We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.
Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).
Visualisierung großer DNA – Moleküle gebunden auf Glas oder Perlenoberflächen wurde zur Untersuchung von DNA-Protein – Wechselwirkungen, Proteindynamik auf DNA – Substrat, 1,2 und Polymerphysik verwendet. 3,4 Eine Plattform für Single-tethered großen DNA – Molekülen hat ein paar deutliche Vorteile gegenüber anderen DNA Immobilisierungsverfahren. 5 Erstens hat ein großes DNA – Molekül auf der Oberfläche gebunden eine natürliche ungeordneten Konformation ohne Scherströmung, die für ein DNA-bindendes Protein von entscheidender Bedeutung ist seine Bindungsstelle zu erkennen. Zweitens ist es sehr einfach, die chemische Umgebung um DNA-Moleküle für eine Reihe von enzymatischen Reaktionen in einem Strömungsraum zu ändern. Drittens ist ein Mikrofluidik – Scherströmung induziert DNA – Molekular zu 100% der vollen Konturlänge Dehnung auf, was sehr schwierig ist , die alternative DNA – Verlängerung wie Oberflächenimmobilisierung 6 und Nanokanal Haft nähert sich zu erreichen. 7 A vollständig stretched DNA-Molekül stellt auch eine Positionsinformation, die zur Überwachung der enzymatischen Bewegungen auf der genomischen Karte nützlich sein kann.
Dennoch hat die DNA Anbinden Ansatz eine kritische Nachteil dadurch, dass der interkalierende Farbstoff wie YOYO-1 in der Regel verursacht tethered DNA-Moleküle leicht durch Fluoreszenzanregungslicht durchbrochen werden. Im Allgemeinen große DNA-Moleküle mit einem fluoreszierenden Farbstoff zur Sichtbarmachung unter einem Fluoreszenzmikroskop gefärbt werden. Hierzu YOYO-1 oder andere TOTO Reihe Farbstoffe sind in erster Linie verwendet , da diese Farbstoffe nur fluoreszieren , wenn sie doppelsträngige DNA interkalieren. 8 Es ist jedoch bekannt , dass bis-interkalierenden Farbstoffes verursacht lichtinduzierten DNA Photospaltungs weil fluoreszierend gefärbte DNA – Moleküle der Interkalation von Fluorophore. 9 Ferner ist auf der Oberfläche gebunden sind empfindlicher , da Scherströmungen ausüben können Kräfte brechen auf frei DNA – Moleküle bewegen. Daher entwickelten wir FP-DBP als neuartige DNA-Anfärbung Proteinfarbstoff zum Abbilden großer DNA-Moleküle an der Oberfläche gebunden. Der Vorteil der Verwendung von FP-DBP ist , dass es nicht photo Spaltung der DNA – Moleküle bindet , an die verursacht. 10 Außerdem FP-DBP nicht die Konturlänge von DNA nicht erhöht, während bis-interkalierende Farbstoffe , die Konturlänge erhöhen um etwa 33%.
Dieses Video – Methode stellt die experimentellen Ansatz zu einer PEG-Biotin – Oberfläche großer DNA – Moleküle zu binden. Abbildung 1 unterschiedliche Ansätze von Anbindehaltung DNA mit stumpfen Enden und klebrigen Enden zeigt. Somit kann diese Färbemethode für jede Art von DNA – Moleküls angewandt werden. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Strömungskammeranordnung , die durch eine Spritzenpumpe gesteuert werden kann , um Scherströmungen erzeugen , um DNA – Moleküle als auch zu laden , Chemikalien- und Enzym strecken Lösungen. 3 zeigt Mikroaufnahmen von vollständig gestreckten DNA – Moleküle auf der PEGylat gefesselteed Fläche 11 und gefärbt mit FP-DBP.
Hier präsentieren wir eine Plattform zur Visualisierung von langen DNA-Molekülen biotinyliert für auf Oberflächen zu verankern. Wir haben einen Ansatz für die DNA – Moleküle gebunden an eine Avidin Protein beschichtete Oberfläche mit biotinyliertem Rinderserumalbumin berichtet. 6 In der früheren Ansatz, fanden wir eine entscheidende Frage der DNA – Photospaltung durch Bis-Einlagerungs Farbstoffe verursacht wird, die auf die gefesselte DNA – Moleküle Fleck Oberfläche. Da diese kontinuierlich angeregt…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Sogang University Research Grant of 201410036.
1. DNA Biotinylation | |||
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride |
Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
2. Functionalized Surface Derivatization | |||
2.1) Piranha Cleaning | |||
Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22×22 mm, No. 1 Thickness |
Teflon rack | Custom Fabrication | ||
PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
Sulferic acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95 % Purity |
Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35 % in water |
Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99 % Purity |
Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9 % Purity |
Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9 % Purity |
2.3) PEGylation of the coverslip | |||
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Syringe Filter | Sartorius | 16534———-K | |
Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99 % Purity |
Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76x26x1 mm |
3. Assembling a Flow Chamber | |||
Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
Quick-dry Epoxy | 3M | ||
Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
Microscope | Olympus | IX70 | |
EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
Alconox | Alconox Inc. |