Visualisierung von oberflächengebundenen großen DNA-Molekülen mit einem fluoreszierenden Protein-DNA-Peptid-Bindungs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein praktisches DNA-Analysesystem für ein Epifluoreszenzmikroskop zu entwickeln, um Einzelmolekül-DNA auf modifizierten Glasoberflächen zu manipulieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der DNA-Visualisierung zu beantworten. Bei der Untersuchung von DNA-Selbst, sowie DNA-bindenden Proteinen und anderen kleinen Molekülen.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, bewegte DNA mit Leichtigkeit zu beobachten und zu analysieren. Legen Sie zunächst Glasdeckgläser auf ein PTFE-Gestell und befestigen Sie sie mit einem Stück PTFE-Fadendichtband. Lassen Sie nach dem Einwickeln der Deckgläser ein fünf Zentimeter langes Stück des Klebebandes für die Handhabung des Racks während des Reinigungsvorgangs verwenden.

Kombinieren Sie in einem Abzug 350 Millileter Schwefelsäure und 150 Milliliter Wasserstoffperoxid in einem Ein-Liter-Glasbecherglas, um eine Piranha-Ätzlösung herzustellen. Legen Sie dann das Gestell mit den Deckgläsern in die Lösung. Leeren Sie nach zwei Stunden das Becherglas und spülen Sie die Deckgläser gründlich mit entionisiertem Wasser aus.

Spülen Sie die Deckgläser so lange aus, bis der pH-Wert des Wassers im Becherglas einen neutralen pH-Wert erreicht. Dann werden die Racks mit Deckgläsern in einem Becherglas 30 Minuten lang mit Wasser beschallt, um die Glassubstrate zu reinigen und abzuleiten. Entleeren Sie das Wasser aus dem Becherglas, kurz bevor Sie die Aminosilanisierung vornehmen. Bereiten Sie zunächst die Aminosilanisierungslösung vor, indem Sie zwei Milliliter Alkoxysilan und 10 Milliliter Eisessig zu 200 Millilitern Methylalkohol in einem sauberen Polypropylenbehälter hinzufügen.

Anschließend legen Sie die sauberen Deckgläser in die Lösung. Legen Sie dann die gereinigten Deckgläser in die vorbereitete Lösung und schütteln Sie sie bei Raumtemperatur und 100 U/min 30 Minuten lang. Anschließend beschallen Sie den Behälter mit den derivatisierten Deckgläsern 15 Minuten lang bei 75 Watt.

Schütteln Sie sie dann erneut bei Raumtemperatur und 100 U/min für mindestens 30 Minuten. Wenn Sie fertig sind, leeren Sie die Lösung aus dem Becherglas und spülen Sie die Deckgläser dreimal vorsichtig aus. Einmal mit Methylalkohol und zweimal mit Ethylalkohol.

Lagern Sie die Deckgläser nach dem letzten Spülen in Ethylalkohol und verwenden Sie sie innerhalb von zwei Wochen. Stellen Sie zunächst 10 Milliliter einer 0,1 molaren Natriumbicarbonatlösung her und filtrieren Sie sie durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter. Lösen Sie dann zwei Milligramm Biotin PEG Succinimidylcarbonat und 80 Milligramm PEG Succinimidylvalerat in 350 Mikroliter der filtrierten Natriumbicarbonatlösung auf.

Schützen Sie die Lösung mit einem Lichtschutzrohr vor Licht. Wirbeln Sie das Röhrchen 10 Sekunden lang kräftig vor und zentrifugieren Sie es dann eine Minute lang bei 10.000 x g, um alle Blasen zu entfernen. Spülen Sie anschließend einen Objektträger mit Aceton und anschließend mit Ethylalkohol aus.

Lassen Sie den Objektträger nach dem Spülen vollständig an der Luft trocknen. Geben Sie einen 50-Mikroliter-Tropfen der PEG-Lösung auf den sauberen Glasobjektträger. Senken Sie ein aminosilanisiertes Deckglas langsam in einem leichten Winkel auf das Tröpfchen ab, damit keine Luftblasen unter dem Deckglas entstehen.

Legen Sie die Objektträger dann für mindestens drei Stunden bis über Nacht bei Raumtemperatur in eine ebene, dunkle und befeuchtete Kammer. Wenn Sie fertig sind, verschließen Sie die restliche PEG-Lösung im Lichtschutzrohr und halten Sie es bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die PEGylierten Deckgläser nach der Inkubation gründlich mit entionisiertem Wasser ab und lagern Sie sie dann bis zur Verwendung an einem dunklen und trockenen Ort.

Um die Strömungskammer zu erstellen, legen Sie doppelseitige, klebrige Klebebandstreifen auf eine Acrylhalterung, so dass sie senkrecht zu den Ein- und Auslasslöchern ausgerichtet ist und keines der Kanallöcher stört. Reiben Sie dann das Klebeband mit einer Pipettenspitze ab, um die Kanäle zu verschließen. Legen Sie als Nächstes ein PEGyliertes Deckglas mit der PEGylierten Seite nach unten auf die Oberseite des Klebebandes, um Fließkammern zu bilden.

Um zu verhindern, dass eine Lösung ausläuft, drücken Sie die Oberseite eines Deckglases über die Stelle, an der das doppelseitige Klebeband angebracht ist. Tragen Sie dann einen schnell trocknenden Epoxidkleber auf die Ränder der Kammern auf, um ihn an Ort und Stelle zu befestigen. Verbinden Sie als Nächstes ein 2,5 Zentimeter langes Stück Schlauch mit einer gasdichten Spritze und versiegeln Sie die Verbindung mit Epoxidkleber

Verbinden Sie dann einen langen, flexiblen Schlauch mit dem Schlauch, der von der Spritze kommt. Versiegeln Sie die Fuge erneut mit Epoxidkleber. Füllen Sie den Schlauch, der mit der Spritze verbunden ist, mit entionisiertem Wasser und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen vorhanden sind.

Führen Sie anschließend den Schlauch in das Loch der Durchflusskammer ein, das mit Epoxidkleber verschlossen ist. Und setzen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf das andere Loch, um es als Reservoir zu verwenden. Stellen Sie die Durchflussmenge einer Spritzenpumpe auf 50 Mikroliter pro Minute ein.

Lassen Sie dann 20 Mikroliter einer Avidin-Proteinlösung in die Kammer und bewahren Sie sie dort 10 Minuten lang auf. Als nächstes laden Sie 20 Mikroliter biotinylierte Oligodesoxynukleotide in eine Spritze. Lassen Sie es in die Kammer und bewahren Sie es dort 10 Minuten lang auf.

Wenn eine terminale Transferase verwendet wird, überspringen Sie die Beladung mit Oligodesoxynukleotiden. Laden Sie dann 20 Mikroliter einer DNA-Lösung in eine Spritze, lassen Sie sie mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute in die Kammer fließen und halten Sie sie dort 30 Minuten lang. Nach der 30-minütigen Inkubation wird die Durchflusskammer mit 40 Mikrolitern 1X TE Puffer bei 50 Mikrolitern pro Minute gewaschen

Nach dem Waschen beladen Sie die Kammer mit 40 Mikrolitern desselben FP-DBP in einer Konzentration von 80 Nanomolaren, in der 1X-TE.To den vollen Dehnungsbereich der DNA-Moleküle zu sehen, wenden Sie je nach verwendeter DNA-Länge unterschiedliche Flussraten an. Betrachten Sie die DNA unter einer 60-fachen Objektivlinse mit einem Fluoreszenzmikroskop. Hier ist ein Fluoreszenzmikroskop-Video, das zeigt, wie Bakteriophagen-Lambda-DNA-Moleküle, die an die Oberfläche gebunden sind, nach der Ligation mit biotinylierten komplementären Oligonukleotiden durch Strömung gedehnt werden.

Unter Strömung messen die vollständig länglichen DNA-Moleküle eine Länge von 16,5 Mikrometern. Im Gegensatz dazu fließt der Bakteriophagen T4 DNA unter Fluss, länglich auf eine Länge von 56,4 Mikrometern. Diese Dehnung ist reversibel, und die DNA kann mehrfach verlängert und entspannt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie FP-DBP in größeren DNA-Analysen verwenden und die Dehnung und Entspannung von DNA-Polymeren demonstrieren können.