Wir haben ein Protokoll zur Vorbeugung von Hitzestresseffekten bei Ratten durch orale Vorbehandlung mit nützlichen Bakterien beschrieben. Dieses Protokoll kann modifiziert und für verschiedene Verabreichungswege und für die Analyse verschiedener Verbindungen verwendet werden.
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Methodenartikel
Prävention von Hitzestress Unerwünschte Wirkungen bei Ratten durch
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Studie wurde entworfen , um die Schutzwirkung des Bacillus subtilis Stamms gegen Komplikationen Stress aufzuheizen Bezug zu bewerten. Zweiunddreißig Sprague-Dawley-Ratten wurden in dieser Studie verwendet. Die Tiere wurden oral zweimal täglich für zwei Tage mit B behandelt subtilis - Stamm BSB3 oder PBS. Am nächsten Tag nach der letzten Behandlung wurde jede Gruppe eingeteilt und zwei experimentelle Gruppen (eine mit PBS behandelt und eine mit B. subtilis - behandelt) wurden für 25 min bei 45 o C gebracht. Zwei Kontrollgruppen waren für 25 Minuten bei Raumtemperatur. Alle Ratten wurden eingeschläfert und verschiedene Parameter wurden in allen Gruppen analysiert. Unerwünschte Wirkungen von Hitzestress werden durch die Abnahme der Zotten Höhe und Gesamt Mukosadicke im Darmepithel registriert; Translokation von Bakterien aus dem Lumen; Vesikulation von Erythrozyten und Erhebung der Lipopolysaccharide (LPS) im Blut erhöht. Die schützende Wirksamkeit der Behandlung wird durch pre ausgewertetErfindung dieser Nebenwirkungen. Das Protokoll wurde für die orale Behandlung von Ratten, die mit Bakterien zur Verhinderung von Hitzestress Komplikationen eingerichtet, aber dieses Protokoll kann auch für andere Verabreichungswege und für die Analyse verschiedener Verbindungen modifiziert und verwendet werden.
Einleitung
Unterschiedliche Stressoren beeinflussen die Gesundheit von Mensch und Tier. Die Temperatur ist einer der stressigsten Faktoren und führt zu chronischen, akuten und sogar tödlichen Erkrankungen1. In vielen Fällen wurden Veränderungen in der Darmmorphologie und ein Verlust der Integrität der Darmbarriere nach Hitzestress dokumentiert2,3. Diese Schutzbarriere ist für die Abwehr der Translokation von Darmbakterien und ihren Toxinen, insbesondere Lipopolysacchariden (LPS), aus dem Lumen in den inneren Kreislauf verantwortlich4,5. Die Stabilität der Darmmikrobiota beeinflusst maßgeblich die Funktion der Darmbarriere, die Immunantwort des Wirts und die Toleranz gegenüber Stressbedingungen6. Somit kann die Modulation der Darmmikrobiota einen neuartigen Ansatz zur Prävention von stressbedingten Nebenwirkungen bieten.
Nützliche Bakterien wurden als vielversprechende Strategie verwendet, um die Darmmikrobiota für eine erfolgreiche Behandlung verschiedener klinischer Zustände wie Durchfall, entzündliche Darmerkrankungen, atopische Dermatitis, Stoffwechselstörungen7-10 zu modifizieren. Zu den probiotischen Wirkungen nützlicher Bakterien gehören die Produktion von essentiellen Metaboliten zur Unterstützung der Darmgesundheit, die Stimulation des Immunsystems, die Förderung der Laktosetoleranz und die Wiederherstellung der epithelialen Dysfunktion. Probiotika erwiesen sich wirksam bei der Vorbeugung der stressbedingten Komplikationen in vitro und in Tiermodellen11,12.
Forscher haben Bacillus-Bakterien als Probiotika mehr Aufmerksamkeit geschenkt, weil diese Bakterien die Darmhomöostase unterstützen13 und positive Auswirkungen auf den Wirthaben 14. Unsere bisherigen Daten zeigten eine hohe Wirksamkeit von Bacillus-Probiotika gegen Krankheitserreger in vitro15,16 und in klinischen Studien17,18. Hier wollen wir die präventive Wirkung von B. subtilis BSB3 Stamm gegen Komplikationen nach Hitzestress untersuchen.
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Protokoll
Alle experimentellen Verfahren wurden von IACUC der Auburn University, Auburn, Alabama genehmigt.
1. Herstellung von Kulturmedien, Geschirr und Bakterienkultur
- Impfen 10 ml Nährlösung in einem Kolben mit einer einzelnen Kolonie von Bacillus subtilis BSB3 Kultur, über Nacht auf einem Nährstoff - Agar - Platte gewachsen.
- Machen 500 ml Sporulationsmedium 19 (pro Liter: Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (w / v) KCl, 10 ml; 1,2% (w / v) MgSO4 x 7 H 2 O, 10 ml, Agar, 15 g) und Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. Lassen Sie auf 50 o C abkühlen und fügen Sie die folgenden sterilen Lösungen: 1 M Ca (NO 3) 2, 1 ml; 0,01 M MnCl 2, 1 ml; 1 mM FeSO 4, 1 ml.
- Kühlen hergestellte Medium bis 40 o C für 20 min bei Raumtemperatur und gießt 25 ml in jede von 20 sterilen Petrischalen im Sterilschrank. Lassen Sie das Medium über Nacht erstarren.
- Verteilt 0,5 ml Übernachtkultur von Bacillus subtilis BSB3 auf die Oberfläche des Mediums in den Petrischalen. Inkubiere Kultur bei 37 ° C für 5 Tage , bis 90% der Sporulation. Reveal Phase helle Sporen durch die hochauflösende Mikroskopie.
- Ernte Bakterien durch Zugabe von 1 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf die Platte und Abkratzen Bakterien von einer Oberfläche eines sterilen Zell Spreizer verwendet wird. Bewahren Sie die Suspension in den Kühlschrank stellen, bis sie benötigt.
- Bestätigen Lebensfähigkeit der Bakterien durch 0,1 ml der geeigneten Verdünnung Plattierung (10 -5 bis 10 -6) einer Bakteriensuspension auf Sporulationsmedium Platten gefolgt von einer Inkubation für 18-24 Stunden bei 37 o C.
- Graf Bakterienkolonien auf den Platten eine Kolonie Zähler mit und berechnen den Titer von Bakterien in der getesteten Suspension. Vorbereitung Bakteriensuspension mit der Endkonzentration 1 x 10 8 CFU / ml in PBS.
2. Tiere
- Verwenden Sie 32 männliche Sprague-Dawley-Ratten (250 - 300 g,). Pflegen Tiere unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit freiem Zugang zu Standard-Pelletfutter und Wasser. Stellen Sie eine mittlere Temperatur (21 ± 1 ° C), Feuchtigkeit (50 ± 5%) und eine 12 - Stunden Licht-Dunkel - Zyklus.
3. Experimentelles Design
- Starten Sie Behandlung von Tieren durch orale Gabe 11, nach 2 Tagen der Akklimatisierung. Verwenden Sie Spritze mit der Schlundsonde Nadel. Behandeln Sie 16 Ratten , die mit B. subtilis BSB3 Suspension (1 ml pro Ratte) zweimal täglich für zwei Tage (B. subtilis - Gruppe). Behandeln Sie 16 Ratten , die mit PBS (1 ml pro Ratte) zweimal täglich für zwei Tage (PBS - Gruppe) (Abbildung 1).
- Nach der Behandlung unterteilen jede Gruppe (8 Ratten pro Gruppe): Gruppe 1- Kontrolle (PBS / kein Stress), Gruppe 2 - B subtilis (B. subtilis / kein Stress), Gruppe 3 - Stress (PBS / Hitzestress) und Gruppe 4- B. subtilis + Spannung (B. subtilis / Hitzestress).
- Messen Sie die Temperatur rektal jeder Ratte unter Verwendung eines elektronic digitales Thermometer. Halten Ratten der Gruppen 1 und 2 bei Raumtemperatur für 25 min. Ort Tiere der Gruppen 3 und 4 in einer Klimakammer bei 45 o C und die relative Luftfeuchtigkeit 55% für 25 min.
- Anschließend messen die rektale Temperatur jeder Ratte in allen Gruppen eine elektronische Digitalthermometer verwenden. Legen Sie alle Tiere bei Raumtemperatur für 4 Stunden.
- Anesthetize Ratten mit Isofluran (2-4%) in ein verschließbares Gefäß Anästhesie und beobachten, bis die Ratten tief anästhesiert (keine Antwort auf Zehe Prise). Euthanize Ratten durch schnelle Enthauptung mit einer Guillotine.
- Sammeln Stamm Blut von jeder Ratte 20 (15 - 16 ml) mit den apyrogene Pipetten in apyrogene Röhren Serum zu erhalten und sofort nehmen Proben von Blut (7 ul von jeder Ratte) mit einer Pipette für die mikroskopische Untersuchung.
- Setzen Sie Röhrchen mit dem Blut in einem Kühlschrank für mindestens 30 min Gerinnen zu ermöglichen. Zentrifugenröhrchen bei 20 ° C, 7000 × g für 10 min und schnellentfernen Serum mit einer Pipette. Aliquot Serum von jeder Ratte in 50 ul - Volumina und bei -20 ° C bis zum Test erhalten.
4. Chirurgische Verfahren
- Cut / trimmen alle Fell aus dem Bauch und Brustkorb der Unterseite der Karkasse mit elektrischen Scheren. Legen Sie die Karkasse in einem sterilen Schrank und behandeln die rasierte Fläche der Karkasse mit 70% Alkohol.
- Verwenden Sie eine sterile Skalpell einen Mittelschnitt des Bauches zu schaffen. Entfernen Leber, mesenterischen Lymphknoten, Milz und Dünndarm von jeder Ratte unter Verwendung von sterilen Pinzetten.
5. Analyse der bakteriellen Translokation
- Platzieren Sie jede Probe von Leber, mesenterischen Lymphknoten und Milz in vorher gewogene sterilen Röhrchen und wiegen. Berechnen des Gewichts der Probe als eine Differenz zwischen dem Gewicht eines Röhrchens mit einer Probe und das Gewicht eines leeren Rohrs.
- Hinzufügen sterile PBS auf das Rohr eine 1:10 Verdünnung zu erhalten (w / v) der Probe und homogerieren jede Probe mit einem sterilen Homogenisator Glasgewebe eine homogene Suspension 21 zu erhalten.
- Stellen Reihenverdünnungen (10 -1 bis 10 -4) jeder Probe in sterilem PBS. Platte 0,1 ml aller Verdünnungen jedes Gewebes auf die Oberfläche von MacConkey des und 5% Blutagar und Brucella Blutagar mit Hämin (0,005 g / l) und Vitamin K1 (0,01 g / L) Platten.
- Inkubieren MacConkey des und 5% Blutagarplatten aerob und Brucella Blutagarplatten unter anaeroben Bedingungen bei 37 o C 22.
- Graf Kolonien von aeroben Bakterien nach 24 Stunden, und Kolonien von anaeroben Bakterien nach 48 h Inkubation eine Kolonie Zähler verwendet wird. Die Ergebnisse sind als die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (CFU) in einem Gramm Gewebe.
6. Die histologische Analyse
- Entfernen Dünndarm Proben aus jeder Ratte durch die chirurgische Prozedur (Schritte von 4,1 bis 4,2). Fix Proben in Bouin-Fixiermittel, einbetten in Paraffin,Vorbereitung 6 um Abschnitte und Fleckenabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardverfahren 23.
- Verwenden , um eine hochauflösende Mikroskopsystem für die Höhe der Darmzotten Messung und Gesamtschleimhautdicke in jeder Probe (Vergrßerung 100X) 24. Analysieren 4 Proben von jeder Ratte und machen mindestens zwanzig Messungen in jeder Probe. Express-Ergebnisse in Mikrometer.
7. Zytokin-Assay
- Verwenden Sie kommerzielle Ratte ELISA-Kits für IL-1β; IL-6; TNF-α; INF-γ und IL-10-Niveaus von Zytokinen in Serum zu messen, gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Generieren von Standardkurven für jeden Probensatz unter Verwendung von Standards für den entsprechenden Kit getestet. Definieren Sie die Ebene von Zytokinen in jeder Probe durch Vergleich der experimentellen Daten mit der entsprechenden Standardkurve.
8. Lipopolysaccharide Assay
- Analysieren Niveau von LPS in Serum eine Ratte LPS ELISA-Kit nachProtokoll des Herstellers. Schätzung Konzentration von LPS in den Proben durch Vergleich der erhaltenen Werte mit den Werten der Standardkurve.
9. Hohe Auflösung Lichtmikroskopie des Blutes
- Verwenden Sie das Mikroskopsystem vorher 25,26 beschrieben. Verwenden Sie eine Schwingungsisolationsplattform als Basis für das Mikroskopsystem und Videokamera und Computer 25 , um die Live - Bilder aufzunehmen. Kalibrieren Sie Testbilder einen Richardson Schlitten unter Verwendung von wie zuvor 27 beschrieben.
- Legen 7 ul frisch entnommenem Blut von jeder Ratte auf einem Glasobjektträger, Deckglas, Fotografie und aufzeichnen zehn Bildrahmen von 72 × 53,3 & mgr; m 2 in jeder Probe (Vergrößerung 1,700X).
- Messen Sie die Konzentration von Vesikeln mit einer Software, die Direktsicht optische Bilder in Echtzeit mit hoher Auflösung liefert. Untersuchen mindestens 20 Bildrahmen für jeden experimentellen Zustand 28.
10. StatisTics
- Express alle Werte als Mittelwert und Standardabweichung. Führen Sie eine statistische Analyse und Grafik Plotten. Analysieren Sie die Ergebnisse mit den beiden Probe t-Test, stellen Sie das Signifikanzniveau bei 0,05 statistische Signifikanz zu definieren.
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Ergebnisse
Die mittlere Körpertemperatur der Tiere vor und unmittelbar nach der Hitzestress war 36,7 ± 0,07 ° C und 40,3 ± 0,17 ° C, bzw. (P <0,05). Exposition von Ratten gegenüber Wärme (Gruppe 3) führte zu einer signifikanten Hemmung der Zotten Höhe und Gesamtschleimhautdicke (2, 3). Die orale Verabreichung von BSB3 Stamm vor Stress geschützt Darm vor der schädlichen Wirkung von Wärme.
Translok...
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Diskussion
Die Exposition gegenüber hohen Temperaturen führt zu schweren gesundheitlichen Bedingungen 29. Prävention und Früherkennung von Komplikationen zu Hitzestress im Zusammenhang von entscheidender Bedeutung sind 30. Das dargestellte Protokoll kann die Wirksamkeit verschiedener Ansätze zur Verhinderung von Hitzestress nachteiligen Wirkungen zu bewerten, verwendet werden.
Kritische Schritte in diesem Protokoll sind: die Wärmebehandlungsverfahren (45 °<...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Auburn University Fonds FOP 101002-139294-2050.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| Ethylalkohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT, USA | 64-17-5 | |
| Agar | VWR | 97064-334 | |
| MacConkey Agar Platten | VWR | 470180-742 | |
| 5% Blut Agar Platten | VWR | 89405-024 | |
| Brucella Blut Agar Platte mit Hemin und Vitamin K | VWR | 89405-032 | |
| Bouin' s Fixative | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 15990 | |
| IL-10 Ratten-ELISA-Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0101 | |
| IL-1beta Ratten-ELISA-Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0011 | |
| IL-6 Ratten-ELISA-Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC0061 | |
| INF-gamma Ratten-ELISA-Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | ||
| TNF-alpha Ratten-ELISA-Kit | Invitrogen, Camarillo, CA, USA | KRC3011 | |
| Ratten-LPS-ELISA-Kit | NeoBioLab, MA, USA | RL0275 | |
| Klimakammer 6020-1 | Caron, Marietta, OH, USA | 6020-1 | |
| Zentrifuge | Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA | Optima L-90K | |
| Ultra Zentrifuge | |||
| Lichtmikroskop optisches System | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| Koloniezähler | Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA | RE-3325 | |
| Gefrierschrank | Haier, Brooklyn, NY, USA | HCMO50LA | |
| Ultra-Mikroplatte Lesegerät | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx 808 | |
| Auto Strip Washer | Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA | ELx50 | |
| Pipetten | Gilson, Pipetman, Frankreich | P100, P200, P1000 | |
| C24 Inkubator Shaker | New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA | Classic C24 | |
| Schaukelschüttler | Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, USA | 55 | |
| Petrischalen | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, Sanford, ME, USA | SG403 | |
| Kultur-Anbaukolben | Corning Incorporated, Corning, NY, USA | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyerkolben |
| Optisches Spektrometer Genesys 20 | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA. | 4001 | |
| Sony DXC-33 Videokamera | Sony | ||
| Richardson Testobjektträger | Elektronenmikroskopie Wissenschaft, Hatfield, PA, USA | 80303 | |
| Millipore Wasseraufbereitungssystem | Millipore | Direct-Q | |
| Image-Pro Plus Software | Medien Kybernetik, MD, USA | ||
| Triple Beam Balance | OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA | ||
| Gewebe-Homogenisator, Dounce | VWR | 71000-518 |
Referenzen
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