Name: Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung und Unterscheidung von alveolären Makrophagen und dendritischen Zellen aus Mäuseknochenmark mit GM-CSF. Diese Methode liefert ausreichende Zellzahlen für immunologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) (Zuschuss MOP-119503) und der Naturwissenschaften und Engineering Council of Canada (NSERC) gefördert. NSERC unterstützt Sommer studentships auch YD und AA YD wird von der University of British Columbia (UBC) mit einem 4-Jahres-Stipendium Auszeichnung unterstützt, AA durch CIHR mit ein Student Master-Auszeichnung (CGS-M) unterstützt. Wir danken Calvin Roskelley für die Unterstützung mit dem Mikroskop die Bilder in Abbildung 2 zu erzeugen , verwendet. Wir erkennen auch die Unterstützung der UBC Tier- und Durchflusszytometrie Einrichtungen.

Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitlinien für ethische Tierforschung von Verfahren, die von der University of British Columbia Animal Care Committee genehmigt eingeschläfert. 1. Der Erwerb einer einzelnen Zelle Knochenmark-Suspension von Maus Femur und Tibia <ol><li> Schalten Sie einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) 15 Minuten vor dem Beginn des Verfahrens Schrank Luft zu reinigen und ermöglichen eine Luftströmung Stabilisierung, dann reinigen / Spray BSC Oberfläche mit 70% Ethanol. Halten alles so steril wie möglich für die Gesamtheit des Protokolls. Schneiden Sie nicht die Knochen unter nicht sterilen Bedingungen. </li><li> Vorbereitung Dissektionswerkzeuge von in 70% Ethanol (1 Paar Dissektion Schere, 2 Paar Pinzetten) Einweichen Hanks Balanced Salt Solution mit 5% fötalem Kälberserum (HBSS-FCS), sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm), 1 ml Spritzen, 26 ½ Gauge-Nadeln, konischen Sammelröhrchen (15 ml oder 50 ml) und Papiertücher in der BSC. </li><li> Euthanize mit der MausProtokolle, die von der Institution Tierforschung Ethikkommission genehmigt. Bringen Sie in die BSC, legen oben auf ein oder zwei Papiertücher und die Maus mit 70% Ethanol besprühen. </li><li> In der BSC, öffnen Sie eine sterile aseptisch Petrischale, aliquote 10 ml HBSS-FCS mit der Basis und 1 bis 2 ml auf den Deckel. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch mit dem Rücken nach oben und heben Sie die Haut um die Brust-Abschnitte mit den Fingern der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die Schere, um einen Einschnitt zu machen, wo die Haut angehoben wird. </li><li> Halten Sie sich an den beiden Enden des Schnittes, wobei ein Ende mit jeder Hand und vorsichtig auseinander ziehen die Haut um die Maus von der Rückseite in den Magen, fortzusetzen, bis zwei Enden des Einschnitts treffen, der an den Magen. </li><li> Drehen Sie die Maus auf Bauch nach oben und mit einer Hand ziehen Sie die untere Hälfte der Haut nach unten in Richtung Bein, halten die Haut zurückziehen, bis die Beine ausgesetzt sind. </li><li> Halten Sie den Fuß der Maus nach oben und schneiden Sie die Achillessehnen über dem Sprunggelenk unddie Bänder die Muskeln Verbindungs ​​am unteren Ende der Tibia mit einer Schere zu Fuss. Dies lockert den Fuß von den Beinknochen. </li><li> Während das Bein nach oben durch den Fuß, schneiden Sie die Muskeln und Bänder mit einer Schere alle um das Kniegelenk am unteren Ende des Oberschenkels die Oberschenkelmuskulatur aus dem unteren Bein zu trennen. Verwenden einer Pinzette vorsichtig gelockert Muskeln ziehen weg von der Fibula und Oberschenkel Oberflächen. Achten Sie darauf, nicht die Femoralarterie zu durchtrennen, schwere Blutungen zu vermeiden. </li><li> Mit der einen Hand auf den Fuß nach unten drücken offene Schere am oberen Ende des Oberschenkels im Hüftgelenk, drehen Sie das Bein und ziehen Sie vorsichtig den Oberschenkelknochen aus dem Hüftgelenk zu trennen, während die Schere mit dem letzten Schnitt zu frei zu machen das Bein aus dem Körper. </li><li> Von diesem Punkt an, halten nur das Gewebe mit einer sterilen Pinzette. Halten Sie an das Bein an einem Ende an und ziehen Sie den Fuß auf den anderen ab. HINWEIS: Dies sollte nicht viel Kraft erfordern, als Verbindungsbänder in Schritt geschnitten werden1.9. Alternativ dazu schneiden die Tibia knapp über dem Knöchel, wo der Knochen fusioniert ist. </li><li> Halten Sie das Bein durch das distale Ende des Femurs mit einem Satz Zangen und proximalen Ende der Tibia und Fibula mit einem anderen, biegen sorgfältig die Tibia und Fibula in die entgegengesetzte Richtung des Kniegelenks sie von Femur und Patella zu trennen. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die verbleibenden Bänder und Muskeln nach unten ziehen, noch an den Unterschenkelknochen befestigt. Hier, nehmen Sie die Fibel zusammen mit dem Bindegewebe mit einer Pinzette, da es zu klein ist, gespült werden für Knochenmarkzellen. Setzen Sie die gereinigte Tibia auf der invertierten Petrischale Deckel. </li><li> Halten Sie das untere Ende des Oberschenkels mit einem Satz von Zangen und der Patella mit einem anderen, biegen Sie die Patella und das umgebende Gewebe in die entgegengesetzte Richtung des Gelenks zur Entfernung. reinigen Dann Bindegewebe aus dem Oberschenkelknochen verbleibt; Ziehen sie mit einer Pinzette entfernt, und legen Sie es auf dem umgekehrten Schalendeckel Petri. Entsorgen Sie die Patella. </li><li> Wiederholen 1.7- 1.13 mit dem anderen Bein, wenn nötig. Übertragen Sie die Knochen auf 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem HBSS-FCS für den Transport, falls erforderlich. </li><li> Platzieren Knochen auf das invertierte Petrischale Deckel mit 1 bis 2 ml HBSS-FCS, verwenden Zange restliche Gewebe zu reinigen noch an der Tibia und Femur befestigt, dann übertragen die Knochen an der Basis der Petrischale mit 10 ml HBSS- FCS. Alternativ dazu können die Knochen reinigen und an Muskelgewebe entfernen, um eine 70% Ethanol getränkten Gewebe verwendet wird. </li><li> Schneiden Sie jede der Knochen in der Mitte mit einer Schere. Schild teilweise die Petrischale mit einem sterilen Deckel während des Schneidens die Knochen bleiben in der Schale zu gewährleisten. Alternativ schneiden das Ende jedes Knochenspülung in dem nächsten Schritt zu ermöglichen. </li><li> Bringen Sie die 26 ½ G-Nadel auf die 1-ml-Spritze und ziehen bis 1 ml HBSS-FCS aus der Petrischale. Legen Sie die Spitze der Nadel in das Ende eines Knochenstück und spülen Sie die Knochenmarkzellen (weichen roten Gewebe im Inneren der Knochensubstanz) aus. Führen Sie die Nadel in den Kopfdes Knochens und das offene Ende, bis das gesamte rot gefärbt ist Mark entfernt. Beachten Sie die Knochen, wie in der Farbe weiß. </li><li> Passieren sichtbare Klumpen von Knochenmark durch die Spritze mehrmals eine Einzelzellsuspension zu bilden. </li><li> Entsorgen Sie die gespülten Knochen. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette die Zellsuspension gut und Transfer zum Sammelröhrchen zu mischen. Spülen Sie die Petrischale einmal mit 5 ml HBSS-FCS Restzellen in der Schale zu sammeln. Legen Sie Zellen auf Eis. HINWEIS: Die Zellsuspension Knochenmark ist noch lebensfähig , wenn für 2 gespeichert - bei 4 ° C 3 Std. </li></ol> 2. Überzug und Kultivierung von Knochenmarkzellen (BMC) <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. <ol><li> Vorbereitung von roten Blutzellen (RBC) Lysepuffer, indem 0,84% Ammoniumchlorid in einer endgültigen Lösung von 2 mM Tris pH 7,2, sterilisieren dann durch Filtrieren durch einen 0,2-Mikron-Filter. </li><li> Bereiten BMC Medien durch Zugabe von 10% FCS, 20 mM HEPES, 1x nicht-essentielle Aminosäure, 55 &amp; #181; M 2-Mercaptoethanol, 50 U / ml Penicillin und Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, und 2 mM L-Glutamin RPMI Medium 1640. </li><li> Erhalten kommerziell erhältlichen rekombinanten GM-CSF oder verwenden GM-CSF - Überstand aus AG8.653 Myelomzellen enthält , transfiziert mit dem GM-CSF - Gen 20. Bestimmen Sie die Konzentration von GM-CSF in dem Überstand durch ELISA und fügen Sie das Äquivalent von 20 ng / ml auf den BMC-Medien. </li></ol></li><li> Spin down die Knochenmarkszellen bei 314 × g für 5 min. Das Pellet ist rot, aufgrund RBCs. In der BSC, den Überstand aspirieren einer sterilen Pasteur-Glaspipette angebracht Saugen Vakuum, lösen Sie das Pellet durch Klopfen, dann wurden 10 ml Puffer RBC Lyse hinzufügen. Vortex um die Zellen zu resuspendieren und in RBC-Lyse-Puffer bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. </li><li> 10 ml HBSS-FCS dann Zellen Spin bei 314 × g für 5 min und den Überstand aspirieren. Beachten Sie die Zellpellet als weiße Farbe. Die Zellen in gewünschte Volumen von BMC Medien. </li><li> Zählen Sie die resuspended-Zellen, die eine Zählkammer nach toten Zellen mit 0,4% Trypan-Blau-Färbung. HINWEIS: Wenn Knochenmark von einem Bein (Einzel Tibia und Femur) verwendet wird, Resuspendieren in 5 ml BMC Medien, nehmen 10 ul Zellsuspension und verdünnen Sie es mit 70 &amp; mgr; l von 0,4% Trypanblau, gut mischen und Transfer 10 ul die 1/8 Zelle Verdünnung auf die Hemocytometer Kammer. Zählen der lebensfähigen Zellen in vier Quadranten: der Mittelwert der vier Quadranten Zählwerte x Verdünnungsfaktor x 10 4 = Anzahl der Zellen pro ml. 4 x 10 7 Zellen nach dem RBC - Lyse - einem Femur und einer Tibia von einem Bein wird etwa 2 allgemein ergeben. </li><li> Schätzung der Anzahl von 10 ml Speisen von Knochenmarkkulturen für nachgelagerte Experimente benötigt basierend auf der Anzahl der insgesamt für die Versuche benötigten Zellen am Ende der Kultur. HINWEIS: Jedes Gericht benötigt 2 x 10 6 Knochenmarkzellen bei der ersten Aussaat und Ausbeuten von 5 bis 10 x 10 6 Zellen am Tag 7. <ol><li> Aliquot die Gesamtzahl der Zellen zur Plattierung in ein neues Röhrchen, zentrifugieren bei 314 xg für 5 min, Überstand absaugen und resuspendieren Zellen bei 4 x 10 6 Zellen / ml in BMC Medien. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine neue sterile 100 mm x 15 mm Petrischale mit 9,5 ml BMC-Medium, das 200 ng GM-CSF (rekombinantes oder von GM-CSF enthaltende Überstand). Hinzufügen 500 ul der 4 x 10 6 Zellen / ml Knochenmarkszellen in die Mitte der Petrischale für die Endkonzentration von 2 x 10 5 Zellen / ml in 10 ml. HINWEIS: Es ist wichtig , eine sterile Petrischale nicht eine Gewebekulturschale zu verwenden. Auch wenn die Zellen die Zugabe sorgen Zellen in der Mitte konzentriert bleiben und minimieren Störung der Speisen nach dem Aussäen und während der Medienwechsel. Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Dies ist Tag 0 in der Kultur. </li><li> Am Tag 3, 10 ml frischem BMC Medien zu jeder Schale von Zellen, die 200 ng GM-CSF hinzuzufügen. Achten Sie darauf, Störung o zu minimierenf die in Suspension konzentriert Zellen. Das Gesamtvolumen der Zellkultur ist jetzt 20 ml. </li><li> Beobachten Zellen unter dem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Beachten Sie zahlreiche nicht-haftenden Zellen (rund) und ein paar anhaftenden Zellen (flach). Zellen in Gruppen von drei oder vier ähnlich Blütenblätter einer Blume zu sehen ist, die Proliferation anzeigt. </li><li> Am 6. Tag eine halbe Medienwechsel durchführen. Entfernen Sie vorsichtig 10 ml Medium in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen, Spin bei 314 · g nach unten für 5 min, absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 10 ml frischem BMC Medien 20 ng / ml GM-CSF enthält, sanft Wirbel und zu der ursprünglichen Zellkulturschale mit einem Gesamtvolumen von 20 ml. Beachten Zellen unter dem Mikroskop. HINWEIS: Tag 7 Kultur sollte mit anhaftender flachen Zellen und dichte Wolken von runden nicht adhärenten Zellen bei 70% oder mehr in Konfluenz sein. </li></ol> 3. Sammeln und Vorbereiten BMDC und BMDMs für die Durchflusszytometrie <ol> &lt;li&gt; Halten Sie alle Puffer bei 4 ° C. </li><li> Ernten Sie die Zellen von Tag 7 bis Tag 10. Um die Zellen zu ernten erste Transfer 10 ml des Kulturüberstand zu einem 50 ml konischen Sammelröhrchen, dann kippen die Schale vertikal um ca. 30 Grad und waschen Sie die Schale pipettiert, die restlichen 10 ml der Kultur von der Spitze der Schale. Wiederholen Sie diese Wäsche 5 Mal, jedes Mal Drehen der Schale um ein Drittel. </li><li> Übertragen Sie die restlichen 10 ml der Zellen auf die gleiche Sammelröhrchen und entsorgen Sie die Platte und anhaftenden Zellen. HINWEIS: Die Waschungen werden entfernen nicht haftenden und lose anhaftenden Zellen; die flachen adhärente Zellen sind resistent gegen den Wäschen. Typischerweise von 5 - 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen werden von einer Platte am Tag erwartet 7 und 2 bis 5 x 10 6 Zellen am Tag 10, obwohl Lutz et al. berichtet 10 x 10 6 Zellen am Tag 10. Die anhaftenden Zellen werden nicht aufgenommen. müssen jedoch, wenn diese Zellen auf die nicht-adhärenten Zellen im Vergleich zuKönnen sie wie folgt entfernt werden. 5 ml 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 auf die Schale, nachdem die nicht-anhaftenden Zellen entfernt, bei 37 ° C für 5 min, einer Pipette auf und ab um die adhärenten Zellen zu entfernen, und in einem separaten Röhrchen sammeln. </li><li> Spin down die gesammelten Zellen bei 314 xg für 5 min und den Überstand aspirieren. Resuspendieren in 5 ml sterile BMC Medien bei 4 ° C, Wirbel sanft zu mischen, und zählen Trypanblau und Zählkammer. HINWEIS: Jedes Gericht wird 5 ergeben - 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen von einem Tag 7 Kultur. Von nun alle Schritte bei 4 ° C durchzuführen. </li><li> Für Durchflußzytometrie - Analyse, Übertragung 2 x 10 5 Zellen für jede Probe in 5 ml Polystyrol - Rundbodenröhrchen, fügen 300 ul FACS - Puffer bei 4 ° C (1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 2 mM EDTA und 2% Rinderserumalbumin) zu jedem Sample. </li><li> Spin-Zellen bei 314 xg für 5 min nach unten und den Überstand aspirieren. Beobachten Sie eine sichtbare weiße, undurchsichtige Pellet bei derBoden des Röhrchens. </li><li> Die Zellen in 100 ul unmarkierten Fc-Rezeptor zu blockieren Ab Fc-Rezeptor-Bindung (Verwendung 1/10 Überstand von 2.4G2 produzierenden Myelom-Zelllinie) und bei 4 ° C für 20 min inkubiert. Dann fügen Sie 300 ul FACS-Puffer zu jeder Probe, sanft Wirbel, dann Zellen des Abschaltens bei 314 × g für 5 min und der Überstand absaugen. </li><li> Die Zellen in 100 &amp; mgr; l CD11c-PeCy7 bei 0,2 &amp; mgr; g / ml, Gr1-Pacific Blue bei 0,25 &amp; mgr; g / ml, MHCII-APC bei 0,05 &amp; mgr; g / ml, und FL-HA bei etwa 2 ug / ml Makrophagen und DCs zu identifizieren. HINWEIS: FL-HA wurde im Haus unter Verwendung von Fluorescein und Hahnenkamm Hyaluronsäure - Natriumsalz hergestellt , wie zuvor beschrieben 21. </li><li> Inkubieren für 20 min bei 4 ° C Bindung an die Zelloberfläche zu ermöglichen. In 300 ul FACS - Puffer zu jeder Probe, sanft Wirbel, dann Zellen des Abschaltens bei 314 × g für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand aspirieren . HINWEIS: Wenn Biotinylated Antikörper in 3.8 verwendet werden, wiederholen 3,8-9 mit fluoreszenz Streptavidin. </li><li> Wash-Zellen mit einem anderen 300 ul FACS-Puffer, sanft Wirbel zu mischen und drehen Sie die Zellen bei 314 xg für 5 min nach unten. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Zellen in 200 &amp; mgr; l FACS-Puffer, enthaltend von 0,1 bis 0,2 ug pro ml Propidiumiodid oder DAPI nonviable Zellen zu markieren. Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie - Analyse 22. HINWEIS: Siehe Ergebnisse und Abbildung 3 für weitere Details der Populationen und wie wurden die Zellen gated. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

In diesem Manuskript, stellen wir ein Verfahren zur Erzeugung von GM-CSF Makrophagen und DCs aus einem einzigen Maus - Knochenmarkkultur , die von Lutz angepasst ist , et al. 6. MHCII Expression und FL-HA unterscheidet zwischen unreifen DCs und Makrophagen in dieser Kultur - Bindung (siehe 3C), die bisher schwierig war. Dies, zusammen mit einem anderen Bericht von Helft et al. 19 zeigt die Heterogenität innerhalb GM-CSF induzierten BMDC Kulturen , die bisher angen...

Mehrere in vitro Kulturverfahren beschrieben wurden Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark stammenden DCs (BMDCs) unter Verwendung eines oder einer Kombination von Wachstumsfaktoren zu erzeugen. BMDMs kann durch Züchten Knochenmarkszellen erzeugt werden unter Verwendung von entweder Makrophagen - Kolonie - stimulierender Faktor (M-CSF) oder GM-CSF 1,2. Für BMDCs gibt die Zugabe von FLT3 - Ligand an der Knochenmarkkultur zu nicht-haft klassischen und plasmazytoiden DCs (CD11c hoch / MHCII hoch und CD11c lo, B220 + beziehungsweise) nach 9 Tagen in Kultur 3,4. Im Gegensatz dazu nicht adhärenten nach 7 bis 10 Tagen in Kultur erzeugt Zellen mit GM-CSF allein 5,6, GM-CSF und IL-4 7 oder GM-CSF und FLT3 - Ligand 8,9 erzeugen BMDCs mehr ähnelt entzündliche DCs (CD11c hoch, MHCII hohe CD11b +) 10. Obwohl diese in vitro Kulturen werden verwendet , Makrophagen zu erzeugen oderDCs, es ist unklar, ob jede Kultur Anlass zu reinen Populationen gibt. Obwohl beispielsweise adhärente Zellen in den GM-CSF - Kulturen beschrieben Makrophagen 5, die nicht-adhärenten Zellen aus der gleichen Kultur zu sein als DCs 6,11-13, mit der Annahme verwendet , dass sie homogen und jede beobachtete Variabilität sind, aufgrund unterschiedlicher Entwicklungsstadien 14,15. Darüber hinaus haben Studien GM-CSF in vivo gefunden 16,17, ein wesentlicher Wachstumsfaktor für Alveolarmakrophagen Entwicklung zu sein und kann in vitro verwendet werden alveolären Makrophagen-ähnliche 16,17,18 zu erzeugen. Anders als die Einhaltung sind die Verfahren für Makrophagen und DCs von GM-CSF behandelt Knochenmarkkulturen zu erzeugen sehr ähnliche Heterogenität was darauf hindeutet, innerhalb GM-CSF Knochenmarkkulturen existieren können. Dies scheint auch der Fall zu sein, da zwei Papiere des Vorhandenseins von BMDMs in der nicht-haftenden Fraktion von BMDC Kulturen berichten. In einem Papier, sie identified eine Population von Zellen CD11c +, CD11b +, MHCII mid, MerTK + und CD115 +, der eine Genexpression Signatur ausgedrückt, die am ehesten Alveolarmakrophagen und hatte eine reduzierte Fähigkeit glich zu aktivieren 19 T - Zellen. Das zweite Papier verwendet MHCII und FL-HA eine Alveolarmakrophage artigen Population (CD11c +, MHCII mid / niedrig, FL-HA hoch) zu identifizieren , die von unreifen (CD11c +, MHCII Mitte, FL-HA niedrig) und reifen unterschied DCs (CD11c +, MHCII hoch), die beide phänotypisch und funktionell 18. Diese Papiere zeigen beide, dass GM-CSF BMDC Kulturen heterogen sind, sowohl Makrophagen und DC-Populationen enthalten, die Versorgung angibt, sollten getroffen werden, wenn Daten aus BMDC Kulturen zu interpretieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie Knochenmark, Kultur Knochenmarkzellen in-GM-CSF zu isolieren und zu identifizieren, die Alveolarmakrophage artigenBindung und MHCII Ausdruck Bevölkerung aus den unreifen und reifen DCs im Knochenmarkkultur mittels Durchflusszytometrie FL-HA verwenden. Dieses Verfahren wird auf dem etablierten Verfahren von Lutz et al basierend 6 und 5 in der Lage , zu erzeugen -. 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen am Tag 7 einer 10 ml Kultur. Die Kultur ist verwendbar von den Tagen 7 bis 10 und ergibt eine heterogene Population von Makrophagen, unreifen und reifen DCs, sowie einige Progenitoren am Tag 7. Dies stellt eine einfache Methode zu wachsen und in vitro alveolären Makrophagen-ähnliche in großen Mengen zu isolieren.

<table><tbody><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD&nbsp;</td><td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>Automatisiertes Inverses Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 1/2 Gauge Nadel</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konisches Röhrchen&nbsp;</td><td>Corning</td><td>357070</td><td>*Eppendorf Röhrchen der Marke Falcon</td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Sezierwerkzeuge</td><td>Fine Science Tools</td><td>*Verschiedene&nbsp;</td><td>*Präparierschere, Dumont-Pinzette und Standard-Pinzette;</td></tr><tr><td>Hämozytometer&nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Steril 100 mm x 15 mm Petrischale</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>*Falcon Marke</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Fisher Bioreagenzien</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hank's ausgewogene Salzlösung</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td></td><td>Sigma G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>rekombinant GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Hahnenkamm Natriumhyaluronat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td><td>*Wird zur Herstellung von fluoreszeiniertem Hyaluronan</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>Kein Natriumpyruvat, kein Glutamin. Warme Medien auf 37&nbsp; &#176; C vor dem Gebrauch.</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>5271-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat Dibasisch</td><td>Sigma</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fc-Rezeptor (unmarkiert), Gewebekulturüberstand</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Klon: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Klon: N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Klon: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Klon: M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>polyklonales IgG-IgG aus Ziege</td></tr><tr><td>PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol)</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung und identifizierung von gm-csf abgeleitet alveolare ähnlichen makrophagen und dendritische zellen aus knochenmark der maus

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Makrophagen und dendritischen Zellen (DCs) sind angeborene Immun in Geweben und lymphatischen Organen gefunden Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern spielen. Sie sind jedoch schwierig in ausreichender Zahl zu isolieren , sie im Detail zu studieren, also in vitro - Modelle entwickelt wurden. In vitro - Kulturen von Knochenmark stammenden Makrophagen und dendritische Zellen sind gut etabliert und wertvolle Methoden zum immunologischen Studien. Hier wird ein Verfahren zur Kultivierung und beide DCs und Makrophagen aus einer einzigen Kultur primärer Maus-Knochenmarkszellen zu identifizieren mit der Cytokin Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) beschrieben. Dieses Protokoll basiert auf dem etablierten Verfahren zuerst von Lutz et al entwickelt. im Jahr 1999 für die Knochenmark abgeleiteten DCs. Die Kultur ist heterogen, und MHCII und fluoresceinierten Hyaluron (FL-HA) verwendet Makrophagen von unreifen und reifen DCs zu unterscheiden. Diese GM-CSF Makrophagen provide eine bequeme Quelle für in - vitro - Makrophagen , die eng Alveolarmakrophagen in beiden Phänotyp und Funktion ähneln.

Ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens zusammenfassend in 1 dargestellt ist. Die Dichte und die Morphologie der Kultur Knochenmark zu verschiedenen Zeiten der Kultur sind in Abbildung 2 dargestellt. Am Tag 1 werden die Zellen klein und einfach , aber für Tag 3, gibt es mehr Zellen, einige sind größer und einige haben anhaften begonnen. Am Tag 6 gibt es eine eindeutige adhärenten und nicht adhärenten Fraktion (2A). 1...

Knochenmarkzellen, die mit dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) kultiviert wurden, erzeugen eine heterogene Kultur, die Makrophagen und dendritische Zellen (DCs) enthält. Diese Methode konzentriert sich auf die Verwendung von MHCII- und Hyaluronan (HA)-Bindung zur Unterscheidung von Makrophagen von den DCs in der GM-CSF-Kultur. Makrophagen in dieser Kultur haben viele Ähnlichkeiten mit Alveolarmakrophagen.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, alveoläre Makrophagen-ähnliche Zellen von dendritischen Zellen in murinen Knochenmarkkulturen in vitro zu erzeugen und zu unterscheiden, die mit GM-CSF ergänzt wurden. Diese In-vitro-Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Funktion dendritischer Zellen oder Makrophagen zu beantworten. Der Hauptvorteil der Technik liegt darin, dass sie ausreichende Zellzahlen erzeugen kann und zwischen dendritischen Zellen und alveolären Makrophagen-ähnlichen Zellen differenzieren kann.Die Auswirkungen dieser Technik könnten sich auf die Therapie der pulmonalen Proteinose erstrecken, da sie die Gewinnung alveolärer Makrophagen ermöglicht, die zur Behandlung dieser Erkrankung eingesetzt werden können. In der Regel benötigen Personen, die neu in dieser Methode sind, Übung beim Isolieren der gereinigten Knochen und beim Ausspülen des Knochenmarks. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da nicht alle verwendeten Techniken allein durch schriftliche Anweisungen leicht verständlich sind.15 Minuten vor Beginn der Dissektion ein biologisches Sicherheitswerkbank einschalten, um die Luft in der Werkbank zu reinigen und den Luftstrom zu stabilisieren, und die Oberfläche der Werkbank mit 70 % Ethanol säubern. Wenn die Werkbank bereit ist, eine Maus in Bauchlage auf ein bis zwei Papiertücher legen und das Tier mit 70 % Ethanol besprühen. Anschließend mit der nicht-dominanten Hand die Haut im Brustbereich anheben und mit einer Schere einen Schnitt durchführen.Greifen Sie beide Enden des Schnitts und ziehen Sie vorsichtig, bis die beiden Enden des Schnitts am Magen zusammentreffen. Bringen Sie dann die Maus in Rückenlage und ziehen Sie mit einer Hand die untere Hälfte der Haut nach unten, bis die Beine freiliegen. Halten Sie den Fuß fest und durchtrennen Sie die Achillessehnen oberhalb des Sprunggelenks sowie die Bänder, die die Muskeln mit dem Fuß am unteren Ende der Tibia verbinden, um den Fuß von den Beinknochen zu lösen.Halten Sie das Bein angehoben und entfernen Sie die Muskeln und Bänder um das Kniegelenk am unteren Ende des Femurs, um die Oberschenkelmuskulatur vom Unterschenkel zu lösen. Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die gelockerten Muskeln von den fibularen und femoralen Oberflächen weg. Drücken Sie dann die geöffnete Schere in das Hüftgelenk, drehen Sie das Bein und ziehen Sie vorsichtig am Femur, um den Beinknochen vom Hüftgelenk zu trennen, während Sie das Bein durchtrennen und vom Körper lösen.Halten Sie nun das Bein am Hüftende mit einer sterilen Pinzette und verwenden Sie eine weitere Pinzette, um den Fuß vom Sprunggelenkende zu entfernen. Halten Sie dann das distale Ende des Femurs mit einer Pinzette und das proximale Ende von Tibia und Fibula mit einer anderen und biegen Sie vorsichtig Tibia und Fibula entgegen der Kniegelenkrichtung, um das Unterschenkelbein vom Femur und Patella zu trennen. Entfernen Sie mit der Pinzette die verbleibenden Bänder, Muskeln und die Fibula von den Unterschenkelknochen und legen Sie die gereinigte Tibia auf einen umgedrehten Petrischalen-Deckel, der ein bis zwei Milliliter HBSS/FCS enthält.Halten Sie das untere Ende des Femurs mit einer Pinzette und die Patella mit einer anderen Pinzette fest, beugen Sie das Knie und das umgebende Gewebe in die entgegengesetzte Richtung, um das Gelenk zu entfernen. Entfernen Sie anschließend das verbleibende Bindegewebe vom Femur und legen Sie den Knochen auf den umgedrehten Deckel der Petrischale. Sobald alle Knochen gewonnen wurden, reinigen Sie mithilfe einer Pinzette jegliches anhaftendes Restgewebe an den Knochen und tauchen Sie die Knochen in 10 Milliliter HBSS/FCS im Boden der Petrischale ein.Während die Petrischale teilweise mit einem sterilen Deckel abgedeckt bleibt, jede der gereinigten Knochen mit einer Schere der Länge nach halbieren. Anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26,5-Gauge-Nadel verwenden, um jeweils ein Milliliter HBSS/FCS aus der Schale in das Ende jedes Knochenstücks zu spülen, bis das gesamte rote Mark herausgelöst ist. Sichtbare Knochenmarkklumpen mehrmals durch die Spritze ziehen, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, und danach gründlich mit einer 10-Milliliter-Pipette vermischen.Überführen Sie die Zellen in ein Sammelröhrchen und spülen Sie die Petrischale ein Mal mit fünf Millilitern HBSS/FCS aus, um eventuell verbliebene Zellen zu gewinnen. Anschließend geben Sie die Waschflüssigkeit zum Sammelröhrchen und stellen die Zellen auf Eis. Um eine Knochenmarkzellkultur anzulegen, zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen und aspirieren Sie den Überstand mit einer sterilen Glas-Pasteurpipette, die an eine Vakuumsaugung angeschlossen ist.L&ouml;sen Sie das pelletierte, roten Blutk&ouml;rperchenreiche Pellet durch Vorsichtiges Antippen. Geben Sie anschlie&szlig;end 10 Milliliter RBC-Lysepuffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch Vortexen. Nach einer f&uuml;nfmin&uuml;tigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lyse durch Zugabe von 10 Milliliter HBSS/FCS gestoppt. Anschlie&szlig;end werden die Zellen abzentrifugiert und das Pellet in Knochenmarkzellmedium resuspendiert.Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode und überführen Sie die benötigten Zellen in ein neues Röhrchen mit Knochenmarkzellmedium. Sammeln Sie die Zellen anschließend durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einer Verdünnung von vier Millionen Zellen pro Milliliter in Knochenmarkzellmedium mit 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF. Geben Sie danach 9,5 Milliliter Knochenmarkzellmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF, in jede sterile bakteriologische Petrischale pro Kultur und fügen Sie 500 Mikroliter Zellen in die Mitte jeder Schale hinzu.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Am Tag drei geben Sie 10 Milliliter frisches Knochenmark-Medium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF, zu jeder Kultur hinzu, wobei darauf zu achten ist, die Zellen so wenig wie möglich zu stören. Am Tag sechs überführen Sie vorsichtig 10 Milliliter Zellkultur-Überstand in ein steriles 50-Milliliter-Konischglas.Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter frischem Knochenmarkzellmedium, das 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF enthält. Vortexen Sie die Zellsuspension dann vorsichtig und geben Sie die Zellen zurück in die Kulturschale. Am ersten Tag sind die Knochenmarkzellen klein und spärlich, aber bis zum dritten Tag haben sich Anzahl und Größe der Zellen erhöht, und einige haben begonnen, zu adhärieren.Am sechsten Tag sind mehr Zellen vorhanden, und es werden sowohl adhärente als auch nicht-adhärente Fraktionen beobachtet. Die Kultur kann ab dem siebten bis zum zehnten Tag geerntet und nach Größe sowie lebenden Zellen sortiert werden, wobei aus den Kulturen vom zehnten Tag ein höherer Prozentsatz CD11c-positiver Zellen gewonnen wird. Am siebten Tag ist die gesammelte nicht-adhärente Fraktion stark angereichert mit Zellen, die eine dendritische Morphologie aufweisen.Die CD11c-positiven, GR1-negativen Populationen, die am Tag sieben und zehn gewonnen wurden, können in drei Hauptpopulationen unterteilt werden: Makrophagen, unreife dendritische Zellen und reife dendritische Zellen, basierend auf der Expression von MHCII und der Bindung von FL-HA. Interessanterweise zeigt MerTK, obwohl es als Makrophagen-Marker betrachtet wird, eine starke Expression sowohl in Makrophagen als auch in unreifen dendritischen Zellen, die an den Tagen sieben und zehn isoliert wurden, während eine geringe Expression auf reifen dendritischen Zellen beobachtet wurde.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets sterile Techniken während der Knochenmarkentnahme und Zellkultur anzuwenden. Nach diesem Verfahren können die Zellen außerdem sortiert werden, um Zellpopulationen getrennt zu untersuchen, oder sie können mit entzündungsfördernden Substanzen stimuliert und anschließend mittels intrazellulärer Färbung und Durchflusszytometrie auf ihre Zytokinproduktion analysiert werden. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Knochenmarkzellen isoliert und sie in Gegenwart von GM-CSF kultiviert, um sowohl dendritische Zellen als auch makrophagenähnliche alveoläre Makrophagen zu erzeugen.

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Antigen-Präsentation in sekundären lymphatischen Organen durch dendritische Zellen ist entscheidend für die Einleitung des T-Zell-vermittelten adaptive Immunantwort. Hier zeigen wir die Kultur von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, Aktivierung und Etikettierung für die 2-Photonen-Imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von dendritischen Zellen - Schlüsselantigen-präsentierende Zellen, die T-Zellen aktivieren - aus dem Knochenmark einer erwachsenen Maus.

Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

Der Artikel beschreibt eine leicht einfach...

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

Makrophagen sind seit langem als eine kritische Komponente der angeborenen und erworbenen Immunantworten erkannt. Die jüngste Explosion des Wissens im Zusammenhang mit evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Interaktion zwischen Makrophagen und Mikroben hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit auf Makrophagen erneuert. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Makrophagen aus Knochenmark der Maus zu unterscheiden.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

In diesem Artikel liefern wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für den Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark dendritische Zellen und Makrophagen abgeleitet. Die Methode basiert auf der Transduktion des Knochenmarks Stammväter mit retroviralen Konstrukten gefolgt von Differenzierung in Makrophagen und dendritischen Zellen in Vitro.

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-enzymatische und unkomplizierte Methode zur Isolierung von 7-9 Tage alten neonatalen Knochenmarkzellen der Maus und zur Erzeugung differenzierter Makrophagen unter Verwendung eines Überstands von L929-Zellen als Quelle für den Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF). Die aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen wurden weiterhin auf die Oberflächenantigene F4/80, CD206, CD11b und funktionelle Kompetenz analysiert.

Isolierung und Aufbereitung von Knochenmarkmakrophagen aus Knochenmark bei Neugeborenen

Lernen Sie die Erzeugung und Unterscheidung von alveolären Makrophagen und dendritischen Zellen aus Mäuseknochenmark mit GM-CSF. Diese Methode liefert ausreichende Zellzahlen für immunologische Forschung.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus (Video) | JoVE Journal

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

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