Name: Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Visualisierung großer DNA-Moleküle mit FP-DBP-Färbung auf modifizierten Glasoberflächen unter Verwendung mikrofluidischer Scherströmungen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von DNA-Dynamik.

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Diese Arbeit wurde durch das Sogang University Research Grant von 201410036 unterstützt.

1. DNA Biotinylierung <ol><li> Biotinylierung von blunt ended DNA unter Verwendung von Terminal - Transferase (TdT) Hinweis: Die Verwendung von T4-DNA (166 kbp), das eine stumpfe ended DNA ist. <ol><li> Zugabe von 5 &amp; mgr; l von 2,5 mM CoCl 2, 5 &amp; mgr; l 10 × Reaktionspuffer, 0,5 ul 10 mM Biotin-11-dUTP, 0,5 ul terminaler Transferase (10 Einheiten) und 0,5 ul T4 - DNA (0,5 ug / ul) zu dem Reaktionsgemisch. Machen zu einem Endvolumen von 50 &amp; mgr; l von 38,5 &amp; mgr; l Wasser zugegeben. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 1 Stunde. Hinweis: Erweiterte Reaktionszeit kann Ausbeute doppelt angebundenen DNA, dh es ist möglich , dass Biotinen an beiden Enden markiert sind. </li><li> Die Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0,5 M EDTA, pH 8. </li><li> Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Biotinylierung von klebrigen Enden DNA unter Verwendung von DNA - Ligase Hinweis: Verwenden Sie λ-DNA (48,5 kbp), das eine klebrige-End-DNA ist. &lt;ol&gt; <li> 1 ul T4-DNA-Ligase, 5 ul 10 × Ligationspuffer, 1 ul 25 ng / &amp; mgr; l λ-Phagen-DNA, und fügen 43 ul Wasser auf ein Endvolumen von 50 &amp; mgr; l zu machen. </li><li> Halten Sie das Röhrchen bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Funktionalisierte Oberflächenderivatisierung . Hinweis: Um ein Ende eines DNA - Moleküls auf der Glasoberfläche anbinden, eine primäre Amingruppe auf einem Deckglas silanisiert gefolgt von Biotin-PEG - Beschichtung , wie in Figur 1 gezeigt Dieser PEGylierung Prozess ist wichtig für Einzelmolekül - DNA - Bildgebung , da es kann erheblich zufälliges Rauschen durch Anlagerung von unerwünschten Molekülen auf der Oberfläche erzeugt verringern. <ol><li> Piranha Reinigung Hinweis: Piranha-Lösungen reagieren heftig mit organischen Materialien, daher sollte es mit Vorsicht behandelt werden, die nach einer ordnungsgemäßen Sicherheitsrichtlinien. <ol><li> Platz Deckgläser auf einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Rack, und halten Sie sie by PTFE Gewindedichtband der Länge nach, halb auf dem Rand der Oberflächen und zur Hälfte auf dem Rack. Nach dem Wickeln für die Handhabung der Zahnstange während des Reinigungsvorganges ein langes Stück (~ 5 cm) des Bandes verlassen. </li><li> Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit 350 ml H 2 SO 4 und 150 ml H 2 O 2 Piranha - Lösung in einem Abzug zu machen. Legen Sie das Rack in Piranha-Lösung für 2 Stunden. </li><li> Leere Piranha-Lösung aus dem Becher und rinse Deckgläser gründlich mit entionisiertem Wasser, bis der pH des Wassers in dem Becher erreicht neutral. Verwenden Sie pH-Papierstreifen. </li><li> Beschallen die Racks von Deckgläsern in den Becher Wasser, 30 min. Leere Wasser aus dem Becher kurz vor Amino Silanisierung. Verwenden Sie 75 W von Beschallungsleistung zu reinigen und zu derivatisieren die Glassubstrate. </li></ol></li><li> Aminosilanisierung auf der Glasoberfläche <ol><li> 2 ml N - [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylendiamin und 10 ml Eisessig zu 200 mlMethylalkohol in einem sauberen Polypropylenbehälter für die Aminosilanisierung Lösung vorbereitet. </li><li> Legen gereinigt Deckgläser in der Polypropylenbehälter. Schüttle sie bei 100 Upm und Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Beschallen den Becher mit derivatisierten Abdecküberzüge für 15 min bei 75 W für mindestens 30 min schütteln sie bei 100 Umdrehungen pro Minute und Raumtemperatur. </li><li> Entleeren der Lösung aus dem Becherglas und spülen Deckgläser vorsichtig einmal mit Methylalkohol und zweimal mit Ethylalkohol. Shop Deckgläser in Ethylalkohol und nutzen sie innerhalb von zwei Wochen. </li></ol></li><li> PEGylierung des Deckplättchens <ol><li> Machen 10 ml 0,1 M Natriumbicarbonat (NaHCO 3). Filtern der Lösung mit einem 0,22 um-Spritzenfilter. </li><li> Man löst 2 mg Biotin-PEG-Succinimidylcarbonat (Biotin-PEG-SC) und 80 mg PEG-Succinimidyl - valerat (mPEG-SVG) in 350 &amp; mgr; l NaHCO 3. Verwenden Sie ein Lichtschutzrohr. </li><li> Mischen Sie den Schlauch kräftig für 10 sec, und es Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min zu entfernen Blasen. </li><li> Spülen einen Glasobjektträger mit Aceton und anschließend mit Ethylalkohol gespült. Lassen Sie den Schieber vollständig an der Luft trocknen. </li><li> Einen Tropfen (50 ul) von PEG-Lösung auf dem sauberen Glas-Objektträger. Decken Sie die Tröpfchen sanft mit einem Amino silanisiert Deckglas, ohne Blasen zu erzeugen. </li><li> Die Objektträger für 3 Stunden bis über Nacht in einem dunklen, gut eingeebnete feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen leeren Pipettenspitzenhalter als die Kammer, mit Wasser auf dem Boden. Siegel Rest PEG-Lösung in dem Rohr und halten sie bei 4 ° C. </li><li> Spülen Sie die pegyliertes Deck gründlich mit entsalztem Wasser. Bewahren Sie es in einem dunklen und trockenen Ort bis zum Gebrauch. </li></ol></li></ol> 3. Montage einer Flusskammer <ol><li> Fabrizieren ein gestanztes Acrylhalter, wie in Abbildung 2. Stellen Sie sicher , dass der Durchmesser der Rohreinsatz 0,762 mm ist, und bezeichnen ein Loch ein Einlass ist und das andereeinen Auslass (Abbildung 2). </li><li> Legen Sie doppelseitige Klebeband Streifen (Breite 5-6 mm) auf einem Acryl-Halter (Abbildung 2), Ausrichten senkrecht zu einer Ein- und Austrittsloch, keine Kanalbohrungen gestört. Verwenden Sie diese Bandstreifen als Mehrkanalwände Kammern zu machen. Schrubben Sie das Band mit einer Pipettenspitze. </li><li> Legen Sie ein pegyliertes Deckglas auf der Oberseite, um die Strömungskammern machen, mit dem PEGylierten Seite nach unten. </li><li> Um eine Lösung nicht auslaufen, drücken Sie die Spitze eines Deckglases über den Bereich, in dem doppelseitigen Klebebändern platziert werden. Fügen Sie schnell trocknend Epoxidkleber die Ränder der Kammer am oberen und am unteren Rand (gelbe Farbe in Abbildung 2) zu schließen. </li><li> Verbinden ein kurzes Stück (2,5 cm) der Rohrleitung (Außendurchmesser OD, 0,042 &quot;) zu einer gasdichten Spritze und Abdichten der Verbindung mit Epoxy-Klebstoff. </li><li> Verbinden eine lange flexible Schlauch (OD: 0,03 &quot;), um den Schlauch an der Spritze verbunden, und abdichten das Gelenk mit Epoxidkleber. </li><li> Füllen Sie den tubing an der Spritze mit DI-Wasser verbunden. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblase. </li><li> Legen Sie den Schlauch in das Loch der Strömungskammer mit Epoxid-Kleber versiegelt. </li><li> Legen Sie eine gelbe Spitze (200 ul Spitze) auf der anderen Loch als Reservoir. </li></ol> 4. Probe Laden in Flusskammer Hinweis: Neutravidin kann mit anderen Proteinen Avidin wie Streptavidin ersetzt werden. Alle Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden, es sei denn, es erwähnt wird. Nehmen Probenlösung in einem gelben Spitze, und installieren Sie die Spitze mit der Lösung auf das Loch von Acrylhalter (Abbildung 2b). <ol><li> Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe bei 50 &amp; mgr; l / min. Last 20 ul Avidin-Protein (25 ug / ml in T50-Lösung, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), und halten Sie es für 10 Minuten. </li><li> Last 20 ul biotinylierten Oligodesoxynukleotide (100 &amp; mgr; M in 1 × TE), und halten Sie es für 10 Minuten. Wenn Terminal-Transferase verwendet wird, lassen Sie die Ladevon Oligodesoxynukleotide. </li><li> Last 20 ul DNA-Lösung aus Schritt 1 in die Strömungskammer mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ul / min und Halten für 30 min. </li><li> Waschen Sie die Flusskammer mit 1 × TE und laden 40 ul FP-DBP 10 (~ 80 nM). </li><li> Beobachten DNA unter einem Fluoreszenzmikroskop mit kontinuierlichen Fluss von Anfärben Moleküle in 1 × TE auf einem 60X Objektiv. Verwenden 488 nm Festkörperlaser zur Anregung von FP (eGFP) -DBP. Für volle Strecke von DNA-Molekülen, gelten unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten entsprechend den DNA-Längen verwendet. So gelten beispielsweise 50 &amp; mgr; l / min für 48,5 kbp von λ-DNA und 100 &amp; mgr; l / min für 166 kbp von T4 DNA. <ol><li> Für das Recycling des Acrylhalter tränken montierten Strömungskammern in einem Haushalt Reinigungslösung 12. Entfernen Sie Bänder und Epoxy mit einer Rasierklinge und reiben mit den Händen völlig sie auszuziehen. Unclog Löcher mit Spritzennadeln. Halten Sie die Halter in entsalztem Wasser bis zur weiteren Verwendung. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
<li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier präsentieren wir eine Plattform zur Visualisierung von langen DNA-Molekülen biotinyliert für auf Oberflächen zu verankern. Wir haben einen Ansatz für die DNA - Moleküle gebunden an eine Avidin Protein beschichtete Oberfläche mit biotinyliertem Rinderserumalbumin berichtet. 6 In der früheren Ansatz, fanden wir eine entscheidende Frage der DNA - Photospaltung durch Bis-Einlagerungs Farbstoffe verursacht wird, die auf die gefesselte DNA - Moleküle Fleck Oberfläche. Da diese kontinuierlich angeregten Fluorop...

Visualisierung großer DNA - Moleküle gebunden auf Glas oder Perlenoberflächen wurde zur Untersuchung von DNA-Protein - Wechselwirkungen, Proteindynamik auf DNA - Substrat, 1,2 und Polymerphysik verwendet. 3,4 Eine Plattform für Single-tethered großen DNA - Molekülen hat ein paar deutliche Vorteile gegenüber anderen DNA Immobilisierungsverfahren. 5 Erstens hat ein großes DNA - Molekül auf der Oberfläche gebunden eine natürliche ungeordneten Konformation ohne Scherströmung, die für ein DNA-bindendes Protein von entscheidender Bedeutung ist seine Bindungsstelle zu erkennen. Zweitens ist es sehr einfach, die chemische Umgebung um DNA-Moleküle für eine Reihe von enzymatischen Reaktionen in einem Strömungsraum zu ändern. Drittens ist ein Mikrofluidik - Scherströmung induziert DNA - Molekular zu 100% der vollen Konturlänge Dehnung auf, was sehr schwierig ist , die alternative DNA - Verlängerung wie Oberflächenimmobilisierung 6 und Nanokanal Haft nähert sich zu erreichen. 7 A vollständig stretched DNA-Molekül stellt auch eine Positionsinformation, die zur Überwachung der enzymatischen Bewegungen auf der genomischen Karte nützlich sein kann. Dennoch hat die DNA Anbinden Ansatz eine kritische Nachteil dadurch, dass der interkalierende Farbstoff wie YOYO-1 in der Regel verursacht tethered DNA-Moleküle leicht durch Fluoreszenzanregungslicht durchbrochen werden. Im Allgemeinen große DNA-Moleküle mit einem fluoreszierenden Farbstoff zur Sichtbarmachung unter einem Fluoreszenzmikroskop gefärbt werden. Hierzu YOYO-1 oder andere TOTO Reihe Farbstoffe sind in erster Linie verwendet , da diese Farbstoffe nur fluoreszieren , wenn sie doppelsträngige DNA interkalieren. 8 Es ist jedoch bekannt , dass bis-interkalierenden Farbstoffes verursacht lichtinduzierten DNA Photospaltungs weil fluoreszierend gefärbte DNA - Moleküle der Interkalation von Fluorophore. 9 Ferner ist auf der Oberfläche gebunden sind empfindlicher , da Scherströmungen ausüben können Kräfte brechen auf frei DNA - Moleküle bewegen. Daher entwickelten wir FP-DBP als neuartige DNA-Anfärbung Proteinfarbstoff zum Abbilden großer DNA-Moleküle an der Oberfläche gebunden. Der Vorteil der Verwendung von FP-DBP ist , dass es nicht photo Spaltung der DNA - Moleküle bindet , an die verursacht. 10 Außerdem FP-DBP nicht die Konturlänge von DNA nicht erhöht, während bis-interkalierende Farbstoffe , die Konturlänge erhöhen um etwa 33%. Dieses Video - Methode stellt die experimentellen Ansatz zu einer PEG-Biotin - Oberfläche großer DNA - Moleküle zu binden. Abbildung 1 unterschiedliche Ansätze von Anbindehaltung DNA mit stumpfen Enden und klebrigen Enden zeigt. Somit kann diese Färbemethode für jede Art von DNA - Moleküls angewandt werden. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Strömungskammeranordnung , die durch eine Spritzenpumpe gesteuert werden kann , um Scherströmungen erzeugen , um DNA - Moleküle als auch zu laden , Chemikalien- und Enzym strecken Lösungen. 3 zeigt Mikroaufnahmen von vollständig gestreckten DNA - Moleküle auf der PEGylat gefesselteed Fläche 11 und gefärbt mit FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. DNA-Biotinylierung</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) Biotinylierung von stumpfer DNA mittels terminaler Transferase (TdT)</td></tr><tr><td>terminaler Transferase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Geliefert mit 10x Reaktionspuffer, 2,5 mM Kobaltchlorid</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP ist ebenfalls verfügbar</td></tr><tr><td>T4GT7 Phagen-DNA</td><td>Nippon-Gen</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">1.2) Biotinylierung von klebriger End-DNA unter Verwendung von DNA-LigaseT4-DNA-Ligase</td></tr> <tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Ausgestattet mit 10x Reaktionspuffer</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Auch erhältlich bei New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>2. Funktionalisierte Oberflächenderivatisierung</td></tr><tr><td colspan="4">2.1) Piranha-Reinigung</td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050 22</td><td>mm x 22 mm, Nr. 1 Dicke</td></tr><tr><td>Teflongestell</td><td></td><td></td><td>Kundenspezifische Fertigung</td></tr><tr><td>PTFE-Gewindedichtungsband</td><td>Han Yang Chemical Co. Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon & Handel Klebeband</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H2SO4, 95% Reinheit</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>H290423</td><td>H2O2, 35% in Wasser</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Tisch-Ultraschallreiniger</td></tr><tr><td colspan="4">2.2) Aminosilanisierung auf Glasoberfläche</strong</td></tr><tr><td>>N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] Ethylendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99%</td></tr><tr><td>Reinheit Methylalkohol</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>M300318</td> Polypropylenbehälter mit <td>einer Reinheit von 99,9 %</td></tr><tr><td></td><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300202</td><td>99,9% Reinheit</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>2,3) PEGylierung des Deckglases</stark></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Verifizierter Lieferant - Aceton Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>A300129</td> Mikroskop-Objektträger mit <td>99% Reinheit</td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td><td>~76 mm x 26 mm x 1&nbsp; mm</td></tr><tr><td colspan="4">3. Montage einer Durchflusskammer</stark></td></tr><tr><td>Acryl-Unterstützung</td><td></td><td></td><td>Kundenspezifische Fertigung</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>3M</td><td></td><td>Transparenter Typ</td></tr><tr><td>Schnelltrocknendes Epoxidharz</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gasdicht 250 & Mikro; l Spritze</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">4. Laden der Probe in die Durchflusskammer</stark></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma-Basismikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Q Imaging</td><td>Rolera EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Festkörperlaser (488&nbsp; nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Alconox Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung von oberflächengebundenen großen dna-molekülen mit einem fluoreszierenden protein-dna-peptid-bindungs

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Große DNA-Moleküle, die an der funktionalisierten Glasoberfläche gebunden sind, wurden in der Polymerphysik und Biochemie insbesondere zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen DNA und ihren Bindungsproteinen verwendet. Hier berichten wir über eine Methode, die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um große DNA-Moleküle sichtbar zu machen, die an der Oberfläche gebunden sind. Zunächst werden Glasdeckgläser biotinyliert und passiviert, indem sie mit biotinyliertem Polyethylenglykol beschichtet werden, das spezifisch biotinylierte DNA über Avidin-Protein-Linker bindet und unerwünschte Bindungen durch unspezifische Wechselwirkungen von Proteinen oder DNA-Molekülen auf der Oberfläche deutlich reduziert. Zweitens werden die DNA-Moleküle je nach ihren Terminals auf zwei unterschiedliche Weise biotinyliert. Die stumpfe DNA wird an ihrem 3'-Hydroxylterminus durch terminale Transferase mit biotinyliertem dUTP markiert, während die klebrige DNA mit biotinylierten komplementären Oligonukleotiden durch DNA-Ligase hybridisiert wird. Schließlich bewirkt eine mikrofluidische Scherströmung, dass sich einzelne DNA-Moleküle nach der Färbung mit fluoreszierendem Protein-DNA-bindendem Peptid (FP-DBP) auf ihre volle Konturlänge dehnen.

Figur 1 zeigt zwei verschiedene DNA Anbinden Methoden in Abhängigkeit von terminalen Strukturen des DNA - Moleküls. 1a veranschaulicht , wie die klebrigen Enden DNA - Moleküle mit komplementären biotinylierten Oligonukleotiden hybridisiert werden, die auf dem Avidin-beschichteten PEG Oberfläche immobilisiert sind. 1b zeigt die Zugabe von biotinyliertes ddNTP oder dNTP an die Hydroxylgruppe eines stumpfen ended DNA durch terminale Transfe...

Wir präsentieren einen Ansatz zur Visualisierung von fluoreszierenden Protein-DNA-bindenden Peptiden (FP-DBP)-gefärbten großen DNA-Molekülen, die an die Polyethylenglykol- (PEG) und Avidin-beschichtete Glasoberfläche gebunden und mit mikrofluidischen Scherströmungen gedehnt werden.

Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein praktisches DNA-Analysesystem für ein epifluoreszenzmikroskopisches Verfahren zu entwickeln, um Einzelmolekül-DNA auf modifizierten Glasoberflächen zu manipulieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Visualisierung zu beantworten, insbesondere bei der Untersuchung der DNA selbst sowie von DNA-bindenden Proteinen und anderen kleinen Molekülen.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der einfachen Beobachtung und Analyse beweglicher DNA. Beginnen Sie damit, Glasdeckgläser auf einen PTFE-Rack zu legen und mit einem Stück PTFE-Flachdichtungsband zu befestigen. Lassen Sie nach dem Umwickeln der Deckgläser ein fünf Zentimeter langes Stück des Bandes zur Handhabung des Racks während des Reinigungsvorgangs übrig.Stellen Sie in einem Abzug 350 Milliliter Schwefelsäure und 150 Milliliter Wasserstoffperoxid in einem einliterigen Glasbecher zusammen, um eine Piranha-Ätzlösung herzustellen. Anschließend stellen Sie das Gestell mit den Deckgläsern in die Lösung. Nach zwei Stunden entleeren Sie den Becher und spülen die Deckgläser gründlich mit entionisiertem Wasser ab.Spülen Sie die Deckgläser weiter, bis der pH-Wert des Wassers im Becher neutral ist. Anschließend beschallen Sie die Gestelle mit Deckgläsern in einem Becher mit Wasser 30 Minuten lang, um die Glasuntergründe zu reinigen und funktionalisieren. Entfernen Sie das Wasser aus dem Becher unmittelbar vor der Aminosilanisierung. Bereiten Sie zunächst die Aminosilanisierungslösung vor, indem Sie zwei Milliliter Alkoxysilan und 10 Milliliter Essigsäure (Eisessig) zu 200 Milliliter Methanol in einem sauberen Behälter aus Polypropylen hinzufügen.Im Anschluss die sauberen Deckgläser in die Lösung geben. Danach die gereinigten Deckgläser in die vorbereitete Lösung geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur und 100 U/min schütteln. Als Nächstes den Behälter mit den derivatisierten Deckgläsern 15 Minuten bei 75 Watt beschallen.Anschließend erneut bei Raumtemperatur und 100 U/min mindestens 30 Minuten lang schütteln. Danach die Lösung aus dem Becher abgießen und die Deckgläser sorgfältig dreimal spülen, einmal mit Methanol und zweimal mit Ethanol.Nach dem letzten Spülgang die Deckgläser in Ethylalkohol aufbewahren und innerhalb von zwei Wochen verwenden. Zunächst 10 Milliliter einer 0,1 molaren Natriumbicarbonatlösung herstellen und durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter filtrieren. Anschließend zwei Milligramm Biotin-PEG-Succinimidylcarbonat und 80 Milligramm PEG-Succinimidylvalerat in 350 Mikroliter der filtrierten Natriumbicarbonatlösung auflösen.Schützen Sie die Lösung vor Licht, indem Sie ein lichtgeschütztes Röhrchen verwenden. Vortexen Sie das Röhrchen kräftig für 10 Sekunden und zentrifugieren Sie es anschließend bei 10.000 × g für eine Minute, um eventuelle Blasen zu entfernen. Spülen Sie danach einen Objektträger mit Aceton und anschließend mit Ethylalkohol ab.Nach dem Spülen die Objektträger vollständig an der Luft trocknen lassen. Einen Tropfen von 50 Mikrolitern der PEG-Lösung auf den sauberen Glasobjektträger geben. Langsam eine amino-silanisierte Deckglasplatte in einem leichten Winkel auf den Tropfen senken, um keine Luftblasen unter der Deckglasplatte entstehen zu lassen.Danach die Objektträger für mindestens drei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur in eine ebene, dunkle und befeuchtete Kammer stellen. Nach Beendigung die restliche PEG-Lösung im Lichtschutzröhrchen verschließen und bei vier Grad Celsius aufbewahren. Nach der Inkubation die PEGylierten Deckgläser gründlich mit entionisiertem Wasser spülen und anschließend an einem dunklen und trockenen Ort lagern, bis sie verwendet werden.Um die Flusskammer herzustellen, bringen Sie doppelseitige Klebestreifen auf einem Acrylhalter an, sodass diese senkrecht zu den Einlass- und Auslassöffnungen ausgerichtet sind und die Kanalöffnungen nicht beeinträchtigen. Drücken Sie anschließend mit einer Pipettenspitze auf das Klebeband, um die Kanäle abzudichten. Danach platzieren Sie eine PEGylierte Deckglas, wobei die PEGylierte Seite nach unten zeigt, auf das Klebeband, um die Flusskammern zu bilden.Um ein Austreten von Lösung zu verhindern, drücken Sie die Oberseite eines Deckgläschens auf die Stelle, an der doppelseitiges Klebeband angebracht ist. Fügen Sie anschließend einen schnell trocknenden Epoxidkleber an die Ränder der Kammer hinzu, um diese zu befestigen. Verbinden Sie danach ein 2,5 cm langes Stück Schlauch mit einer gasdichten Spritze und verschließen Sie die Verbindung mit Epoxidkleber.Verbinden Sie dann einen langen, flexiblen Schlauch mit dem Schlauch, der von der Spritze kommt. Versiegeln Sie die Verbindung erneut mit Epoxidharzkleber. Füllen Sie den Schlauch, der mit der Spritze verbunden ist, mit entionisiertem Wasser und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen befinden.Als Nächstes führen Sie den Schlauch in das Loch der Durchflusskammer ein, das mit Epoxidharz verschlossen ist. Setzen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf das andere Loch, die als Reservoir dient. Stellen Sie die Flussrate einer Spritzenpumpe auf 50 Mikroliter pro Minute ein.Danach 20 Mikroliter einer Avidin-Proteinslösung in die Kammer einleiten und 10 Minuten lang darin belassen. Anschließend 20 Mikroliter biotinylierter Oligodesoxynukleotide in eine Spritze aufziehen. Diese in die Kammer einleiten und 10 Minuten lang darin belassen.Wenn eine Terminaltransferase verwendet wird, überspringen Sie das Beladen mit Oligo-Desoxynukleotiden. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter einer DNA-Lösung in eine Spritze, leiten Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute in die Kammer und lassen Sie sie dort 30 Minuten lang verbleiben. Nach der 30-minütigen Inkubation spülen Sie die Durchflusskammer mit 40 Mikrolitern 1X TE-Puffer bei 50 Mikrolitern pro Minute aus.Nach dem Waschen die Kammer mit 40 Mikrolitern der gleichen FP-DBP in einer Konzentration von 80 Nanomolar in 1X TE füllen. Um den vollständigen Dehnungsbereich der DNA-Moleküle zu beobachten, verschiedene Flussraten entsprechend der verwendeten DNA-Längen anlegen. Die DNA unter einem 60X Objektiv mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachten. Hier ist ein Fluoreszenzmikroskopievideo, das Bakteriophagen-Lambda-DNA-Moleküle zeigt, die an der Oberfläche verankert sind und nach Ligierung mit biotinylierten komplementären Oligonukleotiden durch Fluss gestreckt werden.Unter Fluss betragen die vollständig gestreckten DNA-Moleküle 16,5 Mikrometer in der Länge. Im Gegensatz dazu werden die DNA-Moleküle des Bakteriophagen T4 unter Fluss auf eine Länge von 56,4 Mikrometern gestreckt. Diese Streckung ist reversibel, und die DNA kann mehrfach ausgedehnt und wieder entspannt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie FP-DBP in größeren DNA-Analysen verwendet wird, sowie das Dehnen und die Relaxation des DNA-Polymeren demonstrieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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