Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, alveoläre Makrophagen-ähnliche Zellen von dendritischen Zellen in murinen Knochenmarkkulturen in vitro zu erzeugen und zu unterscheiden, die mit GM-CSF ergänzt wurden. Diese In-vitro-Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Funktion dendritischer Zellen oder Makrophagen zu beantworten. Der Hauptvorteil der Technik liegt darin, dass sie ausreichende Zellzahlen erzeugen kann und zwischen dendritischen Zellen und alveolären Makrophagen-ähnlichen Zellen differenzieren kann.

Die Auswirkungen dieser Technik könnten sich auf die Therapie der pulmonalen Proteinose erstrecken, da sie die Gewinnung alveolärer Makrophagen ermöglicht, die zur Behandlung dieser Erkrankung eingesetzt werden können. In der Regel benötigen Personen, die neu in dieser Methode sind, Übung beim Isolieren der gereinigten Knochen und beim Ausspülen des Knochenmarks. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, da nicht alle verwendeten Techniken allein durch schriftliche Anweisungen leicht verständlich sind.

15 Minuten vor Beginn der Dissektion ein biologisches Sicherheitswerkbank einschalten, um die Luft in der Werkbank zu reinigen und den Luftstrom zu stabilisieren, und die Oberfläche der Werkbank mit 70 % Ethanol säubern. Wenn die Werkbank bereit ist, eine Maus in Bauchlage auf ein bis zwei Papiertücher legen und das Tier mit 70 % Ethanol besprühen. Anschließend mit der nicht-dominanten Hand die Haut im Brustbereich anheben und mit einer Schere einen Schnitt durchführen.

Greifen Sie beide Enden des Schnitts und ziehen Sie vorsichtig, bis die beiden Enden des Schnitts am Magen zusammentreffen. Bringen Sie dann die Maus in Rückenlage und ziehen Sie mit einer Hand die untere Hälfte der Haut nach unten, bis die Beine freiliegen. Halten Sie den Fuß fest und durchtrennen Sie die Achillessehnen oberhalb des Sprunggelenks sowie die Bänder, die die Muskeln mit dem Fuß am unteren Ende der Tibia verbinden, um den Fuß von den Beinknochen zu lösen.

Halten Sie das Bein angehoben und entfernen Sie die Muskeln und Bänder um das Kniegelenk am unteren Ende des Femurs, um die Oberschenkelmuskulatur vom Unterschenkel zu lösen. Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die gelockerten Muskeln von den fibularen und femoralen Oberflächen weg. Drücken Sie dann die geöffnete Schere in das Hüftgelenk, drehen Sie das Bein und ziehen Sie vorsichtig am Femur, um den Beinknochen vom Hüftgelenk zu trennen, während Sie das Bein durchtrennen und vom Körper lösen.

Halten Sie nun das Bein am Hüftende mit einer sterilen Pinzette und verwenden Sie eine weitere Pinzette, um den Fuß vom Sprunggelenkende zu entfernen. Halten Sie dann das distale Ende des Femurs mit einer Pinzette und das proximale Ende von Tibia und Fibula mit einer anderen und biegen Sie vorsichtig Tibia und Fibula entgegen der Kniegelenkrichtung, um das Unterschenkelbein vom Femur und Patella zu trennen. Entfernen Sie mit der Pinzette die verbleibenden Bänder, Muskeln und die Fibula von den Unterschenkelknochen und legen Sie die gereinigte Tibia auf einen umgedrehten Petrischalen-Deckel, der ein bis zwei Milliliter HBSS/FCS enthält.

Halten Sie das untere Ende des Femurs mit einer Pinzette und die Patella mit einer anderen Pinzette fest, beugen Sie das Knie und das umgebende Gewebe in die entgegengesetzte Richtung, um das Gelenk zu entfernen. Entfernen Sie anschließend das verbleibende Bindegewebe vom Femur und legen Sie den Knochen auf den umgedrehten Deckel der Petrischale. Sobald alle Knochen gewonnen wurden, reinigen Sie mithilfe einer Pinzette jegliches anhaftendes Restgewebe an den Knochen und tauchen Sie die Knochen in 10 Milliliter HBSS/FCS im Boden der Petrischale ein.

Während die Petrischale teilweise mit einem sterilen Deckel abgedeckt bleibt, jede der gereinigten Knochen mit einer Schere der Länge nach halbieren. Anschließend eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 26,5-Gauge-Nadel verwenden, um jeweils ein Milliliter HBSS/FCS aus der Schale in das Ende jedes Knochenstücks zu spülen, bis das gesamte rote Mark herausgelöst ist. Sichtbare Knochenmarkklumpen mehrmals durch die Spritze ziehen, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, und danach gründlich mit einer 10-Milliliter-Pipette vermischen.

Überführen Sie die Zellen in ein Sammelröhrchen und spülen Sie die Petrischale ein Mal mit fünf Millilitern HBSS/FCS aus, um eventuell verbliebene Zellen zu gewinnen. Anschließend geben Sie die Waschflüssigkeit zum Sammelröhrchen und stellen die Zellen auf Eis. Um eine Knochenmarkzellkultur anzulegen, zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen und aspirieren Sie den Überstand mit einer sterilen Glas-Pasteurpipette, die an eine Vakuumsaugung angeschlossen ist.

Lösen Sie das pelletierte, roten Blutkörperchenreiche Pellet durch Vorsichtiges Antippen. Geben Sie anschließend 10 Milliliter RBC-Lysepuffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch Vortexen. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Lyse durch Zugabe von 10 Milliliter HBSS/FCS gestoppt. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert und das Pellet in Knochenmarkzellmedium resuspendiert.

Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode und überführen Sie die benötigten Zellen in ein neues Röhrchen mit Knochenmarkzellmedium. Sammeln Sie die Zellen anschließend durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in einer Verdünnung von vier Millionen Zellen pro Milliliter in Knochenmarkzellmedium mit 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF. Geben Sie danach 9,5 Milliliter Knochenmarkzellmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF, in jede sterile bakteriologische Petrischale pro Kultur und fügen Sie 500 Mikroliter Zellen in die Mitte jeder Schale hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2. Am Tag drei geben Sie 10 Milliliter frisches Knochenmark-Medium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF, zu jeder Kultur hinzu, wobei darauf zu achten ist, die Zellen so wenig wie möglich zu stören. Am Tag sechs überführen Sie vorsichtig 10 Milliliter Zellkultur-Überstand in ein steriles 50-Milliliter-Konischglas.

Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter frischem Knochenmarkzellmedium, das 20 Nanogramm pro Milliliter GM-CSF enthält. Vortexen Sie die Zellsuspension dann vorsichtig und geben Sie die Zellen zurück in die Kulturschale. Am ersten Tag sind die Knochenmarkzellen klein und spärlich, aber bis zum dritten Tag haben sich Anzahl und Größe der Zellen erhöht, und einige haben begonnen, zu adhärieren.

Am sechsten Tag sind mehr Zellen vorhanden, und es werden sowohl adhärente als auch nicht-adhärente Fraktionen beobachtet. Die Kultur kann ab dem siebten bis zum zehnten Tag geerntet und nach Größe sowie lebenden Zellen sortiert werden, wobei aus den Kulturen vom zehnten Tag ein höherer Prozentsatz CD11c-positiver Zellen gewonnen wird. Am siebten Tag ist die gesammelte nicht-adhärente Fraktion stark angereichert mit Zellen, die eine dendritische Morphologie aufweisen.

Die CD11c-positiven, GR1-negativen Populationen, die am Tag sieben und zehn gewonnen wurden, können in drei Hauptpopulationen unterteilt werden: Makrophagen, unreife dendritische Zellen und reife dendritische Zellen, basierend auf der Expression von MHCII und der Bindung von FL-HA. Interessanterweise zeigt MerTK, obwohl es als Makrophagen-Marker betrachtet wird, eine starke Expression sowohl in Makrophagen als auch in unreifen dendritischen Zellen, die an den Tagen sieben und zehn isoliert wurden, während eine geringe Expression auf reifen dendritischen Zellen beobachtet wurde.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets sterile Techniken während der Knochenmarkentnahme und Zellkultur anzuwenden. Nach diesem Verfahren können die Zellen außerdem sortiert werden, um Zellpopulationen getrennt zu untersuchen, oder sie können mit entzündungsfördernden Substanzen stimuliert und anschließend mittels intrazellulärer Färbung und Durchflusszytometrie auf ihre Zytokinproduktion analysiert werden. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Knochenmarkzellen isoliert und sie in Gegenwart von GM-CSF kultiviert, um sowohl dendritische Zellen als auch makrophagenähnliche alveoläre Makrophagen zu erzeugen.