Methodenartikel

Subtyping von Campylobacter jejuni Ssp. doylei Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)

DOI:

10.3791/54165

⸱

30. Oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) wurde verwendet , um eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp geben. Doylei isoliert auf Stammebene im Vergleich zu multilocus Sequenz Typisierung (MLST).

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF-MS bietet die Möglichkeit, einige Bakterien nicht nur auf die Art und Unterart Ebene zu unterscheiden, sondern auch unten auf Stammebene. Allelische Isoformen der nachweisbaren Biomarker-Ionen führen zu Isolat-spezifische Massenverschiebungen. Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) ist eine neuartige Technik, die die massenspektrometrische nachweisbar Biomarkers Massen in einem System kombiniert, das Abzug von phyloproteomic Beziehungen von Isolat spezifischen Massenverschiebungen im Vergleich zu einem Genom-Referenzstamm sequenziert werden kann. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden dann verwendet, MSPP Basis Dendrogramme zu berechnen.

Hier beschreiben wir den Workflow von MSPP durch eine Campylobacter jejuni ssp eingeben. Doylei Isolat Sammlung von sieben Stämme. Alle sieben Stämme waren menschlichen Ursprungs und multilocus Sequenz Typisierung (MLST) ihre genetische Vielfalt unter Beweis gestellt. MSPP-Typisierung ergab sieben verschiedene Typen MSPP Sequenz, ausreichend ihre phy reflektierendenlogenetic Beziehungen.

Die C. jejuni ssp. doylei MSPP Schema 14 verschiedene biomarker Ionen enthält, meistens ribosomalen Proteine in dem Massenbereich von 2-11 kDa. MSPP kann im Prinzip, mit einem erweiterten Massenbereich zu anderen massenspektrometrischen Plattformen angepasst werden. Daher hat diese Technik das Potenzial, ein nützliches Werkzeug für die Stammebene mikrobielle Typisierung zu werden.

Einleitung

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Während des letzten Jahrzehnts, Matrix-assistierte Laser - Desorptions - Ionisations -Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF - MS) fortgeschritten in der klinischen Mikrobiologie 1, ein hoch geschätzter Standardmethode zur mikrobiellen Gattung und Art Identifizierung zu sein 2. Spezies Identifizierung wird auf die Aufzeichnung von kleinen Protein Fingerabdrücke von intakten Zellen oder Zell-Lysaten basiert. Der typische Massenbereich für eine Masse in der klinischen Routine Mikrobiologie verwendeten Spektrometer 2-20 kDa. Zusätzlich kann die resultierenden Spektren verwendet werden , Stämme bei den unten Spezies und unter subspecies Ebene 3 zu unterscheiden. Frühe Pionier Studien haben spezifische Biomarker - Ionen für eine bestimmte Untergruppe von Stämmen in Campylobacter jejuni 4, Clostridium difficile 5, Salmonella enterica ssp. enterica Serovar Typhi 6, Staphylococcus aureus 7 bis 9, und Escherichia coli 10 bis 12.

Die Kombination mehrerer variabler Biomarkers Massen allelische Isoformen entsprechenden bietet die Möglichkeit, für tiefere Subtyping. Früher führten wir erfolgreich eine Methode , um diese Variationen in Massenprofile in aussagekräftige und reproduzierbare phyloproteomic Beziehungen Massenspektrometrie phyloproteomics (MSPP) auf einem C genannt zu konvertieren jejuni ssp. jejuni - Isolat Sammlung 13. MSPP eine massenspektrometrische äquivalent zu DNA-Sequenz basiert Subtyping Techniken wie multilocus Sequenz Typisierung (MLST) verwendet werden.

Campylobacter - Arten sind die Hauptursache von bakterieller Gastroenteritis weltweit 14, 15. Als Folge der Campylobacteriosis postinfektiöse sequela, nämlich Guillain Barré - Syndrom, reaktive Arthritis und entzündlicher Darmerkrankung kann 16 entstehen. Die Hauptinfektionsquellen sindkontaminiertes Tierfleisch aus Huhn, Pute, Schwein, Rind, Schaf und Enten, Milch und Oberflächenwasser 15, 17. regelmäßige epidemiologische Überwachung Studien im Zusammenhang mit der Lebensmittelsicherheit sind daher notwendig. MLST ist der "Goldstandard" in der molekularen Typisierung für Campylobacter - Arten 18. Weil die Sanger-Sequenzierung basiert MLST Verfahren ist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und relativ teuer ist MLST typing auf relativ kleine Isolat Kohorten beschränkt. Daher besteht ein Bedarf an preiswerter und schneller Subtypisierung Methoden. Dieser Bedarf könnte durch massenspektrometrische Methoden wie MSPP erfüllt werden.

In diesem Beitrag wird ein ausführliches Protokoll für MSPP-Typisierung eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp. Doylei Isolate und Vergleich seines Potentials mit MLST.

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Protokoll

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1. Bereiten eines sicheren Arbeitsplatzes durch die biologische Sicherheit Bedingungen Unter Berücksichtigung

  1. Machen Sie sich vertraut mit den Labor- und Sicherheitsbestimmungen, die mit Mikroorganismen für die Arbeit relevant sind. Die meisten humanpathogenen Mikroorganismen müssen bei Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen , aber einige, wie Salmonella enterica Serovar Typhi, erfordern 3. Informationen Biosicherheitsstufe auf Ebene behandelt werden , um jeden Erreger der Handhabung kann bei www.cdc.gov/biosafety zugegriffen werden.
  2. Unabhängig von der Biohazard Klassifizierung des spezifischen Mikroorganismus, betrachten alle Materialien, die in Kontakt mit dem infektiösen Erreger als infektiöse Abfälle herrühren, die vor der Entsorgung autoklaviert werden müssen. Respektieren Sie regionale Sicherheitsrichtlinien für Gefahrstoffe und biologische Substanzen. Stellen Sie sicher, dass geeignete Behälter für die unmittelbare und ordnungsgemäße Entsorgung von möglicherweise kontaminiertem Material (biohazards) zur Verfügung.
  3. Stellen Sie sicher, dass die sterile Instrumente (Impfösen), Lösungen und Kulturmedien (Agar-Platten) zur Verfügung stehen, bevor Bakterienkultur beginnt.
  4. Waschen Sie Ihre Hände mit antiseptischer Seife und warmem Wasser unmittelbar nach dem infektiösen Mikroorganismen Handhabung.

2. Wählen Sie Referenz und Sammlung Isolates

  1. Wählen und erhalten ein Standard-Genom-Sequenzierung Referenz isolieren mit den Sequenzen des codierten Proteom entlang, idealerweise im FASTA-Format. Wenn mehr Genom sequenziert Stämme zur Verfügung stehen, sind diese in der Analyse.
    Hinweis: Dieses Isolat / diese Isolate wird später verwendet werden, um die Identität der Massenspitzen in der Massenspektrometrie beobachtet vorherzusagen (siehe Abschnitt 7).
  2. Wählen und erhalten eine Vielzahl von potenziell unterschiedlichen Isolate in einer Weise, dass sie die Phylogenie der Art oder Unterart von Interesse abdecken.
    Hinweis: Diese Isolate wird später verwendet werden, um die Variabilität von Biomarkern in der Bevölkerung zu zeigen (siehe Abschnitt 8).
  3. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Kollektion und Referenz-Isolat (n) proPerly durch den jeweiligen Goldstandard eingegeben für diesen speziellen Organismus 18 bis 20.
    Anmerkung: Dies kann eine Vielzahl von (sub) -typing Methoden umfassen, aber wird wahrscheinlich MLST greifen, die immer noch das Standardverfahren ist die genetische Vielfalt der meisten mikrobiellen Spezies nachzuweisen.
  4. Abzuleiten , die Phylogenie innerhalb der Sammlung, berechnen einen Phylogramm aus den Eingabe - Daten, zum Beispiel unter Verwendung der ungewichteten Paar Gruppenmethode mit arithmetischen Mittelwert (UPGMA) in MEGA6 Software für MLST Daten 21. Für MLST Daten, wenden auch eine Datenbank MLST und Sequenztypen und die jeweiligen klonalen Komplexen 22 zuweisen.
    Hinweis: Dies wird später verwendet werden, um die Kongruenz von MSPP zu analysieren mit dem früheren Goldstandard Typisierungsmethode (siehe Abschnitt 9).

3. Stellen Sie eine MALDI Zieltafel

ACHTUNG: TFA ist eine starke Säure. Eine unsachgemäße Verwendung von TFA trägt das Risiko einer schweren Verätzungen der Haut, Augenschäden und schwere Reizung of der oberen Atemwege beim Einatmen. Daher müssen strenge Sicherheitsmaßnahmen beachtet und Persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Schutzbrillen, Gesichtsschutzschilde, geeignete Handschuhe, Stiefel werden, oder sogar eine Vollschutzanzug benötigt wird, während TFA Handhabung. Mögliche Exposition gegenüber TFA muss durch den Umgang mit der Substanz unter ausreichender Belüftung mit einem effektiven Absauganlage gesteuert werden. Bei unzureichender Belüftung, ein Beatmungsgerät mit anerkanntem Filtertyp verwendet werden. Zusätzlich ist TFA schädlich für Wasserorganismen mit langfristiger Wirkung. Jede Freisetzung von TFA in Abwasser in die Umwelt zu vermeiden.

Hinweis: Bevor die Proben auf ein MALDI-Target Spek, reinigen Sie die Zielplatte gründlich, wenn die Platte vorher verwendet wurde.

  1. Herstellung von 100 ml 70% ige wässrige Ethanollösung unter Verwendung von 30 ml entionisiertem Wasser und 70 ml reinem Ethanol.
  2. Bereiten 250 ul einer 80% iger wßriger Trifluoressigsäure (TFA) Lösung, die durch Mischen von 50& mgr; l entionisiertes Wasser und 200 & mgr; l 100% TFA in einem Reaktionsrohr und das Rohr dem Vortexen für 1 min.
  3. Reinigen der MALDI-Target, indem sie in eine Glasschale setzen und es in 70% wäßrigem Ethanol für etwa 5 min bei Raumtemperatur submersing.
  4. Spülen Sie das Ziel unter heißem Wasser.
  5. Mit einem Papiertuch, wischen Sie die Zielplatte intensiv mit 70% wässrigen Ethanollösung, die alle vorherigen Proben und andere mögliche Ablagerungen zu entfernen.
  6. Wenn eine weitere Reinigung erforderlich ist, spülen Sie unter heißem Wasser, während sie mit einem Papiertuch abwischen.
  7. Entfernen Sie Rest und möglicherweise unsichtbar, Verunreinigungen durch Abdecken der Zieloberfläche mit einer dünnen Schicht von 80% wässriger TFA (~ 100 & mgr; l pro 96 Punkte) und wischt alle Zielpositionen sauber und mit einem Papiertuch.
  8. Schließlich spülen Sie die Ziel Säure zu entfernen, wischen Sie sie trocknen ein Papiertuch und lassen Sie es für Temperatur mindestens 15 Minuten bei Raum restliche Flüssigkeit zu verdampfen.

4. Herstellung eines45; Cyano-4-Hydroxy-zimtsäure Matrix Lösung, die eine interne Calibrant

  1. Bereiten einer gesättigten Matrixlösung durch Lösen von 10 mg α-cyano-4-hydroxy-Zimtsäure (HCCA) in 1 ml einer Mischung aus 50% Acetonitril, 47,5% Wasser und 2,5% TFA. Rest ungelöstem HCCA bleibt, wenn die Lösung gesättigt ist.
  2. In rekombinanten Humaninsulin als interne Kalibrant. Dazu wird eine Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 10 pg / ul in 50% wässrigem Acetonitril, aliquotieren und bei -20 ° C für die weitere Verwendung vorzubereiten.

5. MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Hinweis: Die Kulturbedingungen spezifisch für die Organismen von Interesse verwendet werden müssen. Die Proben für die MALDI-TOF MS kann entweder durch Abstrich Vorbereitung oder Extraktion, je nach Organismus (siehe Abschnitt 8.4.1) hergestellt werden. Während die Ethanol-Ameisensäure-Extraktions-Verfahren ausreichende Inaktivierung von Pathogenen liefert, hat Abstrich Vorbereitung unter ausr durchgeführt werdeniziente Biosicherheit Bedingungen wie erforderlich (siehe Abschnitt 1). Normalerweise gibt es kein Risiko einer Infektion nach der Anwendung der Matrix, aber für bestimmte Krankheitserreger spezifische Inaktivierung Protokolle erforderlich sind. So kann zum Beispiel MALDI-TOF MS von Nocardia - Spezies erfordert vorherige Lyse der Bakterien in kochendes Wasser, gefolgt von Ethanol - Präzipitation von Proteinen 23. EI Khéchine et al. ein Verfahren zur Inaktivierung von Mycobacteria entwickelt, um die Bakterienkolonien bei 95 ° C für 1 h in Schraubdeckel - Röhrchen , die Wasser und 0,5% Tween 20 24 erhitzt wird .

  1. Smear Vorbereitung
    1. Verbreiten Sie eine stecknadelkopfgroße Menge einer Bakterienkolonie direkt auf eine MALDI-Target Plattenposition ( "Spot").
    2. Overlay jede Stelle mit 1 ul HCCA regelmäßige Matrix oder Matrix, die die interne Kalibrant enthält, und lassen bei Raumtemperatur zu kristallisieren. Zur Bestimmung der genauen Masse des Kalibrierungs Spitze, Overlay ein Steuer spot mit 1 ul Test Standard und 1 ul HCCA Matrix, die die interne Kalibrant enthält.
      Anmerkung: Hier wird , wie Test Standard ein Extrakt aus Escherichia coli DH5 alpha verwendet , das ein charakteristisches Protein Fingerabdrucks in MALDI-TOF MS zeigt. Es ist mit zwei Proteinen versetzt, die die obere Grenze der detektierbaren Massenbereich erweitern.
  2. Extraktionsmethode
    1. Ernte etwa fünf Kolonien von einer Agarplatte Kultur mit einer Impföse und suspendieren gründlich in 300 & mgr; l doppelt destilliertem Wasser in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß. In 900 ul absolutem Ethanol und gründlich mischen durch wiederholtes Pipettieren, bis die Bakterienkolonien vollständig suspendiert sind.
      Anmerkung: In diesem Schritt ist es möglich und gut etabliert zu speichern, die Proben bei -20 ° C. Zusätzlich kann die Inaktivierung von Krankheitserregern durch Ausstreichen 1-10 ul des Extraktes auf eine geeignete Agarplatte nach Inkubation bei optimalen Wachstumsbedingungen getestet werden. Erfolgreich inAktivierung wird durch das Fehlen von mikrobiellem Wachstum angegeben.
    2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 × g für 1 min, den Überstand verwerfen, und trocknen Sie das Pellet bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Das Pellet sorgfältig durch Pipettieren up-and-down in 50 ul von 70% Ameisensäure.
    3. In 50 ul Acetonitril und mischen. Entfernen Trümmer durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 2 min. Transfer 1 & mgr; l Überstand auf eine Abtastposition auf einer MALDI Zielplatte und lassen für 5 min bei Raumtemperatur trocknen.
    4. Overlay jede Stelle mit 1 ul HCCA Matrix, die die interne Kalibrant enthält, und lassen bei Raumtemperatur zu kristallisieren.
  3. Aufnahme von Massenspektren
    Hinweis: Peak-Kommissionierung von Massenspektren erfolgt unter Verwendung der Standardverfahren empfohlen (Centroid Algorithmus; S / N-Verhältnis. 2; rel Intensität Schwelle: 2%; Peakbreite 3 m / z, Baseline-Subtraktion: TopHat)
    1. Kalibrieren Sie das Gerät gemäß den Hersteller Protocol.
    2. Für jeden Punkt, sammeln 600 Spektren in 100-shots Schritten.
      1. Gehen Sie auf die "AutoXecute" Register der Konfigurationssoftware des Massenspektrometers. Öffnen Sie die "Methode" durch Linksklick auf die "Methode" und die Wahl der Methode zB "MBT_AutoX" aus dem Pull - Down - Menü.
      2. Klicken Sie links auf "Bearbeiten ..." Button rechts neben der "Methode" Menü "AutoXecute Method Editor" zu öffnen. Gehen Sie auf die "Akkumulation" Registerkarte. Stellen Sie die "Summe up" Wert auf "600" und die "befriedigend Schüsse in" _x_ "Schuss Schritte" Wert auf "100".
  4. Interne Spectrum Kalibrierverfahren
    Hinweis: Minute Messfehler Massenspektrometrie inhärent sind. Je nach intermittierenden Instrument Gebrauch, Gerätetemperatur und Neukalibrierung, die erhaltenen Messwerte können zwischen den Experimenten variieren. Folgende Vormessung Instrumentenkalibrierung und Nachmessung Spektrum Kalibrierung zu einer internen Kalibrant ist die genaueste Art und Weise inter Spektrum Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
    1. Führen Sie die folgenden Schritte für jede Kalibrierung Peak-Liste:
      1. Starten Sie Spektrum - Browser (zB flexAnalysis und offene Spektrum. Menü "Datei" → "Open ...")
      2. Erstellen Massenkontrollliste mit Kalibrant Spitze: Menü "Methode" → "Open ...".
      3. Wählen Sie Methode: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Öffnen".
      4. Bearbeiten Massen Control List: Deaktivieren Sie alle Kalibranten.
      5. In Calibrant Spitze unten: Peak-Label: "Insulin_HIStag [M + H] + _ avg"; M_Z: "5808,29"; Toleranz [ppm]: "50"; Prüfen Calibrant Checkbox.
      6. Speichern unter, zB "MSPP Kalibrant Liste".
    2. Für jedes Spektrum, das Kalibrant Spitze aus der Liste auswählen, klicken Sie auf "Automatische Zuweisung" und drücken Sie "OK".
ove_title "> 6. Überprüfen Sie die interne Kalibrierverfahren

  1. Bestimmen Sie Experimentell die Exakte Masse der Kalibrierung Peak.
    1. Bereiten Sie zwei Punkte mit 1 ul Test Standard jeder (Schritt 5.1.1). Overlay die erste mit 1 ul regulären HCCA Matrix, die zweite mit 1 ul Kalibrant-dotierten Matrix.
    2. Erhalten Massenspektren von jeder Stelle (Abschnitt 5.3), und intern kalibrieren den Test Standard Spitzen (Abschnitt 5.4).
    3. Overlay beide Spektren von ihnen mit dem Spektrum - Browser (zB flexAnalysis und offene Spektrum: Menü "Datei" → "Open ...") zu öffnen und das Finden der Spitze bei der erwarteten Masse (Insulin m / z = 5,808.29), die vorhanden sein sollten in das Kalibriermittel-spiked Spektrum, aber nicht in dem Spektrum mit der regulären Matrix erhalten.
  2. Überprüfen Sie, ob die Calibrant Peak ist von keinem anderen Biomarkern des Organismus von Interesse Verdecktes.
    1. Bereiten Sie zwei Punkte (Abschnitt 5.1) mit dem Referenzstamm und overLAY die erste mit 1 ul regelmäßige Matrix, die zweite mit 1 ul Kalibrant-dotierten Matrix.
    2. Erwerben Massenspektren von beiden Punkte (Abschnitt 5.3) und überlagern die resultierenden Spektren von ihnen mit dem Spektrum - Browser (zB flexAnalysis und offene Spektrum: Menü "Datei" → "Open ...") zu öffnen. Sicherzustellen, dass die Kalibriermittel Peak im Spektrum deutlich sichtbar mit der Stachel Matrix erhalten und nicht von einem anderen benachbarten Signal verdeckt. Ist dies nicht der Fall ist, einen anderen Kalibriermittel für diesen speziellen Organismus wählen.
      Hinweis: signifikant mit einer Stachel internen Kalibrant Mit der Präzision erhöht Variationen von Biomarkern Massen zu bestimmen. Mit dieser Methode können Massendifferenzen bis herab zu 1 Da nachgewiesen werden. Alternativ können auch invariant Massen aus den Organismen stammen, können als Eichsubstanzen verwendet werden. Jedoch per Definition alle Organismus abgeleiteten Massen müssen möglicherweise Variable betrachtet werden, es sei denn, das Gegenteil bewiesen ist.

7. Identifizieren von Biomarkern Ionen in der Referenzstamm

  1. Messen Sie den Massenspektrum des Referenzstamm, unter Verwendung von Matrix Spiked mit dem Internal Calibrant.
    1. Verbreiten Sie eine stecknadelkopfgroße Menge einer Bakterienkolonie (Abschnitt 5.1) oder 1 & mgr; l der Bakterienprotein-Extrakt (Abschnitt 5.2) direkt auf eine MALDI-Target Plattenposition ( "Spot").
    2. Overlay jede Stelle mit 1 ul HCCA Matrix, die die interne Kalibrant und lassen Sie die Zielplatte enthält, bei Raumtemperatur (Abschnitt 5.1.2 / 5.2.4) zu kristallisieren.
    3. Nehmen Massenspektren des Referenzstamm (Abschnitt 5.3).
  2. Intern kalibrieren dem Referenzspektrum an die Kalibriermittel Masse (hier: Insulin bei m / z = 5,806.29) und anschließend Vorprozess durch Baseline Subtraktion (TopHat) und Glättung (Parameter: SavitzkyGolay; Breite: 2 m / z, 10 Zyklen).
    1. Starten Sie Spektrum - Browser (zB flexAnalysis und offene Spektrum: Menü "Datei" → "Open ...; ").
    2. Wählen Sie Methode: Pulldown - Menü "Methode" → "Open ...", Linksklick auf das Verfahren der Wahl, zB "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Öffnen".
    3. Kalibrieren Spektrum von "Internal ..." Auswahl im Pulldown-Menü "Kalibrieren". Ein Fenster öffnet sich und bietet die Kalibrant Spitze (n) (Abschnitt 5.4). Linksklick auf den Kalibrant Peak (Insulin) → Linksklick auf "OK". Wählen Sie "Prozessspektren" aus dem "Prozess" im Pulldown-Menü.
    4. Für Baseline Subtraktion aktivieren das Spektrum im Spektrum-Liste auf der rechten Seite. Wählen Sie "subtrahieren Massenspektrum Baseline" aus dem "Prozess" im Pulldown-Menü.
    5. Um das Spektrum zu glätten, aktivieren Sie das Spektrum im Spektrum-Liste auf der rechten Seite. Wählen Sie "Smooth Massenspektrum Baseline" aus dem "Prozess" im Pulldown-Menü.
  3. Aus der Genomsequenzierung Daten des Referenzstamm, berechnen die theoretical monoisotopischen Molekulargewicht von jedem der kodierten Proteine, die durch die DNA-Sequenz in die entsprechende Aminosäuresequenz Übersetzen eines Sequenz-Alignment-Editor. Copy-Paste diese Proteinsequenz in das Eingabefeld auf der ExPASy Bioinformatics Resource Portal (http://web.expasy.org/compute_pi/). und klicken Sie auf "Klicken Sie hier" pI / Mw zu berechnen. Im Fall von C. jejuni ssp. doylei die Masse von 14 nachweisbaren Biomarker berechnen.
  4. Kopiert die Ergebnisse in einer Tabelle mit einer Spalte, die das Gen Identifikator und dem nächsten dem Molekulargewicht enthält. Sortieren Sie die Zeilen, die von berechneten Molekulargewicht leichter Nachschlag der Massen zu erleichtern. Hinweis: Weitere Spalten sind optional; später für die Interpretation Funktionsannotation besonders nützlich sein kann.
  5. Legen Sie eine zweite Spalte in der Tabelle für das Molekulargewicht des de-methioninated Form, Subtraktion 135 Da aus dem monoisotopisch Molekulargewicht. Hinweis: Dies ist, weil einige Proteine ​​Post unterziehentranslationale Modifikation durch proteolytische Entfernung des N - terminalen Methionin.
  6. Ordnen Sie jedem großen gemessenen Biomarker Masse auf die berechneten Massen aus dem Referenzstamm durch die gemessene Masse aus dem Genom Tabelle oben schaut oben hergestellt (Tabelle 1).
  7. Wenn die Biomarker - Ionen können nicht vorhergesagt Genprodukte zugewiesen werden, sollten andere posttranslationale Modifikationen (Methylierung, Acetylierung, Prenylierung, usw., siehe http://www.abrf.org/delta-mass für eine Sammlung von Änderungen und die damit verbundenen Massenänderungen ). Für jede andere bekannte posttranslationale Modifikation, die häufig in den Organismen von Interesse fügen Sie eine weitere Spalte in der Tabelle und neu berechnet werden, das Molekulargewicht analog dem Verfahren für die de-methioninated Form beobachtet wird.
  8. Legen Sie eine andere Tabellenkalkulations Lasche nach oben, und für jeden Biomarkers Ion der Masse und der Kennung in einer separaten Spalte der Tabelle notieren.

8. Beurteilen von Biomarkern Variabilityin der Bevölkerung

  1. Kalibrieren Massenspektren aus der Sammlung erhalten isoliert, wie für den Referenzstamm gemacht (s) (Abschnitt 5.4.2).
  2. Identifizieren Variante Biomarker in den Massenspektren. Eine Variante Masse wird durch das Fehlen einer Masse bekannt aus dem Referenzspektrum und das Aussehen eines neuen Masse nicht in der Bezugs gekennzeichnet. Der Massenunterschied muss davon zu einem einzigen Aminosäureaustausch (Tabelle 2) oder einer Kombination entsprechen.
  3. Bei einem Isolat pro Zeile, notieren Sie die gemessene Masse für jeden Biomarkers und der vorhergesagten Isoform in den jeweiligen Tabellenspalten.
    Anmerkung: In seltenen Fällen können einige Massenverschiebungen zu mehreren verschiedenen Aminosäureaustausche, beispielsweise zugeschrieben werden, die beide, ausgetauscht durch D N und Q ausgetauscht durch E, und umgekehrt, zu einer Massenverschiebung von 0.985 Da (Tabelle 2). Dieses innere Problem kann nicht durch Massenspektrometrie allein gelöst werden. Daher haben verschiedene Isoformen auf Proteinsequenzebene die gleiche Massemuss als einzelne MSPP Art behandelt werden. Parallel Sanger - Sequenzierung der jeweiligen Biomarker - Ionen - Gene bestätigt , dass dieses Problem nicht auftreten , während die C MSPP-Eingabe jejuni ssp. doylei Sammlung in dieser Studie verwendeten isolieren.
  4. Bestätigen Roman MSPP Arten von PCR-Amplifikation und Sequenzierung der jeweiligen Biomarker-Genen. Dies wiederum dient auch als Bestätigung, dass die Identität biomarker korrekt zugewiesen wurde.
    1. Kultur bakteriellen Isolate unter optimalen Wachstumsbedingungen. Kultur C. jejuni ssp. doylei Stämme auf Agar Columbia mit 5% Schafsblut ergänzt bei 37 & deg ; C unter mikroaerophilen Bedingungen (5% O 2, 10% CO 2, 85% N 2) ist . Inkubieren für ca. 48 Std. Verwenden Sie eine separate Agarplatte für jedes Isolat eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
    2. Extrahieren genomischer DNA der Bakterien Isolate einen geeigneten DNA-Extraktions-Kits / automatisierte Maschinen mit entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
    3. Amplify die jeweiligen Biomarker - Gene unter Verwendung der genannten Primer , die in Tabelle 3 Führen Sie alle PCR - Reaktionen unter den folgenden Bedingungen:. Denaturierung bei 94 ° C für 30 Sekunden; Annealing bei 55 ° C für 30 sec; Elongation bei 72 ° C für 30 sec.
    4. Bestimmung der DNA-Sequenz von jedem Amplicon durch Sanger-Sequenzierung eine geeignete Menge an genomischer DNA unter Verwendung von (in der Regel 600-700 ng DNA in einer Konzentration von ca. 100 ng / & mgr; l ausreichend) und einer der Amplifikationsprimer (in der Regel geschieht dies durch Verwendung eines Service-Provider).
  5. In einer separaten Tabelle (siehe Tabelle 4), das die abgeleitete Proteinsequenz für jede neue Isoform aufnehmen , indem Sie eine entsprechende Übersetzung Tool (zB Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. Berechnen eines MSPP-basierten Phylogenie und Vergleichen mit dem Gold Standard

  1. Verketten die einzelnen Sequenzen Biomarkers Aminosäure gehören, zu ter MSPP Art der Isolate in eine kontinuierliche Folge eine Sequenz - Alignment - Editor, wie BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 oder dem Biomarker - Tabelle.
  2. Berechnen Phylogenese durch Clustering wie für den Goldstandard Typisierung Daten durchgeführt, zum Beispiel UPGMA Clustering 21.
  3. Vergleichen Sie die MSPP-basierte Phylogenie zu der mit dem Goldstandard erhalten 4, 13.

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Ergebnisse

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Früher haben wir erfolgreich ein MSPP Schema für C einstellt jejuni ssp. jejuni 13. Hier wollten wir die Methode zu erweitern , um die Geschwister C. Unterart jejuni ssp. doylei. In dieser speziellen Einstellung, sieben C. jejuni ssp. doylei Isolate wurden von der belgischen Sammlung von Mikroorganismen / Labor für Mikrobiologie UGent BCCM / LMG Gent, Belgien erworben. Alle sieben Isolate für unsere Analys...

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Diskussion

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Der wichtigste Schritt bei der Einrichtung eines MSPP Regelung ist die eindeutige genetische Bestimmung von Biomarkern Ionen-Identitäten. Wenn es nicht möglich ist , einen Biomarkers zweifellos zu identifizieren, dann sollte es aus dem Schema 13 ausgeschlossen.

Die C. jejuni ssp. doylei Schema enthält 14 verschiedene Biomarker - Ionen. Diese sind 5 weniger im Vergleich zu dem C. jejuni ssp. jejuni MSPP Schema 13 .Die wesentlichste Unt...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Hannah Kleinschmidt für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde gefördert durch das Open-Access-Förderprogramm der Deutschen Forschungsgemeinschaft und den Publikationsfonds der Georg-August-Universität Göttingen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AcetonitrilSigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland34967
Autoflex III TOF/TOF 200 SystemBruker Daltonics, Bremen, DeutschlandGT02554 G201Massenspektrometer
bakterieller Teststandard BTSBruker Daltonics, Bremen, Deutschland604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland263564Softwarepaket
Bruker IVD Bakterial Test StandardBruker Daltonics, Bremen, Deutschland82901905 Röhrchen
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolieren Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, BelgienLMG8843ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; Stamm 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, BelgienLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, BelgienLMG7790ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper, 71; LMG 8219; NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, BelgienLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolat Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, BelgienLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolieren Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, BelgienLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgien koordinierte Sammlung von Mikroorganismen/Labor für Mikrobiologie UGent BCCM/LMG Gent, BelgienLMG8870NCTC A613/87
Columbia Agar base Merck, Darmstadt, Deutschland1.10455 .0500500 g
Kompass für FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland251419Softwarepaket
defibriertes Schafsblut Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, DeutschlandSR0051
EthanolSigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland02854 Fluka
AmeisensäureSigma-Aldrich, Taufkirchen, DeutschlandF0507
HCCA-MatrixBruker Daltonics, Bremen, Deutschland604531
Kimwipes PapiertaschentuchKimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland259935Softwarepaket
Mast Cryobank FläschchenMast Diagnostica, Reinfeld, DeutschlandCRYO/B
MSP 96 polierter Stahl TargetBruker Daltonics, Bremen, Deutschland224989
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Deutschland51304
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Z188956

Referenzen

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MALDI TOF MSTypisierung auf StammebeneBiomarker Ionenanalysephyloproteomische Beziehungenribosomale ProteineHerstellung der Matrixl sungZentrifugationsprotokollErfassung von Massenspektren

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