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Methodenartikel

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

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DOI:

10.3791/54167

⸱

29. August 2016

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein neuartiges humanisiertes Mauslebermodell, das in Alb-Toxin-Rezeptor-vermittelten Zell-Knockout-Mäusen (TRECK)/SCID-Mäusen nach der Transplantation von unreifen und expandierbaren humanen Leberstammzellen erzeugt wurde.

Zusammenfassung

Ein neuartiges Tiermodell mit chimären Mäusen mit humanisierten Lebern, das durch eine humane Hepatozytentransplantation etabliert wurde, wurde entwickelt. Diese Mäuse, bei denen die Leber wieder mit funktionsfähigen menschlichen Hepatozyten besiedelt wurde, könnten als nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Biologie menschlicher Leberzellen, des Arzneimittelstoffwechsels und anderer präklinischer Anwendungen dienen. Einer der Schlüsselfaktoren, die für eine erfolgreiche Transplantation menschlicher Hepatozyten in Mäuse erforderlich sind, ist die Eliminierung der endogenen Hepatozyten, um eine Konkurrenz mit den menschlichen Zellen zu verhindern und einen geeigneten Raum und eine geeignete Mikroumgebung für die Förderung der Expansion und Differenzierung menschlicher Spenderzellen zu schaffen. Bisher wurden zwei große Mausmodelle für Leberschäden etabliert, bei denen Fumarylacetoacetat-Hydrolase (Fah) und Uroplasminogen-Aktivator (uPA) verwendet werden. Fah-Mäuse werden jedoch hauptsächlich mit reifen Hepatozyten verwendet und die Anwendung des uPA-Modells ist durch eine verminderte Zucht eingeschränkt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Alb-Toxin-Rezeptor-vermittelte Zell-Knockout-Mäuse (TRECK)/SCID-Mäuse für die in vivo-Differenzierung unreifer humaner Hepatozyten und die humanisierte Lebergenerierung eingesetzt. Humane hepatische Stammzellen (HpSCs) besiedelten erfolgreich die Lebern von Alb-TRECK/SCID-Mäusen, die nach einer Behandlung mit Diphtherietoxin (DT) ein letales fulminantes Leberversagen entwickelt hatten. Dieses Modell einer humanisierten Leber in Alb-TRECK/SCID-Mäusen wird funktionelle Anwendungen in Studien zum Arzneimittelmetabolismus und zu Arzneimittelwechselwirkungen haben und andere in vivo und in vitro Studien fördern.

Einleitung

Mäuse werden häufig für pharmazeutische Tests verwendet, da die biomedizinische Forschung am Menschen eingeschränkt ist1; diese Modelle sind jedoch nicht immer nützlich, da sie die beim Menschen beobachteten Effekte ungenau simulieren können. Die meisten Medikamente, die derzeit medizinisch verwendet werden, werden hauptsächlich in der Leber metabolisiert. Ein und dasselbe Medikament kann jedoch aufgrund von Unterschieden zwischen den Spezies in der Leber von Mäusen und Menschen in unterschiedliche Metaboliten metabolisiert werden. Daher ist es oft schwierig, während der Entwicklung festzustellen, ob ein potenzielles Medikament Risiken für die klinische Anwendung birgt2,3.

Um dieses Problem zu lösen, wurden "humanisierte" Mauslebern entwickelt, indem menschliche Leberzellen in Mäusen gezüchtet wurden4-6; diese Modelle zeigen Arzneimittelreaktionen, die denen in der menschlichen Leber ähneln. Zu den primären Mausmodellen, die derzeit für die humanisierte Lebererzeugung verwendet werden, gehören Uroplasminogenaktivator-Mäuse (uPA+/+)4,7, Fumarylacetoacetat-Hydrolase (Fah-/--) Mäuse6 und die kürzlich berichteten Thymidinkinase (TK-NOG)-Mäuse.

Frühere Berichte haben jedoch gezeigt, dass transplantierte menschliche unreife Zellen oder Stammzellen in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) Mauslebern8-10 weniger wettbewerbsfähig sind als adulte menschliche Hepatozyten. Darüber hinaus bieten Fah-/-Mäuse nur für differenzierte Hepatozyten und nicht für unreife Lebervorläuferzellen einen Wachstumsvorteil11. Die Transplantation von humanen hepatischen Stammzellen (HpSCs) in TK-NOG-Mäuse im Labor war bisher nicht erfolgreich. Daher gibt es derzeit kein brauchbares Mausmodell für die effiziente Transplantation von menschlichen unreifen Leberzellen.

Daher haben wir ein neuartiges Alb-TRECK/SCID-Mausmodell entwickelt, das effizient mit menschlichen unreifen Hepatozyten bestückt werden konnte. Dieses transgene Mausmodell exprimiert humane Heparin-bindende EGF-ähnliche Wachstumsfaktor-Rezeptoren (HB-EGF) unter der Kontrolle eines leberzellspezifischen Albumin-Promotors. Nach der Verabreichung von Diphtherietoxin (DT) entwickeln diese Mäuse aufgrund der bedingten Ablation von Hepatozyten eine fulminante Hepatitis, die den Aufenthalt und die Proliferation von Spenderzellen ermöglicht12. Obwohl in früheren Studien13,14 Maus-Hepatozyten erfolgreich in Alb-TRECK/SCID-Mäuse transplantiert wurden, wurde die Erzeugung einer humanisierten Leber mit Alb-TRECK/SCID-Mäusen noch nicht berichtet.

In dieser Studie wurden humanisierte Lebern in Alb-TRECK/SCID-Mäusen durch Transplantation von HpSCs erzeugt. Diese humanisierte Leber bietet eine In-vivo-Umgebung für die universelle Differenzierung von Stammzellen und die Möglichkeit, Stoffwechselmuster und Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln beim Menschen vorherzusagen.

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Protokoll

Alle Tierversuchsverfahren wurden nach den Tierschutzrichtlinien von Yokohama City University durchgeführt.

1. Erzeugung des akuten Leberschädigung Mausmodell

  1. 1 ml phenolisiert 0,85% NaCl-Lösung (0,6 g Phenol in 100 ml 0,85% NaCl-Lösung) auf 1 mg Diphtherietoxin (DT), um eine 1 mg / ml Stammlösung DT zu machen. Anmerkung: DT in einer Konzentration von 1 mg / ml für etwa 2 Jahre bei 3 ° C bis 8 ° C gelagert werden.
  2. Seriell verdünnt das 1 mg / ml Stammlösung DT bis 0,3 & mgr; g / ml in DT phenolisiert 0,85% NaCl-Lösung und ein Aliquot der 0,3 ug / ml DT Lösung als Arbeitslösung herzustellen. Hinweis: Diese Arbeitslösung sollte frisch zubereitet werden.
  3. Zur Durchführung der Versuche einer subletalen Dosis verwendet (~ 50% Letalität), verabreichen 8 Wochen alte Mäuse eine 1,5 & mgr; g / kg Dosis von DT.
    1. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion von DT mit der Maus in Rückenlage halten und legen Sie die needle unterhalb der Biegung der Knie, links oder rechts von der Mittellinie. Vermeiden, dass die Mittellinie Eindringen der Blase zu verhindern. Winkel der Nadel bei etwa 45 ° an den Körper.
    2. Verwendung einer Insulinspritze, injizieren die Mäuse mit 100 ul frisch hergestellten 0,3 & mgr; g / ml DT pro 20 g Mausgewicht. Beispielsweise ein 18-g Maus sollte 90 & mgr; l der 0,3 & mgr; g / ml DT-Lösung erhalten.
  4. Bei 48 Stunden nach der DT-Injektion, sammeln Blut aus der Schwanzvene mit der Maus in einem Verzögerer platzieren und Erwärmung der Maus Schwanz in einem 37 ° C Wasserbad für ca. 10 min, die Blutgefäße zu erweitern. Dann machen Sie einen 1-mm-nick in den Schwanz 2 cm von der Spitze mit einem scharfen Skalpell und sammeln das Blut mit einem Mikrokapillarröhre.
    1. Zentrifugieren Sie die Mikrokapillarröhre das Blut bei 1.500 × g für 5 min enthält, und sammeln das Serum durch den Überstand und Zellpellet zu trennen.
  5. Pipettieren von 50 & mgr; l von 1:20 verdünnt Mausserum auf GOT / AST-PIII gleitet. Messen der Extinktion des Reaktionsprodukts (blauer Farbstoff) bei 650 nm eine Mehrzweck automatische Trockenchemie-Analysesystem unter Verwendung von nach dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Das Auslesen von Aspartat-Aminotransferase (AST) / Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) -Aktivität wird automatisch angezeigt. 2 Tage Post DT, bei ungefähr 60% der Mäuse AST-Werte zwischen 12.000 ausgestellt - 16.000 IE / l und wurden als von einer akuten Leberschäden zu leiden. Diese Mäuse wurden in einen neuen Käfig übertragen und als Zelltransplantat-Empfängern verwendet.

2. Herstellung von menschlichen Leberstammzellen

  1. Isolieren der menschlichen Leber Stammzellen aus menschlichen primären fötalen Leberzellen mit einem Zellsortierer mit den CDCP1, CD90 und CD66 Zell-Antigene eine CDCP1 + CD90 + CD66- Subpopulation zu erhalten, dann Samen der isolierten Zellpopulation auf Kollagen IV-beschichteten Kulturschalen, wie zuvor berichtet 15. Verwenden menschliche primäre fetale Leberzellen eines embryonalenAlter zwischen 14 und 18 Wochen.
  2. Sammeln der menschlichen Leber Stammzellen kultiviert auf 80% - 90% Konfluenz auf 100-mm-Kulturschalen, die das Kulturmedium anzusaugen, wasche die Zellen mit 10 ml PBS und anschließend die PBS zu entfernen. Trypsinize die Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA-Lösung für 5 min bei 37 ° C. Anmerkung: Die Zellen mit mehr als 90% Konfluenz für die Zelltransplantation nicht geeignet sind, da die Zelldifferenzierung ihre Proliferationsfähigkeit bei Mäusen beeinflussen.
  3. Überwachen Sie den Status der Zelldispersion unter einem Mikroskop. Wenn die Zellen frei zu schweben oder fließenden erscheinen, durch Hinzufügen von 8 ml DMEM / F12, enthaltend 10% FBS, die enzymatische Verdauung zu stoppen.
  4. Suspend die Zellen langsam eine 10-ml serologische Pipette und übertragen Sie die Zellen in einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 100 xg und 4 ° C.
  5. resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 10 ml DMEM / F12 10% FBS enthält, und zu bestimmen, die Zellzahlen ein Mikroskop Zählkammer verwenden.
  6. Teilen Sie die Zellen in 1,0 x 10 6 Zellen pro 50 ul PBS Aliquots für jede einzelne Maus und speichern auf Eis bis zur Transplantation.

3. intralienale Transplantation von menschlichen Leberstammzellen

  1. Einen sauberen Käfig auf einem 37 ° C elektrische Heizkissen.
  2. Anästhesieren der Maus Isofluran Inhalation (1 - 1,5% (vol / vol) in 2 l Sauerstoff pro min), indem sie unterhalb des Düsen platzieren. Alternativ können Sie Rohre Gaze mit Isofluran getränkt enthält.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Maus leicht betäubt durch den hinteren Fußballen Kneifen. Wenn ein Kniereflex ausgelöst wird, legen Sie die Maus wieder in der Kammer. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  3. Rasur die Operationsstelle mit elektrischen Haarschneidemaschine und wenden 70% (vol / vol) Ethanol und Povidon-Iod zu sterilisieren. Dann machen Sie eine 1-cm Hautschnitt in der linken Flanke knapp unterhalb der Costal Grenze der Rippen, durch einen Einschnitt folgte aufdie Bauchdecke sowie das Peritoneum.
  4. aussetzen vorsichtig die Milz. Verwenden eine 100-ul Mikroinjektionsspritze mit einer 32-G 1/2-Zoll - Nadel zu injizieren direkt 1,0 x 10 6 menschliche Leberstammzellen in 50 & mgr; l PBS in die Milz jeder Maus. Kippen Sie die Nadel in einem Winkel von 5 ° zur Injektion.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Tiefe der Injektion ist weniger als die Hälfte der Dicke der Milz. Die Nadel sollte die Milz an einem Ende (der Kopf) und deponieren die Zellen am anderen Ende (der Schwanz) eingeben.
  5. Um ein Auslaufen der Zellen verhindern Injektion folgende, leicht anzuwenden Druck einen Finger für 2 min und anschließend die Nadel entfernen.
  6. Legen Sie die Milz wieder in die Maus Körper und schließen Sie den Hohlraum mit einer normalen Lauf Naht für die Muskulatur und die Haut.
  7. Übertragen Sie die Mäuse in eine 37 ° C vorgewärmten Käfig unmittelbar nach der Transplantation. Um die Maus sorgen in der Lage, bequem zu atmen, legen Sie die Maus auf die Seite in den Käfig einMiktion Kontakt zwischen dem Käfig Betten und der Operationsstelle.
  8. Überwachen Sie die Mäuse, bis die Betäubung die Nähte zu gewährleisten nachlässt bleiben geschlossen und die Mäuse wieder in Vorchirurgischer Bedingungen.
  9. Sicherstellen, dass die Mäuse mit normalem Trinkwasser und Lebensmittel zur Verfügung gestellt. Nach 1 Stunde, bringen Sie den Käfig an der Maus Raum des Tieres Zentrum und die Mäuse täglich überwachen.

4. Nachweis von transplantierten menschlichen Leber-Zellen abgeleiteten Hepatozyten in der Mausleber Stem

Hinweis: Für die folgenden Verfahren, einschläfern alle Tiere eine Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch gefolgt werden.

  1. Bei 4 - 6 Wochen nach der Transplantation, einschläfern die Mäuse und öffnen Sie die Bauchhöhle, indem Sie gleichzeitig die Kutis Schneiden und Faszien mit chirurgische Scheren.
  2. Präparieren Sie das Bindegewebe über dem Peritoneum, mit der Schere als Spreizer, und schneiden Sie das Peritoneum entlang der linea alba die Peritonealdialyse zu öffnenHohlraum.
  3. Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette, die Membran durchstechen, und schneiden Sie durch jede Seite des Brustbeins nach oben durch den Gebärmutterhals-Gürtel.
  4. Sever die Hohlvene auf der Brustseite der Leber und ziehen Sie die Speiseröhre durch die Leber in der vorderen Richtung. Entfernen Sie die Membran, um die Leber zu entfernen.
    Hinweis: Achten Sie darauf, die Spitzen der Schere zu halten nach oben gerichtet, um unter eine Beschädigung der Brustorgane zu verhindern. Der Thymus hat eine Tendenz, gelegentlich an der dorsalen Seite des Sternums klammern und diese sorgfältig vermieden werden müssen.
  5. Verwendung der Membran als Griff, beginnen die Leber aus der Bauchhöhle herausziehen. Das Innere Hohlvene wird die Leber an Ort und Stelle zu halten. Schneiden Sie das Innere Hohlvene; nicht vorzeitig zu befreien, die rechte Neben vorsichtig sein.
    Hinweis: Die Mäuse haben ein vier-lappigen Leber, bestehend aus einem Mittellappen, linken Lappen, rechten Lappen und den Lobus caudatus. Die Gallenblase ist in der kleinen Gabelung suspendiertendie Mittellappen.
  6. Trennen Sie die Lappen voneinander an den Übergängen und betten sie in optimale Schnitttemperatur (OAT) Verbindung nach dem Protokoll des Herstellers. Frieren Sie das OAT das Lebergewebe in den Metallgittern auf dem Kryostaten enthält.
  7. Schneiden Sie 5 um dicke Probenabschnitte einen Kryostat bei -18 ° C unter Verwendung und montieren sie auf RT Mikroskop-Objektträger. Lagern Sie die Lager bei -80 ° C. Bereiten Sie die Folien für Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Immunfluoreszenzanfärbung nach zuvor berichteten Verfahren 16.

5. Nachweis von Humanalbumin-Sekretion und Berechnung der Rate Chimäre

  1. Menschliche Leber Rekonstitution messen, führen Humanalbumin ELISA unter Verwendung von Serum und einer menschlichen Albumin-ELISA-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  2. Berechnen Sie die humanisierte Leber chimären Rate von real-time PCR-Analyse der Expressionsniveaus in der gesamten-humanisiert Leber. Zur Ermittlung der relativen expression Pegelverhältnis von human-spezifischen Aktin zu Mensch-Maus Quer Aktin (Verhältnis 1) und das Verhältnis von Maus-spezifischen Aktin an Mensch-Maus Quer Aktin (Verhältnis 2). Die chimären Rate wird als Verhältnis 1 / (Verhältnis 1 + Verhältnis 2) berechnet.

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Ergebnisse

Alb-TRECK / SCID - Mäuse - Hepatozyten exprimieren das menschliche DT Rezeptor HB-EGF - Gen unter der Kontrolle eines Albumin - Promotor und nach Verabreichung DT 12 cytotoxische Effekte aufweisen. Um die Auswirkungen der DT-Behandlung auf eine Leberschädigung, DT-Dosen von 1,5 & mgr; g / kg zu bewerten, wurden in injizierten 8 Wochen alte Alb-TRECK / SCID-Mäuse und die pathologischen Veränderungen in der Leber 48 h nach Verabreichung DT wurden histologisch untersucht. Im ...

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Diskussion

Jüngste Studien haben gezeigt , dass die Maus Leber kann mit humanen Hepatozyten neu besiedelt werden, einschließlich Erwachsenen Hepatozyten und proliferative hepatische Stammzellen 17. Diese repopulated Lebern wurden als präklinische Versuchsmodelle für Arzneimittelmetabolismus Test und Arzneimittelentdeckung und -entwicklung 18 verwendet wird ; Darüber hinaus haben sie eine in vivo Umgebung für die Zellreifung und Differenzierung 19 versehen. Das Hauptziel der vorliegenden St...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Danksagungen

Wir möchten dem Mammalian Genetics Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, für die Bereitstellung der Mäuse danken. Wir danken auch S. Aoyama und Y. Adachi vom ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) & Toxicology Research Institute, Sekisui Medical Company Ltd., Japan, sowie K. Kozakai und Y. Yamada für die Unterstützung bei der LC-MS/MS-Analyse. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) an Y-W.Z. (18591421, 20591531 und 23591872) unterstützt; durch das innovative und unternehmerische Projekt Jiangsu zur Einführung hochrangiger Talente und das Jiangsu Science and Technology Planning Project (BE2015669); und durch Zuschüsse an H.T. zur strategischen Förderung innovativer Forschung und Entwicklung (S-Innovation, 62890004) von der Japan Science and Technology Agency.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Humanes AlbuminSigmaA6684Maus
Mensch CK19DakoM088801Maus
Menschliche ZellkerneMilliporeMAB1281Maus
Mensch CK8/18ProgenGP11Meerschweinchen
CDCP1Biolegend324006Maus
CD90BD559869Maus
CD66BD551479Maus
GOT/AST-PIIIFujifilm14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0,05% Trypsin-EDTAGibco25300-054
DiphtherietoxinSigmaD0564-1MG
Humanalbumin ELISA KitBethyl LaboratoriesE88-129
Spritze (1 ml)TerumoSS-01T
32G 1/2" NadelTSKPRE-32013
O.C.T.Compound (118 ml)Sakura Finetek Japan4583
MoFlo Hochgeschwindigkeits-ZellsortiererBeckman CoulterB25982
DRI-CHEM 7000Fujifilm14B2X10002000046

Referenzen

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