Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Agnieszka B. Bialkowska; Amr M. Ghaleb; Mandayam O. Nandan; Vincent W. Yang

doi:10.3791/54161

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Methodenartikel

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

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DOI:

10.3791/54161

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13. Juli 2016

Agnieszka B. Bialkowska^*¹ , Amr M. Ghaleb^*¹ , Mandayam O. Nandan¹ , Vincent W. Yang¹^,²

¹Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, ²Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Epithelzellen entlang der Darmschleimhaut sind wesentlich unterschiedlichen Zelllinien zu definieren. Die richtige Darstellung von Darmgewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Identifizierung von Proteinexpressionsmuster mit maximaler Auflösung. Diese Studie hat zum Ziel, die optimalen Verfahren und Bedingungen für die Verarbeitung der Maus Darmgewebe zu beschreiben.

Zusammenfassung

Es ist wichtig, die Rolle von Faktoren zu verstehen, die die Homöostase des Darmepithels und die Reaktion auf Verletzungen und Regeneration regulieren. In der aktuellen Literatur werden verschiedene methodische Ansätze beschrieben, um Bilder von Darmgewebe für die Datenvalidierung zu erhalten. In diesem Artikel beschreiben wir ein gängiges Protokoll in Bezug auf die Gewinnung und Verarbeitung von Darmgewebe von Mäusen. Die richtige Fixierung des Darmgewebes und Swiss-Roll-Techniken, die die Darmepithelmorphologie verbessern, werden diskutiert. Die Nachresektion und die Neuorientierung des eingebetteten Darmgewebes sind entscheidend für die Gewinnung von in Paraffin eingebetteten Blöcken, die nach dem Schnitt intakte Darmstrukturmerkmale aufweisen. Die Swiss-Rolling-Technik hilft bei der histologischen Beurteilung der gesamten untersuchten Darm- oder Dickdarmschnitte. Die Fähigkeit, strukturelle Merkmale des Darms zu unterscheiden, kann bei der quantitativen Messung von Darmentzündungen und Tumorgenese über die gesamte Länge von entscheidender Bedeutung sein. Schließlich sind in Paraffin eingebettete Schnitte ideal für eine robuste Verarbeitung sowohl mit immunhistochemischen als auch mit immunfluoreszierenden Nachweismethoden. Nicht-fluoreszierende immunhistochemische Schnitte liefern ein lebendiges Bild des Gewebes, das verschiedene zelluläre Strukturmerkmale detailliert beschreibt, bieten jedoch keine Flexibilität für intrazelluläre Kolokalisationsexperimente. Mehrere Fluoreszenzkanäle können mit der Immunfluoreszenzdetektion für Co-Lokalisierungsexperimente genutzt werden, was mechanistische Studien unterstützt.

Einleitung

Die Säuger Darmepithel umfasst eine einzelne Schicht aus säulen Zellen. Im Dünndarm werden die proliferative Zellen zu den Krypten beschränkt, während die differenzierten Zellen villus Region besetzen. Da es jedoch keine Zotten im Dickdarm sind, werden die proliferative Zellen auf den Boden der Krypten lokalisiert und differenzierten Zellen besetzen den oberen Bereich der Krypten. Darmepithel erfährt rasche Nachfüllung (ca. 3 - 5 Tage), die durch kontinuierliche Trennung der proliferativen Zellen in den Krypten angetrieben wird. Die proliferativen Zellen der Krypten sind keine homogene Bevölkerung und werden weiter in Stammzellen und Transit-Verstärkung (TA) Zellen <....