Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Zusammenfassung

Knochenmarkzellen, die mit dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kultiviert wurden, erzeugen eine heterogene Kultur, die Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) enthält. Diese Methode konzentriert sich auf die Verwendung von MHCII- und Hyaluronan (HA)-Bindung zur Unterscheidung von Makrophagen von den DCs in der GM-CSF-Kultur. Makrophagen in dieser Kultur haben viele Ähnlichkeiten mit Alveolarmakrophagen.

Zusammenfassung

Makrophagen und dendritischen Zellen (DCs) sind angeborene Immun in Geweben und lymphatischen Organen gefunden Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern spielen. Sie sind jedoch schwierig in ausreichender Zahl zu isolieren , sie im Detail zu studieren, also in vitro - Modelle entwickelt wurden. In vitro - Kulturen von Knochenmark stammenden Makrophagen und dendritische Zellen sind gut etabliert und wertvolle Methoden zum immunologischen Studien. Hier wird ein Verfahren zur Kultivierung und beide DCs und Makrophagen aus einer einzigen Kultur primärer Maus-Knochenmarkszellen zu identifizieren mit der Cytokin Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) beschrieben. Dieses Protokoll basiert auf dem etablierten Verfahren zuerst von Lutz et al entwickelt. im Jahr 1999 für die Knochenmark abgeleiteten DCs. Die Kultur ist heterogen, und MHCII und fluoresceinierten Hyaluron (FL-HA) verwendet Makrophagen von unreifen und reifen DCs zu unterscheiden. Diese GM-CSF Makrophagen provide eine bequeme Quelle für in - vitro - Makrophagen , die eng Alveolarmakrophagen in beiden Phänotyp und Funktion ähneln.

Einleitung

Mehrere in vitro Kulturverfahren beschrieben wurden Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark stammenden DCs (BMDCs) unter Verwendung eines oder einer Kombination von Wachstumsfaktoren zu erzeugen. BMDMs kann durch Züchten Knochenmarkszellen erzeugt werden unter Verwendung von entweder Makrophagen - Kolonie - stimulierender Faktor (M-CSF) oder GM-CSF ^1,2. Für BMDCs gibt die Zugabe von FLT3 - Ligand an der Knochenmarkkultur zu nicht-haft klassischen und plasmazytoiden DCs (CD11c ^hoch / MHCII ^hoch und CD11c ^lo, B220 ⁺ beziehungsweise) nach 9 Tagen in Kultur ^3,4. Im Gegensatz dazu nicht adhärenten nach 7 bis 10 Tagen in Kultur erzeugt Zellen mit GM-CSF allein ^5,6, GM-CSF und IL-4 ⁷ oder GM-CSF und FLT3 - Ligand ^8,9 erzeugen BMDCs mehr ähnelt entzündliche DCs (CD11c ^hoch, MHCII ^hohe CD11b ^{+) 10.} Obwohl diese in vitro Kulturen werden verwendet , Makrophagen zu erzeugen oderDCs, es ist unklar, ob jede Kultur Anlass zu reinen Populationen gibt. Obwohl beispielsweise adhärente Zellen in den GM-CSF - Kulturen beschrieben Makrophagen ^5, die nicht-adhärenten Zellen aus der gleichen Kultur zu sein als DCs ^6,11-13, mit der Annahme verwendet , dass sie homogen und jede beobachtete Variabilität sind, aufgrund unterschiedlicher Entwicklungsstadien ^14,15. Darüber hinaus haben Studien GM-CSF in vivo gefunden ^16,17, ein wesentlicher Wachstumsfaktor für Alveolarmakrophagen Entwicklung zu sein und kann in vitro verwendet werden alveolären Makrophagen-ähnliche ^16,17,18 zu erzeugen.

Anders als die Einhaltung sind die Verfahren für Makrophagen und DCs von GM-CSF behandelt Knochenmarkkulturen zu erzeugen sehr ähnliche Heterogenität was darauf hindeutet, innerhalb GM-CSF Knochenmarkkulturen existieren können. Dies scheint auch der Fall zu sein, da zwei Papiere des Vorhandenseins von BMDMs in der nicht-haftenden Fraktion von BMDC Kulturen berichten. In einem Papier, sie identified eine Population von Zellen CD11c ^+, CD11b ^+, MHCII ^mid, MerTK ⁺ und CD115 ^+, der eine Genexpression Signatur ausgedrückt, die am ehesten Alveolarmakrophagen und hatte eine reduzierte Fähigkeit glich zu aktivieren ¹⁹ T - Zellen. Das zweite Papier verwendet MHCII und FL-HA eine Alveolarmakrophage artigen Population (CD11c ^+, MHCII ^{mid / niedrig,} FL-HA ^hoch) zu identifizieren , die von unreifen (CD11c ^+, MHCII ^Mitte, FL-HA ^niedrig) und reifen unterschied DCs (CD11c ^+, MHCII ^hoch), die beide phänotypisch und funktionell ^18. Diese Papiere zeigen beide, dass GM-CSF BMDC Kulturen heterogen sind, sowohl Makrophagen und DC-Populationen enthalten, die Versorgung angibt, sollten getroffen werden, wenn Daten aus BMDC Kulturen zu interpretieren.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Knochenmark, Kultur Knochenmarkzellen in-GM-CSF zu isolieren und zu identifizieren, die Alveolarmakrophage artigenBindung und MHCII Ausdruck Bevölkerung aus den unreifen und reifen DCs im Knochenmarkkultur mittels Durchflusszytometrie FL-HA verwenden. Dieses Verfahren wird auf dem etablierten Verfahren von Lutz et al basierend ⁶ und 5 in der Lage , zu erzeugen -. 10 x 10 ⁶ nicht-adhärenten Zellen am Tag 7 einer 10 ml Kultur. Die Kultur ist verwendbar von den Tagen 7 bis 10 und ergibt eine heterogene Population von Makrophagen, unreifen und reifen DCs, sowie einige Progenitoren am Tag 7. Dies stellt eine einfache Methode zu wachsen und in vitro alveolären Makrophagen-ähnliche in großen Mengen zu isolieren.

Protokoll

Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitlinien für ethische Tierforschung von Verfahren, die von der University of British Columbia Animal Care Committee genehmigt eingeschläfert.

1. Der Erwerb einer einzelnen Zelle Knochenmark-Suspension von Maus Femur und Tibia

1. Schalten Sie einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) 15 Minuten vor dem Beginn des Verfahrens Schrank Luft zu reinigen und ermöglichen eine Luftströmung Stabilisierung, dann reinigen / Spray BSC Oberfläche mit 70% Ethanol. Halten alles so steril wie möglich für die Gesamtheit des Protokolls. Schneiden Sie nicht die Knochen unter nicht sterilen Bedingungen.
2. Vorbereitung Dissektionswerkzeuge von in 70% Ethanol (1 Paar Dissektion Schere, 2 Paar Pinzetten) Einweichen Hanks Balanced Salt Solution mit 5% fötalem Kälberserum (HBSS-FCS), sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm), 1 ml Spritzen, 26 ½ Gauge-Nadeln, konischen Sammelröhrchen (15 ml oder 50 ml) und Papiertücher in der BSC.
3. Euthanize mit der MausProtokolle, die von der Institution Tierforschung Ethikkommission genehmigt. Bringen Sie in die BSC, legen oben auf ein oder zwei Papiertücher und die Maus mit 70% Ethanol besprühen.
4. In der BSC, öffnen Sie eine sterile aseptisch Petrischale, aliquote 10 ml HBSS-FCS mit der Basis und 1 bis 2 ml auf den Deckel.
5. Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch mit dem Rücken nach oben und heben Sie die Haut um die Brust-Abschnitte mit den Fingern der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die Schere, um einen Einschnitt zu machen, wo die Haut angehoben wird.
6. Halten Sie sich an den beiden Enden des Schnittes, wobei ein Ende mit jeder Hand und vorsichtig auseinander ziehen die Haut um die Maus von der Rückseite in den Magen, fortzusetzen, bis zwei Enden des Einschnitts treffen, der an den Magen.
7. Drehen Sie die Maus auf Bauch nach oben und mit einer Hand ziehen Sie die untere Hälfte der Haut nach unten in Richtung Bein, halten die Haut zurückziehen, bis die Beine ausgesetzt sind.
8. Halten Sie den Fuß der Maus nach oben und schneiden Sie die Achillessehnen über dem Sprunggelenk unddie Bänder die Muskeln Verbindungs ​​am unteren Ende der Tibia mit einer Schere zu Fuss. Dies lockert den Fuß von den Beinknochen.
9. Während das Bein nach oben durch den Fuß, schneiden Sie die Muskeln und Bänder mit einer Schere alle um das Kniegelenk am unteren Ende des Oberschenkels die Oberschenkelmuskulatur aus dem unteren Bein zu trennen. Verwenden einer Pinzette vorsichtig gelockert Muskeln ziehen weg von der Fibula und Oberschenkel Oberflächen. Achten Sie darauf, nicht die Femoralarterie zu durchtrennen, schwere Blutungen zu vermeiden.
10. Mit der einen Hand auf den Fuß nach unten drücken offene Schere am oberen Ende des Oberschenkels im Hüftgelenk, drehen Sie das Bein und ziehen Sie vorsichtig den Oberschenkelknochen aus dem Hüftgelenk zu trennen, während die Schere mit dem letzten Schnitt zu frei zu machen das Bein aus dem Körper.
11. Von diesem Punkt an, halten nur das Gewebe mit einer sterilen Pinzette. Halten Sie an das Bein an einem Ende an und ziehen Sie den Fuß auf den anderen ab.
    HINWEIS: Dies sollte nicht viel Kraft erfordern, als Verbindungsbänder in Schritt geschnitten werden1.9. Alternativ dazu schneiden die Tibia knapp über dem Knöchel, wo der Knochen fusioniert ist.
12. Halten Sie das Bein durch das distale Ende des Femurs mit einem Satz Zangen und proximalen Ende der Tibia und Fibula mit einem anderen, biegen sorgfältig die Tibia und Fibula in die entgegengesetzte Richtung des Kniegelenks sie von Femur und Patella zu trennen.
13. Verwenden einer Pinzette, um die verbleibenden Bänder und Muskeln nach unten ziehen, noch an den Unterschenkelknochen befestigt. Hier, nehmen Sie die Fibel zusammen mit dem Bindegewebe mit einer Pinzette, da es zu klein ist, gespült werden für Knochenmarkzellen. Setzen Sie die gereinigte Tibia auf der invertierten Petrischale Deckel.
14. Halten Sie das untere Ende des Oberschenkels mit einem Satz von Zangen und der Patella mit einem anderen, biegen Sie die Patella und das umgebende Gewebe in die entgegengesetzte Richtung des Gelenks zur Entfernung. reinigen Dann Bindegewebe aus dem Oberschenkelknochen verbleibt; Ziehen sie mit einer Pinzette entfernt, und legen Sie es auf dem umgekehrten Schalendeckel Petri. Entsorgen Sie die Patella.
15. Wiederholen 1.7- 1.13 mit dem anderen Bein, wenn nötig. Übertragen Sie die Knochen auf 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem HBSS-FCS für den Transport, falls erforderlich.
16. Platzieren Knochen auf das invertierte Petrischale Deckel mit 1 bis 2 ml HBSS-FCS, verwenden Zange restliche Gewebe zu reinigen noch an der Tibia und Femur befestigt, dann übertragen die Knochen an der Basis der Petrischale mit 10 ml HBSS- FCS. Alternativ dazu können die Knochen reinigen und an Muskelgewebe entfernen, um eine 70% Ethanol getränkten Gewebe verwendet wird.
17. Schneiden Sie jede der Knochen in der Mitte mit einer Schere. Schild teilweise die Petrischale mit einem sterilen Deckel während des Schneidens die Knochen bleiben in der Schale zu gewährleisten. Alternativ schneiden das Ende jedes Knochenspülung in dem nächsten Schritt zu ermöglichen.
18. Bringen Sie die 26 ½ G-Nadel auf die 1-ml-Spritze und ziehen bis 1 ml HBSS-FCS aus der Petrischale. Legen Sie die Spitze der Nadel in das Ende eines Knochenstück und spülen Sie die Knochenmarkzellen (weichen roten Gewebe im Inneren der Knochensubstanz) aus. Führen Sie die Nadel in den Kopfdes Knochens und das offene Ende, bis das gesamte rot gefärbt ist Mark entfernt. Beachten Sie die Knochen, wie in der Farbe weiß.
19. Passieren sichtbare Klumpen von Knochenmark durch die Spritze mehrmals eine Einzelzellsuspension zu bilden.
20. Entsorgen Sie die gespülten Knochen. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette die Zellsuspension gut und Transfer zum Sammelröhrchen zu mischen. Spülen Sie die Petrischale einmal mit 5 ml HBSS-FCS Restzellen in der Schale zu sammeln. Legen Sie Zellen auf Eis.
    HINWEIS: Die Zellsuspension Knochenmark ist noch lebensfähig , wenn für 2 gespeichert - bei 4 ° C 3 Std.

2. Überzug und Kultivierung von Knochenmarkzellen (BMC)

1. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.
   1. Vorbereitung von roten Blutzellen (RBC) Lysepuffer, indem 0,84% Ammoniumchlorid in einer endgültigen Lösung von 2 mM Tris pH 7,2, sterilisieren dann durch Filtrieren durch einen 0,2-Mikron-Filter.
   2. Bereiten BMC Medien durch Zugabe von 10% FCS, 20 mM HEPES, 1x nicht-essentielle Aminosäure, 55 & #181; M 2-Mercaptoethanol, 50 U / ml Penicillin und Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, und 2 mM L-Glutamin RPMI Medium 1640.
   3. Erhalten kommerziell erhältlichen rekombinanten GM-CSF oder verwenden GM-CSF - Überstand aus AG8.653 Myelomzellen enthält , transfiziert mit dem GM-CSF - Gen ^20. Bestimmen Sie die Konzentration von GM-CSF in dem Überstand durch ELISA und fügen Sie das Äquivalent von 20 ng / ml auf den BMC-Medien.
2. Spin down die Knochenmarkszellen bei 314 × g für 5 min. Das Pellet ist rot, aufgrund RBCs. In der BSC, den Überstand aspirieren einer sterilen Pasteur-Glaspipette angebracht Saugen Vakuum, lösen Sie das Pellet durch Klopfen, dann wurden 10 ml Puffer RBC Lyse hinzufügen. Vortex um die Zellen zu resuspendieren und in RBC-Lyse-Puffer bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert.
3. 10 ml HBSS-FCS dann Zellen Spin bei 314 × g für 5 min und den Überstand aspirieren. Beachten Sie die Zellpellet als weiße Farbe. Die Zellen in gewünschte Volumen von BMC Medien.
4. Zählen Sie die resuspended-Zellen, die eine Zählkammer nach toten Zellen mit 0,4% Trypan-Blau-Färbung.
   HINWEIS: Wenn Knochenmark von einem Bein (Einzel Tibia und Femur) verwendet wird, Resuspendieren in 5 ml BMC Medien, nehmen 10 ul Zellsuspension und verdünnen Sie es mit 70 & mgr; l von 0,4% Trypanblau, gut mischen und Transfer 10 ul die 1/8 Zelle Verdünnung auf die Hemocytometer Kammer. Zählen der lebensfähigen Zellen in vier Quadranten: der Mittelwert der vier Quadranten Zählwerte x Verdünnungsfaktor x 10 ⁴ = Anzahl der Zellen pro ml. 4 x 10 ⁷ Zellen nach dem RBC - Lyse - einem Femur und einer Tibia von einem Bein wird etwa 2 allgemein ergeben.
5. Schätzung der Anzahl von 10 ml Speisen von Knochenmarkkulturen für nachgelagerte Experimente benötigt basierend auf der Anzahl der insgesamt für die Versuche benötigten Zellen am Ende der Kultur.
   HINWEIS: Jedes Gericht benötigt 2 x 10 ⁶ Knochenmarkzellen bei der ersten Aussaat und Ausbeuten von 5 bis 10 x 10 ⁶ Zellen am Tag 7.
   1. Aliquot die Gesamtzahl der Zellen zur Plattierung in ein neues Röhrchen, zentrifugieren bei 314 xg für 5 min, Überstand absaugen und resuspendieren Zellen bei 4 x 10 ⁶ Zellen / ml in BMC Medien.
6. Bereiten Sie eine neue sterile 100 mm x 15 mm Petrischale mit 9,5 ml BMC-Medium, das 200 ng GM-CSF (rekombinantes oder von GM-CSF enthaltende Überstand). Hinzufügen 500 ul der 4 x 10 ⁶ Zellen / ml Knochenmarkszellen in die Mitte der Petrischale für die Endkonzentration von 2 x 10 ⁵ Zellen / ml in 10 ml.
   HINWEIS: Es ist wichtig , eine sterile Petrischale nicht eine Gewebekulturschale zu verwenden. Auch wenn die Zellen die Zugabe sorgen Zellen in der Mitte konzentriert bleiben und minimieren Störung der Speisen nach dem Aussäen und während der Medienwechsel. Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO _2. Dies ist Tag 0 in der Kultur.
7. Am Tag 3, 10 ml frischem BMC Medien zu jeder Schale von Zellen, die 200 ng GM-CSF hinzuzufügen. Achten Sie darauf, Störung o zu minimierenf die in Suspension konzentriert Zellen. Das Gesamtvolumen der Zellkultur ist jetzt 20 ml.
8. Beobachten Zellen unter dem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Beachten Sie zahlreiche nicht-haftenden Zellen (rund) und ein paar anhaftenden Zellen (flach). Zellen in Gruppen von drei oder vier ähnlich Blütenblätter einer Blume zu sehen ist, die Proliferation anzeigt.
9. Am 6. Tag eine halbe Medienwechsel durchführen. Entfernen Sie vorsichtig 10 ml Medium in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen, Spin bei 314 · g nach unten für 5 min, absaugen und den Überstand verwerfen.
10. Zellpellet in 10 ml frischem BMC Medien 20 ng / ml GM-CSF enthält, sanft Wirbel und zu der ursprünglichen Zellkulturschale mit einem Gesamtvolumen von 20 ml. Beachten Zellen unter dem Mikroskop.
    HINWEIS: Tag 7 Kultur sollte mit anhaftender flachen Zellen und dichte Wolken von runden nicht adhärenten Zellen bei 70% oder mehr in Konfluenz sein.

3. Sammeln und Vorbereiten BMDC und BMDMs für die Durchflusszytometrie

1. Halten Sie alle Puffer bei 4 ° C.
2. Ernten Sie die Zellen von Tag 7 bis Tag 10. Um die Zellen zu ernten erste Transfer 10 ml des Kulturüberstand zu einem 50 ml konischen Sammelröhrchen, dann kippen die Schale vertikal um ca. 30 Grad und waschen Sie die Schale pipettiert, die restlichen 10 ml der Kultur von der Spitze der Schale. Wiederholen Sie diese Wäsche 5 Mal, jedes Mal Drehen der Schale um ein Drittel.
3. Übertragen Sie die restlichen 10 ml der Zellen auf die gleiche Sammelröhrchen und entsorgen Sie die Platte und anhaftenden Zellen.
   HINWEIS: Die Waschungen werden entfernen nicht haftenden und lose anhaftenden Zellen; die flachen adhärente Zellen sind resistent gegen den Wäschen. Typischerweise von 5 - 10 x 10 ⁶ nicht-adhärenten Zellen werden von einer Platte am Tag erwartet 7 und 2 bis 5 x 10 ⁶ Zellen am Tag 10, obwohl Lutz et al. berichtet 10 x 10 ⁶ Zellen am Tag 10. Die anhaftenden Zellen werden nicht aufgenommen. müssen jedoch, wenn diese Zellen auf die nicht-adhärenten Zellen im Vergleich zuKönnen sie wie folgt entfernt werden. 5 ml 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 auf die Schale, nachdem die nicht-anhaftenden Zellen entfernt, bei 37 ° C für 5 min, einer Pipette auf und ab um die adhärenten Zellen zu entfernen, und in einem separaten Röhrchen sammeln.
4. Spin down die gesammelten Zellen bei 314 xg für 5 min und den Überstand aspirieren. Resuspendieren in 5 ml sterile BMC Medien bei 4 ° C, Wirbel sanft zu mischen, und zählen Trypanblau und Zählkammer.
   HINWEIS: Jedes Gericht wird 5 ergeben - 10 x 10 ⁶ nicht-adhärenten Zellen von einem Tag 7 Kultur. Von nun alle Schritte bei 4 ° C durchzuführen.
5. Für Durchflußzytometrie - Analyse, Übertragung 2 x 10 ⁵ Zellen für jede Probe in 5 ml Polystyrol - Rundbodenröhrchen, fügen 300 ul FACS - Puffer bei 4 ° C (1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 2 mM EDTA und 2% Rinderserumalbumin) zu jedem Sample.
6. Spin-Zellen bei 314 xg für 5 min nach unten und den Überstand aspirieren. Beobachten Sie eine sichtbare weiße, undurchsichtige Pellet bei derBoden des Röhrchens.
7. Die Zellen in 100 ul unmarkierten Fc-Rezeptor zu blockieren Ab Fc-Rezeptor-Bindung (Verwendung 1/10 Überstand von 2.4G2 produzierenden Myelom-Zelllinie) und bei 4 ° C für 20 min inkubiert. Dann fügen Sie 300 ul FACS-Puffer zu jeder Probe, sanft Wirbel, dann Zellen des Abschaltens bei 314 × g für 5 min und der Überstand absaugen.
8. Die Zellen in 100 & mgr; l CD11c-PeCy7 bei 0,2 & mgr; g / ml, Gr1-Pacific Blue bei 0,25 & mgr; g / ml, MHCII-APC bei 0,05 & mgr; g / ml, und FL-HA bei etwa 2 ug / ml Makrophagen und DCs zu identifizieren.
   HINWEIS: FL-HA wurde im Haus unter Verwendung von Fluorescein und Hahnenkamm Hyaluronsäure - Natriumsalz hergestellt , wie zuvor beschrieben ^21.
9. Inkubieren für 20 min bei 4 ° C Bindung an die Zelloberfläche zu ermöglichen. In 300 ul FACS - Puffer zu jeder Probe, sanft Wirbel, dann Zellen des Abschaltens bei 314 × g für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand aspirieren . HINWEIS: Wenn Biotinylated Antikörper in 3.8 verwendet werden, wiederholen 3,8-9 mit fluoreszenz Streptavidin.
10. Wash-Zellen mit einem anderen 300 ul FACS-Puffer, sanft Wirbel zu mischen und drehen Sie die Zellen bei 314 xg für 5 min nach unten. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Zellen in 200 & mgr; l FACS-Puffer, enthaltend von 0,1 bis 0,2 ug pro ml Propidiumiodid oder DAPI nonviable Zellen zu markieren. Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie - Analyse ^22.
    HINWEIS: Siehe Ergebnisse und Abbildung 3 für weitere Details der Populationen und wie wurden die Zellen gated.

Ergebnisse

Ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens zusammenfassend in 1 dargestellt ist. Die Dichte und die Morphologie der Kultur Knochenmark zu verschiedenen Zeiten der Kultur sind in Abbildung 2 dargestellt. Am Tag 1 werden die Zellen klein und einfach , aber für Tag 3, gibt es mehr Zellen, einige sind größer und einige haben anhaften begonnen. Am Tag 6 gibt es eine eindeutige adhärenten und nicht adhärenten Fraktion (2A). 1...

Diskussion

In diesem Manuskript, stellen wir ein Verfahren zur Erzeugung von GM-CSF Makrophagen und DCs aus einem einzigen Maus - Knochenmarkkultur , die von Lutz angepasst ist , et al. ^6. MHCII Expression und FL-HA unterscheidet zwischen unreifen DCs und Makrophagen in dieser Kultur - Bindung (siehe 3C), die bisher schwierig war. Dies, zusammen mit einem anderen Bericht von Helft et al. ¹⁹ zeigt die Heterogenität innerhalb GM-CSF induzierten BMDC Kulturen , die bisher angen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Durchflusszytometer	BD	LSR-II
Automatisiertes Inverses Mikroskop	Leica	DMI4000 B
Zentrifuge	Thermo Fisher	ST-40R
Biosicherheitswerkbank	Nuaire	NU-425-600
Spritze 1 ml	BD	309659
26 1/2 Gauge Nadel	BD	305111
50 ml konisches Röhrchen	Corning	357070	*Eppendorf Röhrchen der Marke Falcon
(1,5 ml)	Corning	MCT-150-C
5 ml Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden	Corning	352052
Sezierwerkzeuge	Fine Science Tools	*Verschiedene	*Präparierschere, Dumont-Pinzette und Standard-Pinzette;
Hämozytometer	Reichert	1490
Steril 100 mm x 15 mm Petrischale	Corning	351029	*Falcon Marke
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21985-023
Ammoniumchlorid	BDH	BDH0208-500G
Rinderserum Albumin	Fisher Bioreagenzien	BP1600-1
Brefeldin A	Sigma	B7651-5MG
EDTA	Sigma	E5134-1KG	Ethylendiamintetraessigsäure
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher	16000-044
Hank's ausgewogene Salzlösung	Thermo Fisher	14175-095
HEPES	Thermo Fisher	15630-080	4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure
L-Glutamin		Sigma G8540-100G
LPS Ultrapure	Invivogen	tlrl-3pelps
MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung	Thermo Fisher	11140-050
Penicillin/Streptomycin 100x	Thermo Fisher	15140-122
Kaliumphosphat monobasisch	BDH	BDH0268-500G
Kaliumchlorid	BDH	BDH9258-500G
rekombinant GM-CSF	Peprotech	315-03-A
Hahnenkamm Natriumhyaluronat	Sigma	H5388-1G	*Wird zur Herstellung von fluoreszeiniertem Hyaluronan
RPMI-1640	Thermo Fisher	21870-076	Kein Natriumpyruvat, kein Glutamin. Warme Medien auf 37  ° C vor dem Gebrauch.
Natriumchlorid	Fischer	5271-10
Natriumphosphat Dibasisch	Sigma	50876-1Kg
Natriumpyruvat	Sigma	P5290-100G
Tris(hydroxymethyl)aminomethan	Fisher Bioreagents	BP152-5
Trypanblau	Sigma	T8154
Anti-Fc-Rezeptor (unmarkiert), Gewebekulturüberstand	N/A	N/A	Klon: 2.4G2
Anti-CD11c PeCy7	eBioscience	25-0114-82	Klon: N418
Anti-Gr-1 efluor450	eBioscience	48-5931-82	Klon: RB6-8C5
Anti-MHCII APC	eBioscience	17-5321-82	Klon: M5/114.15.2
Biotinyliertes Anti-MerTK	Abcam	BAF591	polyklonales IgG-IgG aus Ziege
PE	eBioscience	12-4317-87
Propidiumiodid	Sigma	P4170-25MG
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol)	Sigma	D9542-5MG