Hochempfindliche und schnelle Fluoreszenzdetektion mit einem tragbaren FRET Analyzer

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle und hochempfindliche Quantifizierung von Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Daten Sensor eine maßgeschneiderte portable FRET-Analyzer. Das Gerät wurde verwendet, Maltose innerhalb eines kritischen Temperaturbereich zu erkennen, die Detektionsempfindlichkeit maximiert, wodurch praktische und effiziente Beurteilung der Zuckergehalt.

Zusammenfassung

Die jüngsten Verbesserungen in Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Sensoren haben ihre Verwendung aktiviert werden, damit verschiedene kleine Moleküle einschließlich Ionen und Aminosäuren erkennen. Allerdings ist die angeborene schwache Signalintensität von FRET-Sensoren eine große Herausforderung dar, die ihre Anwendung in verschiedenen Bereichen verhindert und die Verwendung von teuren High-End-Fluorometer notwendig. Bisher haben wir eine kostengünstige, High-Performance-FRET-Analyzer, der speziell das Verhältnis von zwei Emissionswellenlängenbändern zu messen (530 und 480 nm) hohe Nachweisempfindlichkeit zu erreichen. In jüngerer Zeit wurde entdeckt, dass FRET Sensoren mit bakteriellen periplasmatischen Bindungsproteinen Liganden mit einer maximalen Empfindlichkeit im kritischen Temperaturbereich von 50 erfassen - 55 ° C. Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll Zuckergehalt in handelsüblichen Getränkeproben unter Verwendung unserer tragbaren FRET-Analysator mit einer temperaturspezifischen FRET-Sensor für die Beurteilung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die zusätzliche VorwärmungProzess des FRET-Sensor erhöht die FRET-Verhältnissignal, eine genauere Messung des Zuckergehalts zu ermöglichen. Maßgeschneiderte FRET-Analysator und Sensor wurden erfolgreich den Zuckergehalt in drei Arten von kommerziellen Getränke zu quantifizieren angewandt. Wir gehen davon aus, dass eine weitere Größenreduktion und Leistungssteigerung der Anlage wird die Verwendung von Hand Analysatoren in Umgebungen erleichtern, in denen High-End-Geräte nicht zur Verfügung steht.

Einleitung

Förster - Resonanzenergietransfer (FRET) wurde als biometrischer Sensor zur Erkennung kleiner Moleküle wie Zucker, Calciumionen und Aminosäuren ^1-4 verwendet. FRET Biosensoren enthalten fluoreszierende Proteine, cyan fluoreszierende Proteine ​​(CFPs) und Gelb fluoreszierendes Protein (YFPs), die an beiden Enden des periplasmatischen-bindenden Proteinen fusioniert sind (PBPs). Zucker binden an PBPs in der Mitte des FRET-Sensor befindet, strukturelle Änderungen an dem Sensor verursachen, die anschließend den Abstand und Übergangsdipolmomente Orientierung der beiden fluoreszierenden Proteinen an jedem Ende des PBP verändern. Diese Änderung ermöglicht die quantitative Analyse der Zuckergehalt, indem das Verhältnis der Emissionswellenlängen von EYFP (530 nm) und ECFP (480 nm) gemessen wird. Aufgrund der hohen Sensitivität, Spezifität, Echtzeit - Monitoring - Kapazitäten und eine schnelle Reaktionszeit von FRET Biosensoren sind diese Sensoren weit verbreitet in der Umwelt, Industrie und medizinische Anwendungen ^5. Außerdem ratiometric Messung mittels FRET Biosensoren hat wichtige praktische Vorteile, da es verwendet werden kann, Komponenten in komplexen biologischen Proben zu messen, wo der Sensor-Konzentration nicht leicht gesteuert werden kann und die Hintergrundfluoreszenz ist immer vorhanden.

Trotz dieser Vorteile von FRET-basierten Sensoren für quantitative Visualisierung, kleine strukturelle Veränderungen mit unvollständigen Domain Bewegungsübertragung auf die fluoreszierenden Proteine ​​produzieren von Natur aus schwach Signalintensität. Dieses schwache Signal begrenzt die Anwendung von FRET-basierten Sensoren für die in vitro oder in vivo - Analyse ^6. Folglich meisten FRET Biosensoren die Verwendung von teuren und hochempfindliche Ausrüstung erfordern. Bisher haben wir eine kostengünstige und portable FRET - Analysator mit Funktionen ähnlich denen der bestehenden Fluoreszenz Analysatoren ^7. Bei dieser Vorrichtung ist kostengünstig 405-nm-Band ultraviolettem Licht emittierende Diode (LED) als Lichtquelle verwendet Anregung th zu verursachene Fluoreszenzsignal, eine teure Lampe oder einem Laser zu ersetzen. Das Detektionssystem des Analysators fokussiert effizient das ableitende Fluoreszenzsignal auf zwei Photodetektoren mit einer Silizium-Photodiode. In einer neueren Studie wurde gezeigt, dass die Optimierung der Erfassungstemperatur bei 50 - 55 ° C signifikant die ratiometrisch FRET - Signal ⁸ vergrößern könnte. Diese Temperatur spezifische Signalverstärkung, zusammen mit dem maßgeschneiderten FRET-Analyzer, ermöglicht die Verwendung von FRET-Sensoren in allgemeinere diagnostische Anwendungen mit schnellen und hohen Empfindlichkeit.

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, die allgemeine Anwendbarkeit des FRET-Analysator unter optimalen FRET Temperaturbedingungen durch den Zuckergehalt von handelsüblichen Getränken zu quantifizieren. Dieses Protokoll stellt die Details des FRET Gerätebedienung sowie eine kurze Beschreibung der Sensor und die Probenvorbereitung. Wir gehen davon aus, dass dieser Bericht die Anwendung des tragbaren fördernAnalysator in kleinen Laborumgebungen und eine Grundlage für die weitere Entwicklung eines kostengünstigen Vor-Ort-Diagnosegerät mit FRET-basierten Biosensoren bieten.

Protokoll

1. Herstellung von Biosensor

1. Konstruieren Sie das Plasmid pET21a (+) - GFP-MBP-YFP-His6 durch Befolgen des vorher festgelegten Protokoll ^2.
2. Impfen 5 ml Luria - Brühe (LB) mit einer Einzelkolonie eines Stammes Escherichia coli DE3 und Inkubation bei 37 ° C für 16 Stunden unter Schütteln.
3. 1 ml des O / N - Kultur in einen 500-ml - Kolben , die 100 ml LB und bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator inkubieren , bis die optische Dichte bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ 0,5 erreicht (ca. 3 h).
4. Ernte der Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 20 min bei 4 ° C.
5. Das Pellet schnell in jedes Röhrchen mit 50 ml eiskaltem destilliertem Wasser (DW) und die Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min bei 4 ° C.
6. Das Pellet in 50 ul eiskaltem DW mit 10% (v / v) Glycerin vorsichtig , bis die Lösung (elektro Zellen) wirbelnden erreicht eine OD ₆₀₀ 100.
7. Legen Sie die Mischung aus elektro Zellen (50 & mgr; l der Zellen bei einer OD ₆₀₀ von 100) und 10 ng des pET21a (+) - GFP-MBP-YFP-His6 in einer eiskalten Elektroporationsküvette in einer Elektroporation Gerät und elektroporieren die Mischung (18 kV / cm, 25 & mgr; F).
8. Schnell 1 ml SOC-Medium in die Küvette hinzufügen und die Zellen resuspendieren sanft, für 1 Stunde bei 37 ° C mit anschließender Erholung mit sanftem Rundboden Röhrchen in einem 15 ml schütteln.
9. Verteilt die Zellen auf einer LB-Platte, die 100 ug / ml Ampicillin und Inkubieren bei 37 ° C für 12 Stunden.
10. Isolieren einer Einzelkolonie einer Schleife und inokulieren die Kolonie in 10 ml LB für 12 h in einem Schüttler 100 ug / ml Ampicillin bei 37 ° C enthält.
11. 5 ml der Impfkultur zu 500 ml LB, enthaltend 100 & mgr; g / ml Ampicillin und Inkubieren der Kultur in einem 37 ° C Schüttelinkubator.
12. In 0,5 mM Isopropyl β-d-(IPTG) , wenn die OD ₆₀₀ erreicht24 h 0,5 und die Kultur in einem 37 ° C Schüttelinkubator inkubiert.
13. Zentrifuge die Zellen bei 4.500 × g für 20 min (4 ° C) und Überstand vorsichtig entfernen.
14. Resuspendieren des Pellets in 5 ml Bindungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA und 1 mM DTT).
15. Beschallen die Zellen auf Eis mit sechs 10-Sekunden-Bursts bei 200-300 W, die jeweils mit 10 sec Burst folgenden Kühlung.
16. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 10.000 × g für 30 min bei 4 ° C, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Den Überstand (lösliche Protein) in eine neue Sammelröhrchen.
17. Zur Affinitätsreinigung der FRET Sensorproteine, Last 4 ml des gelöscht Zelllysats auf eine Ni-NTA - Affinitätssäule (5 ml Volumen) , und führen eine Chromatographie - Assay unter Verwendung von Fast - Protein - Flüssigchromatographie (FPLC) ¹⁸ erreichen.
18. Die Säule wird einmal mit fünf Säulenvolumina Waschpuffer I (50 mM Phosphatpuffer, 300 mM Natriumchlorid, 10 mM Imidazol, pH 7,0).
19. Wiederholen der Waschschritt mit fünf Säulenvolumina Waschpuffer II (50 mM Phosphatpuffer, 300 mM Natriumchlorid, 20 mM Imidazol, pH 7,0).
20. Eluieren des Sensorprotein mit fünf Säulenvolumina Elutionspuffer (50 mM Phosphatpuffer, 300 mM Natriumchlorid, 500 mM Imidazol, pH 7,0).
21. Zu konzentrieren und die eluierten Probe entsalzen füllen Konzentrator (Membran eine Größe von 10000 MW) mit bis zu 20 ml der Probe und zentrifugiert für 10 min bei 3000 × g. Nachzufüllen Konzentrator mit 0,8% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, zuerst den Konzentrator mit 20 ml Probe füllen und dann mit PBS Nachfüllen.
22. Wiederherstellen der konzentrierten und de-gesalzene Sensorprotein und lagern Sie es bei -80 ° C.

2. Messung des Zuckergehalts der FRET-Analyzer

HINWEIS: Die Details des FRET - Analysator Bau wurden in unserer bisherigen Arbeit ⁷ beschrieben.

1. Bereiten Sie eine Detektionslösung von 0,8% PBS, die 0,2uM der Sensorproteinen.
2. Schalten Sie den FRET-Analysator. Drücken Sie die Taste "UP" für 2 Sekunden die optimale Temperatur zu kalibrieren. Stellen Sie die Temperatur auf 53 ° C unter Verwendung der "UP" und "DOWN" Tasten und drücken Sie die Taste "SET".
3. Für die Kalibrierung, drücken und halten Sie die "UP" und "DOWN" Tasten gleichzeitig für 2 Sekunden. Bestätigen Sie, dass die LED-Panel Displays "CALIB" und drücken Sie die Taste "SET".
4. Legen Sie ein 12,5 x 12,5 x 45 mm (Länge x Breite x Höhe) quader Gefäß (Küvette), die nur Puffer PBS in einem Küvettenhalter des Analysators und drücken Sie die Taste "SET".
5. Setzen Sie die Küvette mit einer nur die Nachweislösung enthält (siehe 2.1) ohne Zucker (Maltose / Saccharose) und drücken Sie die Taste "SET" die Basislinie zu kalibrieren.
6. Setzen Sie die Küvette mit einer der Detektionslösung mit 10 mM Zucker und drücken Sie die "SET"Taste.
7. Um den Zuckergehalt eines Getränks Probe zu bestimmen, setzen Sie 1 ml Getränkeprobe in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 16.000 × g für 1 min.
   HINWEIS: FRET sensorbasierte Fluoreszenzmessung hat den Vorteil, nicht erfordern spezielle Vorbehandlung der Probe, da nur 1% (v / v) der Probe wird in dem Gesamtvolumen enthalten. Empfehlen jedoch Entfernen wir jedes Material, das die Fluoreszenzmessung (zB Zellen, unlöslichen Teilchen, Lipid, Fett, oder jedes Material mit Eigenfluoreszenz) beeinflussen können. Darüber hinaus, wenn eine starke Säure, starke Basis, Mittel (Reinigungsmittel) reinigen oder Emulgator (Emulgator) in hoher Konzentration vorhanden ist, und kann die Eigenschaften des FRET biologischen Sensor beeinflussen, sollte es ein organisches Lösungsmittel oder ein entfernt werden unter Verwendung von Neutralisator. Wenn beispielsweise Milchfett und Emulgatoren aus gefrorenen Snacks eliminiert werden, werden die Proben in einem Mikrozentrifugenröhrchen für 30 min bei 16000 × g zentrifugiert und die Flüssigkeit between der Bodensediment und die obere Schicht aus Milchfett wird extrahiert. Eine gleiche Menge an Hexan wird dann zugegeben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 15.000 × g für 30 min Lipiden zu eliminieren.
8. Entfernen Sie den Überstand mit einer 1-ml-Spritze und filtern sie durch einen Spritzenfilter (Porengröße 0,2 um).
9. Legen Sie 0,1 ml gefiltert Getränkeprobe in einem 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 0,9 ml PBS und Wirbel sanft.
   HINWEIS: Es ist entscheidend, um die Getränkeprobe richtig zu verdünnen. In diesem Fall wurde 1.000-fache Verdünnung durchgeführt, so dass die Zuckerkonzentration innerhalb des dynamischen Bereichs der Vorrichtung fallen. Wir empfehlen, die Schätzung der Zielzuckerkonzentration im Voraus in der Bezeichnung des Getränks auf den Zuckergehalt bezieht.
10. Zugabe von 5 & mgr; l der verdünnten Getränkeprobe (1%, v / v) in eine Küvette 0.495 ml der Nachweislösung enthält.
11. Setzen Sie die Küvette in einem Küvettenhalter des FRET-Analysator und Vorwärmung der Probenlösung auf 53 ° C.
12. Drücken Sie die Taste "SET", den Zuckergehalt zu messen.
    Hinweis : Es ist möglich , die FRET - Messung mit einem Multilabel- Plattenlesegerät oder ein Fluoreszenz - Spektralphotometer mit einem Peltier - Element zur Temperaturkontrolle zu bewerten , indem das Verhältnis bei 488/535 nm ^7,8 zu lesen. Für Saccharose Erkennung, die Schritte 1,1-2,12 mit einem CSY-LH - Sensor ^2.

Ergebnisse

Auszuführen quantitative Analyse der Zuckergehalt unter Verwendung des FRET-Analysator, ist es notwendig, eine angepasste Kurve Abschätzen der Zielzuckerkonzentration aus dem beobachteten FRET-Verhältnis aufzubauen. Es sei r das Verhältnis der Emissionsintensität von GFP bei 480 nm und die Emissionsintensität von YFP erzeugt bei 530 nm (Gl. 1) definieren.

Diskussion

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Quantifizierung des Zuckergehalts in Getränkeproben, eine maßgeschneiderte FRET - Analysator ⁷ bei einer optimalen Temperatur für FRET - Sensoren. Der Analysator wurde entwickelt mit einem kürzlich entwickelten, kostengünstigen 405-nm-Band Ultraviolett-LED als die Lichtquelle und zwei Photodetektoren mit einer Silizium-Photodiode. Diese Vorrichtung ist kostengünstiger als andere vergleichbare Fluorometer. Die Vorrichtung zeigte eine hohe Nachweisempfind...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
LB	BD	#244620
isopropyl β-D-thiogalactosid (IPTG)	Sigma	I6758
Ampicillin	Sigma	A9518
Tri-HCl	Bioneer	C-9006-1
PMSF	Sigma	78830
EDTA	Bioneer	C-9007
DTT	Sigma	D0632
NaCl	Junsei	19015-0350
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	70011-044	0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,0144 % Na2HPO4, 0,024 % KH2OP4, pH 7,4
SOC			2 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM
Glukoseressource Q	Amersham Biosciences	17-1177-01	6 & 30 mm Anionenaustauschchromatographie-Säule
HisTrap HP1	Amersham Biosciences	29-0510-21
Quarzküvette	Sigma	Z802875
AKÄ KTAFPLC	Amersham Biosciences	18-1900-26	eine schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC)
Cary Eclipse	VarianInc		ein Fluoreszenzspektrophotometer
VICTOR	PerkinElmer	2030-0050	a Multilabel Plate Reader
E. coli JM109 (DE3)	Promega		Elektrokompetente Zellen
A (Getränke)	Korea Yakult Co. (Korea)	Birak	Fermentierte Getränke
B (Getränke)	Lotte Foods (Korea)	Epro	Erfrischungsgetränke
C (Getränke)	Lotte Foods (Korea)	Getoray	Sportgetränke