Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Michael Allen Stiffler; Subu K Subramanian; Victor H Salinas; Rama Ranganathan

doi:10.3791/54119

Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

10.5K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/54119

⸱

3. Juli 2016

Michael Allen Stiffler¹ , Subu K Subramanian¹ , Victor H Salinas¹ , Rama Ranganathan¹

¹Green Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen ein Protokoll für die funktionelle Bewertung umfassender single-site Sättigungsmutagenese Bibliotheken von Proteinen Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet. Wichtig ist, nutzt dieser Ansatz orthogonalen Primerpaare Bibliothek Konstruktion und Sequenzierung zu multiplexen. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von TEM-1 β-Lactamase in klinisch relevanter Dosierung von Ampicillin ausgewählt werden bereitgestellt.

Zusammenfassung

Ortsgerichtete Mutagenese wird seit langem als Methode zur Untersuchung der Struktur, Funktion und Evolution von Proteinen verwendet. Jüngste Fortschritte in der massiv-parallelen Sequenzierungstechnologie haben die Möglichkeit eröffnet, die funktionellen oder Fitnesseffekte einer großen Anzahl von Mutationen gleichzeitig zu bewerten. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur experimentellen Bestimmung der Auswirkungen aller möglichen Einzelaminosäuremutationen in einem Protein von Interesse unter Verwendung der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie vor, am Beispiel des 263-Aminosäure-Antibiotikaresistenzenzyms TEM-1 β-Lactamase. Bei diesem Ansatz wird eine Gesamtprotein-Sättigungsmutagenese-Bibliothek durch ortsgerichtete mutagene PCR konstruiert, wobei jede Position einzeln auf alle möglichen Aminosäuren randomisiert wird. Die Bibliothek wird dann in Bakterien umgewandelt und auf ihre Fähigkeit hin ausgewählt, Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika zu verleihen. Der Fitnesseffekt jeder Mutation wird dann durch Tiefensequenzierung der Bibliothek vor und nach der Selektion bestimmt. Wichtig ist, dass dieses Protokoll Verfahren einführt, die die Lesetiefe der Sequenzierung maximieren und die gleichzeitige Selektion der gesamten Mutationsbibliothek ermöglichen, indem benachbarte Positionen in Längengruppen gemischt werden, die durch die Leselänge der Hochdurchsatzsequenzierung untergebracht sind, und orthogonale Primer verwendet werden, um jede Gruppe zu codieren. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung dieses Protokolls werden durch die Bewertung der Fitnesseffekte aller einzelnen Aminosäuremutationen in TEM-1 bei einer klinisch relevanten Dosierung von Ampicillin erzielt. Die Methode sollte leicht auf andere Proteine erweiterbar sein, für die ein Hochdurchsatz-Selektionsassay vorhanden ist.

Einleitung

Mutagenese wurde lange im Labor verwendet worden, um die Eigenschaften von biologischen Systemen und ihre Entwicklung zu studieren, und mutierte Proteine oder Organismen mit verbesserten oder neuen Funktionen zu erzeugen. Während die ersten Ansätze auf Methoden verlassen , die in Organismen zufällige Mutationen erzeugen, Forscher das Aufkommen der rekombinanten DNA - Technologie ermöglicht die Einführung wählen Änderungen an DNA in einer ortsspezifisch, dh., Ortsgerichtete Mutagenese ^1,2. Mit den derzeitigen Techniken, typischerweise unter Verwendung von mutagenen Oligonukleotide in einer Polymerase - Kettenreaktion (PCR) ist es relativ leicht z....