)는 상기 (2)의 최고 농도가 10 포인트 용량 반응 분석에서 시험 mM의 두 배 희석 시리즈. 158 μM과 193 μM의 IC 50 값은 각각 데이터에 대한 4- 파라미터 로지스틱 방정식을 수득 피팅. PLEASE이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
세균 감염의 치료를 개선하기 위해서, 분자 레벨에서 규정 세균 동작에 대한 이해가 요구되는 것은 명백하다. 여기에 설명 된 절차를 조작하거나 박테리아 C 디 GMP의 세포 농도를 방해 할 가능성이있는 작은 분자를 발견하고자하는 미생물, 생화학 및 임상에 도움이 될 것이다. 상기 방법은 P. C의 디 GMP의 세포 수준을 모니터링하기 위해 최근 개발 된 GFP bioreporter를 이용 녹농균 12. 이 때 중요한 것은 bioreporter는 배양 5 % LB의 PBS에 사용되는 균주의 성장에 영향을 미치지 않도록 검증되고 도시되었다. 생체 내에서 C 디 GMP 수준을 변경하는 작은 분자를 식별하는 전체 셀 스크린의 사용은 특히 그람 음성균들 통해 박테리아 세포막을 통해 분자의 침투면에서 목표 기반 신약 개발의 주요 어려움을 극복 . 중요한 것은, t그는 분석 0.5이 최신 모든 화면에서 관찰되었다 지속적으로 위의 강력한 Z '값으로 매우 강력한 나타납니다. 억제 및 / 또는 세포 내 P. C 디 GMP 수준을 촉진 작은 분자들을 드러내이 프로토콜을 이용하여 스크리닝 녹농균. 또한,이 분석은 살균 또는 OD 600 독출 감소 결과 제균 화합물을 식별하는 잠재력을 갖는다.
프로토콜 절에서 설명하지 않지만 실험의 제조를위한 몇 가지 중요한 고려 사항이된다. GFP의 bioreporter이 플라스미드를 기반으로 명심하는 것이 중요합니다. 리포터 플라스미드를 P. 매우 안정한 것으로 알려져 있지만 녹농균, 그것은 따라서, 연속 재 도금 후 C 글리세롤 스톡 °에서 -80 갓 도금 균주를 사용할 필요가 분실 형광 발현을 확인하는 것은 중요 할 수있다. 이 화면 전체에서 균일 한 성장 조건을 유지하기 위해 매우 유용이러한 조건에서 어떤 변동이 화면에 노크에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 이 매체와 항생제 배치에서 사전 제작하고 화면의 과정 전반에 걸쳐 사용되는 특정 만드는 포함한다. 세균성 문화 균일 한 방식으로 (OD 600 읽기 아웃 기준) 성장하지 것은이 자연의 가장 높은 처리량 화면에 대한 일반적인 문제입니다. 이 효과 또는 판으로 비 균일 박테리아 문화를 분배 가장자리로 인해 수 있습니다. 전자의 경우, 배양시 사용되는 가스 투과성 시일이 중요하다 확인하고. 후자, 문화의 부피와 액체 핸들러 튜브를 프라이밍 동안 적어도 세 시간은 튜브 자체의 죽은 볼륨을 권장합니다. 분배하는 동안 최소한의 속도로 자석 교반기를 유지하는 것이 중요하다. 모니터링하고 실험에 걸쳐 일관된 성장 384- 웰 플레이트의 기억이 가장 중요하지만, 방지하는 상황이 해제를 일으킬 수있는 동안 배양 판의 적층이며성장 패턴의 왜곡으로 이어지는 산소 그라디언트를 원했다. 이는 대조군으로 사용되는 DMSO 비히클 부정적인 관심의 균주의 성장에 영향을받지 않도록하는 것이 중요하다. 성장과 관련된 많은 문제점이 검사 전에 관심의 균주와 모의 화면을 수행함으로써 방지 될 수있다. C 디 GMP 억제 결과 세포 밀도의 변화를 수정해야 임의의 형광 강도의 단위 변화에 의해 계산되는 주어진 또한 데이터 해석 장점 고려. 이에 숙지 다른 수식이 실험에서 출력 된 데이터가 또한 고려되어야 평가한다. 예를 들어, 화합물은 C-디 GMP 억제제로 나타날 수 있지만, 실제로는 식별 히트 신중한 해석을 필요로 성장 억제제 또는 그 반대가 될.
이것의 개발 및 성능시 고려해야 할 몇 가지 단점과 한계가 있습니다높은 처리량 셀 기반 화면. 예를 들어, 검출 가능성 특성 화면에서 사용하는 작은 분자에 의해 영향을받을 수있는 형광 프로브를 사용하여 셀룰러 C 디 GMP 수준의 간접 측정에서 생체 리포터 기능한다. 접선 문제는 세포 기반 분석법은 세포 내 C 디 GMP의 레벨 변화 뒤에기구에 관하여 어떠한 정보를 제공하지 않는다는 사실이다. 따라서, 실험에서 중요한 관찰은 박테리아 세포 내 C 디 GMP 변동을 측정하기위한 "금 표준"에있어서 고려하는 고성능 액체 크로마토 그래피 질량 분석 방법을 이용하여 확인한다. 세균 세포 (생체 내) 호스트의 맥락에서 성장 더욱이 우리 절차는 시험 관내에서 성장 세균의 행동에 관한 정보를 제공 할 수있다 빨리 인해 환경 활동을 수정합니다. 또한, GFP에 bioreporter를 사용하는 프로세스는 화면하지 않는 수단박테리아 세포의 계정에 생리 학적 상태를 표시합니다. 그러나, 프로토콜은 화면 중에 개별 웰 미세 모니터링하도록 구성 될 수있다.
심지어 이러한 고려 사항 및 제한 사항이 높은 처리량 분석은 아직 세포 내 C 디 GMP 수준을 방해 할 수있는 작은 분자에 대한 강력한 화면입니다. 많은 병원성 세균을 포함한 많은 미생물 종 세포 C 디 GMP 수준의 변조를 특성화하기 위해 연구되어 있기 때문에, 우리의 프로토콜은 다양한 세균 종에 적용하고보다 복잡한 multispecies 박테리아 모델 연구로 확장 될 수있다. 상기 분석은 쉽게 성장 조건을 사용하거나 다른 bioreporters를 사용하여 다른 출력을 판독하도록 구성 될 수 변경하여 다른 세균 종에 대해 최적화 될 수있다. 다양한 배양 시간은 관심의 성장 단계에 따라 적용될 수있다. 최대 크기를 조절하거나 관통 넣어 증가 그러나, 그것은 importan입니다 t는 박테리아가 여전히 판 준비 및 판독 측정하는 동안 성장한다 염두에 두어야합니다. 따라서이 프로토콜을 사용하여 한번에 15 판 최대 스크리닝 할 것을 권장한다. 또한, 이상의 384 우물에 플레이트를 사용하여 추가 최적화를 필요로 균일 한 성장을 허용하지 않을 수 있습니다. 플레이트의 수를 확장 할 때, 수동 전자 피펫 대신 액체 핸들링 로봇을 이용하여 접종하는 것이 더 적절할 수있다. 이 프로토콜은 안티 생물막 화합물 C 디 GMP 신호 간섭하여 주어진 생물막 분산 소분자를 조사하는데 사용될 수 있음을 알 수있다. 프로토콜은 또한 세균 생리학의 다양한 양태를 재개발 이해 될 수있다. 주어진 C 디 GMP 시그널링은 우리가 그들의 작동 메커니즘 C 디 GMP 시그널링을 필요로하는지 여부를 결정하기 위해 다른 화학적 자극을 식별 할 수있는이 프로토콜을 사용하여 이들 미생물의 physiologies을 연구함으로써, 대부분의 세균에 보급된다.
_content는 "> 요약하면,이 프로토콜에 제시된 방법의 견고성과 기능성은 C 디 GMP 많은 생물학적 시스템에서 신호의 화학 변조기의 식별에 도움이됩니다.Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG | |
| Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG | |
| Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L | |
| Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 | |
| Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML | |
| Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 | |
| 2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 | |
| BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 | |
| Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
| BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilize by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA | |
| 384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 | |
| Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 | |
| VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 | |
| 100 ml sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 | |
| AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 | |
| Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |
References
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