Methodenartikel

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

DOI:

10.3791/54161

⸱

13. Juli 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Epithelzellen entlang der Darmschleimhaut sind wesentlich unterschiedlichen Zelllinien zu definieren. Die richtige Darstellung von Darmgewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Identifizierung von Proteinexpressionsmuster mit maximaler Auflösung. Diese Studie hat zum Ziel, die optimalen Verfahren und Bedingungen für die Verarbeitung der Maus Darmgewebe zu beschreiben.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es ist wichtig, die Rolle von Faktoren zu verstehen, die die Homöostase des Darmepithels und die Reaktion auf Verletzungen und Regeneration regulieren. In der aktuellen Literatur werden verschiedene methodische Ansätze beschrieben, um Bilder von Darmgewebe für die Datenvalidierung zu erhalten. In diesem Artikel beschreiben wir ein gängiges Protokoll in Bezug auf die Gewinnung und Verarbeitung von Darmgewebe von Mäusen. Die richtige Fixierung des Darmgewebes und Swiss-Roll-Techniken, die die Darmepithelmorphologie verbessern, werden diskutiert. Die Nachresektion und die Neuorientierung des eingebetteten Darmgewebes sind entscheidend für die Gewinnung von in Paraffin eingebetteten Blöcken, die nach dem Schnitt intakte Darmstrukturmerkmale aufweisen. Die Swiss-Rolling-Technik hilft bei der histologischen Beurteilung der gesamten untersuchten Darm- oder Dickdarmschnitte. Die Fähigkeit, strukturelle Merkmale des Darms zu unterscheiden, kann bei der quantitativen Messung von Darmentzündungen und Tumorgenese über die gesamte Länge von entscheidender Bedeutung sein. Schließlich sind in Paraffin eingebettete Schnitte ideal für eine robuste Verarbeitung sowohl mit immunhistochemischen als auch mit immunfluoreszierenden Nachweismethoden. Nicht-fluoreszierende immunhistochemische Schnitte liefern ein lebendiges Bild des Gewebes, das verschiedene zelluläre Strukturmerkmale detailliert beschreibt, bieten jedoch keine Flexibilität für intrazelluläre Kolokalisationsexperimente. Mehrere Fluoreszenzkanäle können mit der Immunfluoreszenzdetektion für Co-Lokalisierungsexperimente genutzt werden, was mechanistische Studien unterstützt.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Säuger Darmepithel umfasst eine einzelne Schicht aus säulen Zellen. Im Dünndarm werden die proliferative Zellen zu den Krypten beschränkt, während die differenzierten Zellen villus Region besetzen. Da es jedoch keine Zotten im Dickdarm sind, werden die proliferative Zellen auf den Boden der Krypten lokalisiert und differenzierten Zellen besetzen den oberen Bereich der Krypten. Darmepithel erfährt rasche Nachfüllung (ca. 3 - 5 Tage), die durch kontinuierliche Trennung der proliferativen Zellen in den Krypten angetrieben wird. Die proliferativen Zellen der Krypten sind keine homogene Bevölkerung und werden weiter in Stammzellen und Transit-Verstärkung (TA) Zellen 1 unterteilt. Die Stammzellen liegen an der Unterseite der Krypta, innerhalb der ersten 4 bis 5 Zellen von ganz unten 2. Das aktuelle Modell unterstützt die Existenz von zwei Arten von Stammzellen: Krypta Basis säulen (CBC) Stammzellen und Reserve ruhenden Stammzellen. Die CBC stem Zellen aktiv vermehren und werden von Leucin-rich repeat enthaltenden G-Protein - gekoppelten Rezeptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (OLFM4) 4 und Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5 markiert. Auf der anderen Seite, sind Reserve ruhenden Stammzellen von B - Zell-spezifischen Moloney - Maus - Leukämie - Virus - Integrationsstelle 1 (Bmi1) 6, Maus Telomerase Reverse Transkriptase (mTERT) 7 gekennzeichnet, HOP Homeobox (Hopx) 8, Double-Like und CAM - Kinase -Wie 1 (DCLK1) 9, und leucinreichen Repeats und Immunoglobulin-ähnlichen Domänen 1 (Lrig1) 10. Die aktiv vermehrenden Stammzellen führen zu TA-Zellen dann eine weitere Differenzierung in absorptive Zellen durchlaufen (Enterozyten) und sekretorischen Zellen (enteroendokrinen, Becher, Paneth und Tuft-Zellen). Kontinuierliche Zellteilung in der proliferativen Zone führt zu einer Aufwärtsbewegung von Epithelzellen entlang der Krypta-villus Achse, bis sie oben auf der Zotten zu erreichen, wo sie unterziehen Apoptose und sindabgestoßen von der Oberfläche des Epithels ab. Die verschiedenen Arten von intestinalen Epithelzellen werden durch die Expression von bestimmten Proteinen markiert (zB intestinalen Becherzellen können durch Färbung mit Antikörper gegen MUC2 und Paneth - Zellen mit Antikörper gegen Lysozym zu erkennen). Wir untersuchen die Rolle der Krüppel-ähnlichen Faktoren (KLFs) in der Homöostase und Pathobiologie des Darmepithels 11-13. Die hier vorgestellten Ergebnisse , die Durchführbarkeit eines modifizierten Swiss-Walztechnik unterstützen , werden bei früheren Untersuchungen der Rolle von Krüppel-like factor 5 (KLF5) bei der Aufrechterhaltung der aktiv proliferierenden intestinalen epithelialen Stammzellen 14 basiert. KLF5 ist ein Faktor Zinkfinger - Transkriptions , die 12 in dem aktiven Darm Schaft und TA - Zellen stark exprimiert wird. Frühere Studien zeigten, dass KLF5 wird coexprimiert mit Ki-67, einem bekannten proliferative Marker in den Darmkrypten.

Die Magen-Darm-tr Akt ist kein strukturell oder funktionell homogenen Gewebe. Der Dünndarm wird in Duodenum unterteilt, Jejunum und Ileum und den Dickdarm in Caecum und Colon, wobei letztere weiter in proximaler unterteilt, mittleren und distalen Abschnitten. Jeder dieser Abschnitte hat einzigartige histologische Eigenschaften und spielt verschiedene Rollen 15. Als solche können die Auswirkungen von Beleidigungen und der Grad der Reaktion des Darmepithels kann 16 auf dem Bereich des untersuchten Gewebes abhängt. Darüber hinaus zeigen verschiedene Mausstämme Vielfalt der Antwort auf der histologischen Ebene basierend auf der Art der Insult in den Studien verwendet 16. Somit ist Gewebepräparation geziemt notwendig, geeignete histologische und molekulare Analyse der Darmgewebe zu ermöglichen. Als solche ermittelt die Swiss-Rolle-Technik gewährt Analyse der gesamten Länge des Darmepithel zu einer Zeit und damit gut informierte Schlussfolgerungen über umfassende Informationen.

e_content "> Die Swiss-Roll - Technik wurde zuerst von Magnus 17, erwähnt und im Detail von Moolenbeck und Ruitenberg und Park et al. , wie ein Verfahren zur Herstellung von Geweben und histologische Durchführung des Nagetiers Darm analysiert 18,19 dar. Das Protokoll in dieser Druckschrift abgegrenzt stellt eine verbesserte Version der ursprünglichen Methode, die für eine rechtzeitige und zuverlässige Gewebevorbereitung für diagnostische Zwecke ermöglicht. mit dieser modifizierte Technik für die effiziente Sammlung und Vorbereitung des Darmepithels für allgemein verwendete Techniken, wie der Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, als auch wie in situ - Hybridisierung (fluoreszierend und chromogenen 20). Ferner verwendet das modifizierte Gewebeprobe Herstellungsverfahren leicht verfügbar und relativ preiswerten Reagenzien während eines Verfahrens zur schnellen Gewebefixierung bietet und ermöglicht eine Rückgewinnung von Protein, DNA und RNA für zusätzliche Auswertung. Genommen zusammen, this-Technik eignet sich hervorragend für eine umfassende Beurteilung der histopathologischen, pathologische und molekulare Merkmale des Darmepithel.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mäuse

  1. Alle Studien mit Mäusen wurden von der Stony Brook University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. Die Mäuse wurden auf einem 00.12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten.
    1. Kommerziell C57BL / 6-Mäusen erhalten. Erhalten C57BL / 6 - Mäuse tragen KLF5 Allele flankiert von loxP - Stellen (KLF5 f l / f l). Diese Mäuse wurden zuvor 21 beschrieben und gnädig von Dr. Ryozo Nagai zur Verfügung gestellt.
  2. Bestellen Sie C57BL / 6-Mäuse, die induzierbare Cre-Rekombinase-Gen unter Regulation des Lgr5-Promotor (Lgr5-EGFP / CreERT2 Mäuse).
  3. Lgr5-EGFP / Creer T2 / KLF5 f l / f l Mäusen kreuzen KLF5 fl / f l Mäuse mit Lgr5-EGFP / Creer T2 Mäuse und dann Rückkreuzung die Nachkommenschaft KLF5 fl / f l zu etablieren Mäusen.
  4. Treat Mäuse mit Tamoxifen nach dem Protokoll zuvor beschriebenen 22. Injizieren 8 Wochen alten Versuchs- und Kontrollmäusen intraperitoneal (IP) mit 1 mg Tamoxifen (10 mg / ml) in sterile Maisöl gelöst, für 5 aufeinanderfolgende Tage.
  5. Am Tag 14 nach der ersten Injektion Tamoxifen, opfern Mäuse CO 2 Erstickung , indem es sie in einer Kammer platziert , um CO 2 -Gas Quelle verbunden. Erlauben es dem Gas in die Kammer zu strömen, bis die Mäuse bewusstlos und jede Bewegung aufhört sind. Euthanasie durchführen Zervikaldislokation zu gewährleisten.

2. Gewebepräparation und Schweizer Rollen

  1. Mit Dissektion Pinzette und Schere, schnitt einen Einschnitt in der Haut der Bauchseite. Mit einer Pinzette, halten Sie die Haut an der Einschnitt und ziehen Sie aus dem Bauch Muskelgewebe sanft entfernt. Verwenden Sie eine Schere aus der Bauchhaut und setzen Sie die Bauchmuskeln zu schneiden.
  2. Halten und ziehen Sie den peritoneum mit der Zange. Achten Sie darauf, nicht zu halten und Ziehen an den Darm. machen Sie vorsichtig einen Einschnitt in der Bauchgewebe und weiterhin die Haut wegschneiden, um die Bauchmuskeln aus. machen Sie vorsichtig einen Einschnitt in die Bauchmuskeln und sie weiterhin Wegschneiden zu den Darm aus.
  3. Identifizieren Sie den Doppelpunkt und Spuren an das distale Ende, wo es das Rektum / Anus verbindet. Mit einer Schere, schneiden Sie so nah an der Analöffnung wie möglich.
  4. Identifizieren Sie den Magen und verfolgen, wo es mit dem Dünndarm verbindet. Mit einer Schere, freigeschnitten den Darm etwa 1 cm vom Magen. Übertragen die gesamte Länge des befreit Dünndarm und Dickdarm in eine saubere Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
  5. Mit einer Hand oder einer Pinzette, um das distale Ende des Dickdarms zu halten und mit der anderen Hand sanft über die gesamte Länge des Dickdarms von jedem mesenteric Binde- und / oder Fettgewebe entwirren.
  6. Identifizieren Sie den Blinddarm(Kleine Beutel zwischen Dünn- und Dickdarm) und schneiden, wo der Blinddarm und der Doppelpunkt verbinden (das proximale Ende des Dickdarms) um den Darm zu befreien.
  7. Mit einer Hand oder einer Pinzette, halten Sie den Dünndarm und mit der anderen Hand sanft über die gesamte Länge des Dünndarms von jedem mesenteric Binde- und / oder Fettgewebe entwirren. Schneiden Sie den Blinddarm entfernt und verwerfen, wenn es keine Notwendigkeit dafür.
    Hinweis: Der Prozess hier beendet werden kann , die seziert Darm in modifizierter Bouin-Fixiermittel durch Inkubation (50% Ethanol / 5% Essigsäure in dH 2 O) über Nacht und fahren am nächsten Tag den Vorgang.
  8. ein Segment des Darms (Dünndarm oder Kolon) Handhabung, füllen einen 10-ml-Spritze mit modifizierten Bouin-Fixiermittel und heften sich an eine Sondennadel. Führen Sie die Nadel etwa einem halben Zentimeter in der vorderen Öffnung des Darmsegments.
  9. Halten Sie die Sondennadel innerhalb des Darm-Segment durch festen Druck mit einem Instrument Anwendungauf die intestinale Segment. Mit der anderen Hand die Spritze gelten sanfte, aber gleichmäßigen Druck, den Inhalt des Darmsegments zu spülen modifizierten Bouin-Fixiermittel verwendet wird. Dieser Schritt ermöglicht die gleichzeitige Reinigung des Darmsegments und sofortige Fixierung. Verwenden Sie eine Petrischale, die Flow-Through-Abfall zu sammeln. Die Fixierung kann durch den Darm Farbe drehen undurchsichtig beobachtet werden.
    Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben, beim Spülen oder der Darm-Segment könnte aufplatzen.
  10. Mit einer Schere, schneiden Sie das Darmsegment öffnen längs entlang der mesenterischen Linie. Halten Sie es mit einer Pinzette und spülen Sie ihn kurz in einer Petrischale mit PBS.
    1. Schneiden Sie den Dünndarm in drei gleich große Segmente: proximalen, mittleren und distalen. Das proximale Segment ist das man sofort den Magen folgenden, und das distale Segment ist derjenige unmittelbar vor dem Doppelpunkt. Das proximale Segment entspricht dem Zwölffingerdarm, den mittleren bis Jejunum und dem distaldas Ileum.
    2. Für jedes Segment das proximale und das distale Ende markieren. Das proximale Ende ist derjenige, der ursprünglich in Richtung auf den Magen zeigt, und das distale Richtung Kolon gerichtet.
  11. Verwenden Sie die oben auf einer Petrischale, die gereinigt und geöffnet Darm-Segment zu platzieren. Legen Sie das Darmsegment mit der luminalen Seite nach oben zeigt.
    1. Für den Doppelpunkt zu identifizieren der luminalen Seite von den Farbvarietät / Grate über ihre Breite läuft und an dem proximalen Ende vorhanden sind. Die mittleren und distalen Bereichen haben einige Farbvarietät, die in Längsrichtung verlaufen. Für den Dünndarm, identifizieren die luminale Seite durch die grobe erscheinende Oberfläche, die den Zotten markiert.
      Hinweis: Für den Dünndarm gibt es keine externe makroskopische anatomische Abgrenzung der proximalen, mittleren und distalen Regionen. Jedoch können diese Bereiche in den Abschnitten unter dem Mikroskop identifiziert werden kann. Die Zotten sind am längsten im proximalen Bereich und werden nach und nach distal kürzer, wo sie sinddie kürzeste Länge. Mikroskopisch sind die Kolonkrypten kürzesten im proximalen Bereich, der auch durch das Vorhandensein von Graten identifiziert werden kann. Die Kolonkrypten sind höchsten in den Mittelteil und kürzer im distalen Bereich dennoch noch größer als im proximalen Bereich.
  12. Fahren Sie mit dem Schweizer den Doppelpunkt rollen:
    1. Halten Sie den Doppelpunkt flach offen und ziehen Sie sie mit einer Pinzette von seinem proximalen Ende in Richtung auf den Rand der Petrischale.
    2. Halten Sie luminalen Seite nach oben und halten Sie das proximale Ende mit der Zange mit einer Hand und mit der anderen Hand halten einen Zahnstocher.
    3. Wickeln Sie den Rand des proximalen Ende um den Zahnstocher mit der Pinzette und leicht kneifen die verpackte Kante gegen den Zahnstocher es an Ort und Stelle zu halten.
    4. Sanft und langsam beginnen den Zahnstocher mit den Fingern rollen den Darm um den Zahnstocher zu rollen eine Schweizer Rolle zu bilden.
    5. Sobald die gesamte Kolon Länge aufgerollt wurde, wird eine Pinzette benutzen, um sorgfältig die c schiebenOlon Rouladen aus dem Zahnstocher und in ein Gewebe-Verarbeitung / Embedding Kassette. Legen Sie die Kassette in 10% gepuffertem Formalin über Nacht bei Raumtemperatur.
  13. Fahren Sie mit dem Schweizer in den Dünndarm rollen:
    1. ein Segment zu einem Zeitpunkt, Handhabung, halten das Segment flach offen mit luminalen Seite nach oben und ziehen Sie sie mit einer Pinzette von seinem proximalen Ende in Richtung auf den Rand der Petrischale.
    2. Fahren Sie mit dem Schweizer Roll wie für den Doppelpunkt beschrieben.
  14. Fahren Sie mit der Verarbeitung Formalin fixierten Geweben für Paraffineinbettung. Gehen Sie wie folgt vor:
    HINWEIS: Verwenden Sie einen automatisierten Prozessor (siehe Materialien und Equipment für weitere Details).
    1. Während Gewebe in der Kassette ist, spülen Sie Gewebe mit PBS bis Fixateur vollständig entfernt wird.
    2. Dehydratisieren Gewebe Ethanol in der folgenden Reihenfolge unter Verwendung von 50% Ethanol für 10 min, 70% Ethanol für 10 min, 80% Ethanol für 10 min, 95% Ethanol für 10 min, 100% Ethanol für 10 min, 100% Ethanol für 10 min , und 100% Ethanol für 10 min.
    3. Austausch ethanol mit Xylol in der folgenden Reihenfolge: 2: 1 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 1: 1 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 1: 2 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 100% Xylol 10 - 15 min, 100% Xylol für 10 - 15 min und 100% Xylol für 10 - 15 min. ACHTUNG: Xylen ist eine Gefahr für die Gesundheit, so dass der Arbeitsplatz sollte mit einer lokalen Absaugung mit einer richtigen Haube und der richtigen Schutzausrüstung ausgestattet werden sollte von Personal getragen werden.
    4. Exchange-Xylol mit Paraffin. Führen Sie die folgenden Schritte in einem Vakuumofen-Set für 54 bis 58 ° C: 2: 1 Xylol: Paraffin 30 min, 1: 1 Xylol: Paraffin 30 min, 1: 2 Xylol: Paraffin 30 min, 100% Paraffin 1 bis 2 Stunden und 100% Paraffin mit 1 - 2 Stunden oder über Nacht.
      Hinweis: Lassen Sie sich nicht das Paraffin 60 ° C für längere Zeit nicht überschreiten, da dies die Paraffin Polymere zersetzen und es hart und spröde machen.
    5. Einbetten in frischen neuen Paraffin und orientieren Gewebe als degezeugt, bevor das Paraffin erstarrt. Für die Schweizer Brötchen, Gewebe paraffinization folgen, ist es wichtig, jede Rolle auf seiner Seite während Paraffineinbettung neu zu positionieren. Dadurch wird sichergestellt, dass während des Schneidens wird, Abschnitte der gesamten Länge jeder Walze hergestellt werden.
  15. Zur Färbung, schneiden 5 um dicke Abschnitte Mikrotom. Sammeln Sie die Abschnitte über die geladene Objektträger und trocknen Sie sie (backen) in einem 65 ° C Ofen über Nacht; lassen auf Raumtemperatur abkühlen und sie anschließend zum Färben verwendet.
    Anmerkung: Die Backzeit kann verkürzt werden auf 1 - 2 Stunden, je nachdem wie frisch geschnittenem Die Objektträger werden. Wenn weniger als einem Monat seit sectioning, dann ist es ratsam, über Nacht zu backen. Wenn es hat sich mehr als einen Monat, dann 1 bis 2 h Backen reicht aus, um Zeit zu sparen. Wenn die Zeit läuft, kann immer über Nacht Lage verwendet werden.

3. Die histologische Analyse und Immunfluoreszenzanfärbung

Führen Sie die histologische Analyse und immunofluFluoreszenz - Färbung beschrieben , wie zuvor 23,24, mit Modifikationen. Für eine verbesserte grün fluoreszierende Protein (EGFP) Immunofluoreszenz:

  1. Bake die Folien in einem 65 ° C Ofen für 1 h auf endogene alkalische Phosphatase-Aktivität inaktivieren und entparaffinieren anschließend in Xylol.
  2. Inkubieren Abschnitte in einem Bad von 3% Wasserstoffperoxid in Methanol endogene Peroxidasen Gewebe zu blockieren; durch Inkubation in einem abnehm Alkoholbad Serie (100%, 95%, 70%), gefolgt von Antigen-Retrieval in Citrat-Pufferlösung (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) bei 125 ° C rehydriert dann für 10 min mit einer decloaking Kammer.
  3. Zeichnen Sie einen Kreis um Gewebeschnitte mit Stift Markierung, die hydrophobe Barriere bietet und inkubieren Abschnitte mit Blockierungspuffer (2,5% Rinderserumalbumin [BSA] in TBS-Tween) für 30 min bei 37 ° C und dann mit dem primären Antikörper gegen EGFP (Verdünnung 1 : über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei) 4 ° C 500 unter leichtem Schütteln.
  4. Waschen Abschnitte und inkubiere mit fluoreszierendem-tagged sekundären Antikörper in der entsprechenden Konzentration für 30 min bei 37 ° C.
  5. Waschen Sie Dias nach der sekundären Antikörperbehandlung und Fleckenkerne mit Hoechst und montieren mit Montage Medien.
    1. Für KLF5 / EGFP / Ki-67 Co-Färbung, Prozess gleitet wie in den Schritten 3.1 beschrieben - durch Inkubation mit KLF5 Antikörper (Verdünnung 1: 150), 3.3 und führen KLF5 Färbung über Nacht.
    2. Bewerben Kaninchen AP Polymer Erkennung Dias laut Protokoll.
    3. Reveal Klf4 mit Chromogen immunhistochemischen Färbung Färbung gemäß Protokoll des Herstellers.
    4. Führen Antikörper Elution der zuvor beschriebenen Protokoll 25 verwendet wird . Inkubiere Objektträger bei 50 ° C in Glycin-SDS (pH 2,0) Lösung unter Rühren für 1 Stunde.
    5. Wasch gleitet gründlich mit destilliertem Wasser und Inkubieren Puffer (2,5% BSA in TBS-Tween) für 30 min bei 37 ° C mit Blockierung.
    6. In Ki-67 (Verdünnung 1: 500) und EGFP (Verdünnung 01.500) Antikörper gleichzeitig und inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde.
    7. Führen Fluoreszenzdetektion mit einem geeigneten sekundären Antikörper vor mit Hoechst-Färbung (Daten nicht gezeigt) und montieren mit Eindeckmediums.
  6. Beobachten histologische Morphologie der Gewebe auf Anfärben 5-um - Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) 26. Für Fluoreszenzbilder verwenden Emissionswellenlängen von 535, 646 und 700 EGFP, KLF5 sichtbar zu machen, und Ki-67-Färbung auf.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Schweizer Walztechnik in Kombination mit immunhistochemischen Färbung ermöglicht eine umfassende Analyse von kleinen oder großen Darmgewebe. Das Beispiel von H & E - Färbung eines Dickdarms einer C57BL / 6 - Maus (Figur 1) ist eine Darstellung der Durchführbarkeit und die Wirksamkeit dieser Technik. Wie in 1 gezeigt, ist das Bild der Lage , alle Teile des Dickdarms zu erfassen: proximalen, mittleren und distalen. Somit ermöglicht es eine umfassen...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Schweizer Walztechnik ist eine leistungsfähige Methode zur Darmgewebe zur histologischen und morphologischen Beurteilung in großem Maßstab vor. Im Gegensatz zu dem zuvor beschriebenen Swiss-Walztechnik, die ursprünglich zur Herstellung von Gefrierschnitten 18,19 entwickelt wurde, stellte das Verfahren hier ermöglicht die schnelle intestinalen Gewebepräparation und Fixierung für Formalin Fixierung und Paraffineinbettung (FFPE). Im Vergleich zu gefrorenem Gewebe, hat FFPE Gewebe wesentlich längere Haltbarke...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir möchten uns bei Ainara Ruiz de Sabando für die Bereitstellung von H&E-Bildern bedanken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (DK052230, DK093680 und CA172113) unterstützt, die Dr. Vincent W. Yang gewährt wurden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Edelstahl-PräpariersetsVWR25640-002
EnttarnungskammerBiocare MedicalDC2012
Spritze 10 mlVWR89215-218
Swingsette Gewebeeinbettungs-/-verarbeitungskassette mit DeckelSimportM515
Superfrost Plus Objektträger [Größe: 25 x 75 x 1 mm]VWR48311-703
Manuelles Objektträger-FärbesetTissue-Tek/Sakura4451
Färbeschale GrünTissue-Tek/Sakura4456
Färbeschale WeißTissue-Tek/Sakura4457
24-Objektträger-Objektträgerhalter mit abnehmbarem GriffTissue-Tek/Sakura4465
BackofenThermo Scientific6243zum Backen von Objektträgern bei 65 Grad
SeziermikroskopZeissStemi 2000C
FluoreszenzmikroskopNikonEclipse 90iHelles und fluoreszierendes Licht, mit Objektiven: 10X, 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker MiniFisherScientific DAI-PAP-S-M
Ethanol 200 proofAAPR111000200
MethanolVWRBDH1135-4LP
EisessigAAPR281000ACS
XylolFisher ScientificX5P-1GAL
Wasserstoffperoxid 25%ige Lösung in WasserACROS202465000
10% buferedformalin Fisher Scientific22-026-213
Rinderserumfraktion V, HitzeschockRoche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
NatriumcitratFisher ScientificS279
SondennadelVWR20068-624
Kaninchen Anti Klf5 AntikörperSanta Cruz Biotechnologiesc-22797Verdünnung 1:150
Huhn Anti EGFP AntikörperMilliporeAB16901Verdünnung 1:500
Kaninchen Anti Ki67AntikörperBiocare MedicalCRM325BVerdünnung 1:500
Mach3 Kaninchen AP Polymer NachweiskitBiocare MedicalM3R533L
Warp Red Chromogen KitBiocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 Mäuse Jackson Labs008875 
Automatisierter ProzessorLeicaLeica TP1020

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
  3. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  4. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  5. van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
  6. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
  7. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
  8. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  9. May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
  10. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  11. Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
  12. McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
  13. McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
  14. Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
  15. Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
  16. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
  17. Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
  18. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  19. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
  20. Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
  21. Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
  22. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  23. McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
  24. Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
  25. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
  26. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Immunohistochemische AnalyseImmunfluoreszenzanalysemodifiziertes Bouin FixativMaus Darmgewebehistologische F rbungParaffin Einbettbl ckeGewebeprozessierungskassetteFluoreszenznachweismethoden

Verwandte Artikel