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Methodenartikel

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

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DOI:

10.3791/54196

⸱

11. Juli 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein schnelles und flexibles Protokoll für ein retrovirales In-vivo-Expressionssystem auf Basis eines einzelnen T-Zell-Rezeptors (TCR). Retrovirale Vektoren werden verwendet, um Vorläuferzellen des Knochenmarks zu transduzieren, um die Entwicklung und Funktion eines einzelnen TCR in vivo als Alternative zu TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen.

Zusammenfassung

T-Zell-Rezeptor (TCR)-Signalübertragung ist essentiell für die Entwicklung und Differenzierung von T-Zellen im Thymus bzw. in der Peripherie. Die große Auswahl an TCRs macht es schwierig, eine spezifische antigene Reaktion zu untersuchen. Daher wurden TCR-transgene Mäuse dazu gebracht, die positive und negative Selektion im Thymus sowie die Aktivierung, Proliferation und Toleranz der peripheren T-Zellen zu untersuchen. Es wurden jedoch relativ wenige TCR-transgene Mäuse erzeugt, die spezifisch für ein bestimmtes Antigen sind. Daher fehlten Studien mit TCRs unterschiedlicher Affinitäten für dasselbe antigene Peptid. Die Generierung einer neuen transgenen TCR-Linie kann sechs oder mehr Monate dauern. Darüber hinaus können bestimmte Rückkreuzungen weitere sechs Monate dauern. Um eine schnellere Generierung und ein schnelleres Screening mehrerer TCRs zu ermöglichen, wurde ein Protokoll für die retrovirale Transduktion des Knochenmarks mit stöchiometrischer Expression der TCRα- und TCRβ-Ketten und der Erzeugung retrogener Mäuse etabliert. Jede retrogene Maus ist im Wesentlichen ein Gründer, wodurch ein Gründereffekt praktisch negiert wird, während die Zeitspanne für die Erzeugung eines retrogenen TCR-Maus von sechs Monaten auf etwa sechs Wochen verkürzt wird. Hier stellen wir eine schnelle und flexible Alternative zu TCR-transgenen Mäusen vor, die auf jedem gewählten Hintergrund mit einem bestimmten TCR exprimiert werden kann.

Einleitung

T - Zell - Rezeptor (TCR) Repertoire von Mensch und Maus wurde mit 1 x 10 8 und 2 x 10 6 einzigartige TCRs jeweils 1,2 geschätzt. Diese große Vielfalt ermöglicht T-Zellen eine Vielzahl von Antigen-Epitope aus selbst Peptiden sowie von Pathogenen dargestellt durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) abgeleitet zu erkennen. Die feinen Unterschiede in den Wechselwirkungen der TCRs mit einzigartigen Peptid-MHC-Komplexe diktieren, ob eine T-Zell-Apoptose durchlaufen wird, Anergie, Aktivierung, Differenzierung, Zytokinproduktion oder Zytotoxizität. Jedoch aufgrund der großen TCR-Repertoire, Analyse, wie ein spezifischer TCR zu einem bestimmten Antigen zu reagieren erfordert die Verwendung von einzelnen TCR-Systeme.

Verschiedene TCR transgene Mäuse wurden erzeugt , um die Funktion eines einzelnen TCR in einem in vivo - Modell 3-9 zu studieren. Es gibt jedoch Einschränkungen transgenen Mäusen einschließlich der TCRKosten, die Länge der Zeit eine einzelne transgene Maus und die so genannte Gründereffekt von zufälligen Transgen - Insertion in die Keimbahn DNA 10 zu erzeugen. Daher relativ wenige TCR transgene Mäuse wurden für jede gegebene Antigen und die funktionellen Auswirkungen von hohen und niedrigen TCR-Affinität für das gleiche Epitop gerichtet werden selten erzeugt. Um die Notwendigkeit für eine schnelle Annäherung an Bildschirm - Adresse und mehrere TZR einzeln oder in Kombination, retrogenic ( 'retro' von Retrovirus und "gene" von transgenen) Mäuse wurden als Alternative genutzt studieren 11-13 transgene Mäuse zu TCR.

Die 2A Peptid Konsensusmotiv innerhalb von mehreren Viren gefunden bestehen aus einer 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, bei der Spaltung zwischen dem Glycin der 2A und dem Prolin der 2B auftritt von cis - aktiven Hydrolase - Aktivität, was zu einer ribosomalen Skipping bei der Übersetzung 10,14-16. Für eine detaillierte Darstellung der c darstelltlaub der verschiedenen 2A Peptide (F2A, E2A, T2A und P2A) finden Sie auf Referenzen 10 - 12. Auf diese Weise zwei Cistrons (TCR alpha und TCR beta) können in einem einzigen Vektor was in stöchiometrischen Übersetzung verknüpft werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes können wir zum Ausdruck bringen und direkt mehrere Antigen - spezifischen TZR in vivo vergleichen.

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Protokoll

Ethik - Statement: Es wird alles unternommen Tier Beschwerden oder Stress auf ein Minimum während der Bestrahlung und Schwanzvene Injektionen zu halten. Mäuse werden als Quelle der Zellen in diesen Experimenten verwendet wird; als solche sind keine Verfahren oder Manipulationen abgesehen von Euthanasie. Die Mäuse werden durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte eingeschläfert Tod zu bestätigen. Dieses Verfahren ist mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association konsistent.

1. Bereiten Sie Retrovirale Construct

  1. Sub-Klon der T-Zell - Rezeptor (TCR) alpha und beta - Ketten, durch ein 2A - Linker getrennt sind , in eine MSCV-basierenden retroviralen Vektor 11 (beispielsweise pMIAII oder pMIGII) 11.
    HINWEIS: Die 2A Linkers ermöglicht stöchiometrische und konkordant Expression der alpha- und beta-TZR-Ketten von einem einzelnen offenen Leserahmen. Der Vektor enthält eine IRES fluoreszierendes Protein Kassette (ametrine oder GFP), das verwendet wird, umSpur transduzierten Zellen und Transduktionseffizienz. Für eine detaillierte Protokoll finden Sie unter Holst et al. 11
  2. Isolieren Plasmid-DNA im Handel erhalten Plasma-Prep-Kit oder ein ähnliches Produkt. Verwenden Sie eine Arbeitskonzentration von 1 bis 2 & mgr; g & mgr; l -1.

2. Erzeugung von Retrovirale Producer-Zelllinien

  1. Verwenden einen zweistufigen Prozess die retrovirale Produzentenzelllinien zu erzeugen.
    HINWEIS: Für ein ausführliches Protokoll, sehen Sie bitte Holst et al . 11.
    1. Generieren Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T - Zellen mit drei Plasmiden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) und Vektor von Interesse 11) und nehmen Sie die retrovirale Überstand von den 293T - Zellen die GP + E86 ekotropischen retroviralen Produzentenzelllinie zu transduzieren.
    2. Isolieren Sie die oberen 40% der fluoreszierenden exprimierenden GP + E86 produzierenden Zellen durch FACS und propagieren die transdcuced-GP + E86 Produzentenzellen als Quelle des Virus.
      HINWEIS: Die Erzeugungvon hohem Titer Erzeuger ist kritisch für eine effiziente Transduktion von Knochenmarkszellen. Für eine vollständige Protokoll bitte Holst et al anzuzeigen. 11

3. Retrovirus-vermittelte Stem Cell Gene Transfer (Tag -5)

  1. Auftauen und Kultur 0,5 -1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in komplettem DMEM 10% (vol / vol) FBS ein ausreichendes Wachstum für zwei konfluenten 150-mm - Platten von Tag 0 dieses Protokolls zu ermöglichen.
    HINWEIS: Thawing 0,5 - 5. 50% Konfluenz am Tag Dies gilt auch für 5 Tage der Kultur, um den GP + E86 zu erweitern ermöglicht - 1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in einem 10 - cm - Platte für 30 erlauben Hersteller-Zelllinien zu zwei konfluenten 150-mm-Platten von Tag 0.
    1. Kultur retroviralen Producer-Zelllinie in vollständiger Gewebekulturmedien, enthaltend 5% Kälberserum Feta und Ciprofloxacin (10 ug / ml) Mycoplasma-Kontamination zu vermeiden.
      Hinweis: Die Verwendung von Ciprofloxacin brechen, wenn generating der virale Überstand für Knochenmarkübertragung. Vermeiden Sie über Wachstum der Erzeugerzelllinie, da diese sich negativ auf Knochenmark Transduktionswirksamkeit auswirken wird.

4. Inject Spendermäusen mit 5-Fluorouracil (5-FU) (Tag -3)

  1. Wiegen Sie die Spendermäuse (5-12 Wochen alt) erforderlich, um die Menge an 5-FU zu bestimmen. Mit Mäuse jünger als 5 Wochen alt Ergebnisse in Ausbeute gering Knochenmark. Um sicherzustellen, dass die Expression eines einzelnen TCR, verwenden Sie eine T-Zell-defizienten Mausstamm wie SCID, RAG oder TCR alpha defizienten Mäusen als Knochenmarkspender.
  2. Zu liefern , 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht Arbeiten in der Gewebekultur Haube verdünnen Sie die 5-FU Lager mit sterilem PBS , um eine ausreichende Menge von 10 mg ml -1 Arbeitslösung von 5-FU zu machen.
  3. Unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 37 G Nadel injiziert intraperitoneal 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht pro Spendermaus.
    HINWEIS: Verwenden Sie 1 Spendermaus pro Empfänger zu starten und zu justierendie Anzahl von Spendermäusen nach der Zellausbeute. Ein alternatives Verfahren zu den 5-FU - Behandlung zur Anreicherung und Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen ist die negative Selektion von Lineage - positiven Zellen , wie in Viret et al.

5. Knochenmark-Extraktionsverfahren (Tag 0)

  1. Erhalten Dissektion Schere und Pinzette für die Knochen Isolation. Bereiten Medien (HBSS, ergänzt mit 5% FCS (vol / vol)) Knochen in einem 50 ml konischen Röhrchen zu sammeln. Halten Sie 50 ml konischen haltigen Medien auf Eis. Euthanize Mäuse durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte Tod zu bestätigen. Pinch Pfote um sicherzustellen, dass keine Reflexe erkannt.
  2. Sterilisieren der Operationsstelle und chirurgische Werkzeuge mit Ethanol oder Methanol. Entfernen Sie den Femur, Tibia, Humerus, und Beckengürtel sorgfältig indem zuerst nach oben und unter dem Beckengürtel. Schnitt zurück nach unten entlang des Oberschenkels an der Tibia. Entfernen Sie das gesamte umliegende Gewebe Schere und Pinzette sauberen Knochen zu erhalten. BehaltenKnochen in HBSS + 5% (vol / vol) FBS hydratisiert.
  3. Trennen Sie die Knochen von an den Gelenken schneiden, um sicherzustellen, beide abzuschneiden endet in jedem Knochen. Legen Sie eine 25-Gauge-Nadel in eine 10-ml-Spritze befestigt enthält HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Wenden Sie Druck und spülen Sie alle Knochenmark durch einen 70 & mgr; m Sieb ruht in einem 50 ml konischen.
  4. Von Zeit zu Zeit, drücken Sie die Knochenmark durch die 70-um-Filter den Kolben aus einer 1 ml oder 3 ml Spritze. Spülen Sie das Sieb mit HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Dies wird eine Zellsuspension gewährleisten, die frei von Knochenfragmenten und Gewebe. Halten Zellen steril durch das Verfahren in einer sterilen Haube durchgeführt wird.
  5. Zentrifuge Knochenmarkszellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C.

6. Knochenmark-Kultur (Tag 0)

  1. Dekantieren oder absaugen Medien und resuspendieren Zellpellet in 1 ml Ammoniumchlorid-Basis roten Blut Lysepuffer (oder gleichwertig RBC-Lyse-Puffer) pro 50 ml konischen Röhrchen. Nach 1 min Inkubation bei RaumTemperatur, quenchen die rote Puffer Zelllyse durch 10 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS hinzugefügt wird.
  2. Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C.
  3. Dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren Knochenmark in 5 ml komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer.
    HINWEIS: Allgemeine Ausbeute sollte ca. 5 - 10 x 10 6 Zellen pro Maus; jedoch kann die Ausbeute bei den verschiedenen Stämmen von Mäusen variieren.
  4. Platte Knochenmarkzellen in einer Dichte von 4 x 10 7 Zellen pro 150 mm-Platte in 30 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS ergänzt mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1).
    HINWEIS: Verwenden Sie frisch aufgetauten-aliquotiert Zytokinen. Verwenden Sie keine Cytokine, die eingefroren wurden und aufgetaut als einmal oder bei 4 ° C für mehr als 2 Wochen gehalten.
  5. Inkubieren über Nacht Knochenmark (ca. 24 h) bei 37 ° C mit 5% CO 2.

7. Retrovirale Producer Zellkultur (Tag 0)

  1. Platte 3 x 10 6 retroviralen Erzeugerzellen pro 150 mm-Platte in 18 ml vollständigem DMEM - 20% (Vol / Vol) FBS.
  2. Inkubieren retroviralen Erzeugerzellen bei 37 ° C über Nacht. Antizipieren einer 150-mm-Platte für 15 Millionen Knochenmarkzellen (ca. 2 - 3 Donormäusen).

8. Retroviral Supernatant (Tag 1)

  1. Am nächsten Tag (etwa 24 Stunden später), ernten den retroviralen Überstand von den Produzenten Platten durch die Erstellung des retroviralen Überstand direkt aus der 150-mm-Platte mit einer 10-ml-Spritze und Filter mit einem 0,45 (in Schritt 7 eingestellt ist) -μm Spritzenfilter.
  2. ersetzen Sie vorsichtig den entfernten retroviralen Überstand mit 18 ml frischem komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS.
  3. Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (Polybrene) (6 &# 956; g ml -1).
    HINWEIS: Hexadimethrinbromid sollten frisch alle 2 Monate gemacht werden, um einen Rückgang der Wirksamkeit der retroviralen Transduktion zu vermeiden.

9. Knochenmark-Ernte (Tag 1)

  1. Nach Abschluss von Schritt 8.3, ernten die Knochenmarkzellen aus Schritt 6.4 und übertragen Sie die Medien nicht adhärenten Zellen in sterile 50-ml-Röhrchen enthält.
  2. Waschen Sie die Platten kräftig mit 10 ml PBS und sammeln sich in der 50-ml-Erlen aus Schritt 9.1. Falls erforderlich, wiederholen Sie den Waschschritt.
  3. Zentrifuge die Zellen bei 300 · g für 10 min bei 4 ° C, dekantiert den Überstand, resuspendiere Zellen in einem kleinen Volumen (1 - 3 ml) komplett DMEM 20% (Vol / Vol) FBS und zählen. Antizipieren von 50 bis 75% Rückgewinnung von Tag 0 Resuspendieren Knochenmark bei 1 x 10 6 Zellen pro 1 ml des retroviralen Überstand Zytokinen und Hexadimethrinbromid enthält.

10. Bone Marrow Transduction (Tag 1)

  1. Platte des retroviralen Überstand / Knochen marrow Mischung mit einem Volumen von 3 ml pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Wickeln Sie die Platten in der Plastikverpackung um einen Gasaustausch während der Zentrifugation in Schritt 10.2 minimieren.
  2. Dreh die gewickelt Sechs-Well-Platten bei 1.000 xg für 60 min ein 37 ° C.
  3. Nach dem Spin abgeschlossen ist, entfernen Sie die Plastikfolie und legen Sie die Platten in einem 37 ° C CO 2 Inkubator für 24 Stunden.

11. Retroviral Supernatant und Transduction (Tag 2)

  1. Nach 24 Stunden sammeln frische Virusüberstand aus der viralen Hersteller-Zelllinie. Filtriere den retroviralen Überstand unter Verwendung einer 10-ml-Spritze und eine 0,45-um-Spritzenfilter. Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (6 g ml -1).
  2. Als nächstes vorsichtig mit Pipette entfernen oder die obersten 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte aspirieren die Knochenmarkszellen enthält,.
    HINWEIS: Arbeit sorgfältig nicht das Knochenmark anzusaugen, die in der Regel in der Mitte der Vertiefung konzentriert wird. Alternativ kann der abgenommenen versponnen werden Sie sich alle verlorenen Knochenmarkszellen zu erholen.
  3. Zu jeder Vertiefung im Knochenmark 6-Well-Platte 3 ml frischem viralen Überstand mit Zytokinen und Hexadimethrinbromid. Wickeln Sie die Platten aus Kunststoff, und wiederholen Sie die Spinübertragung bei 1.000 × g für 60 min ein 37 ° C. Auszupacken , die Platten und Inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht (etwa 24 h).

12. Zugabe von frischem Ergänzte DMEM (Tag 3)

  1. Nach 24 Stunden die Top 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte entfernen Sie die Knochenmarkzellen, wie in Schritt 11.2 enthält. Ersetzen Sie die entfernt Medien mit frischem DMEM 20% (vol / vol) FBS mit Endkonzentrationen von IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) .
  2. Inkubieren KnochenmarkPlatten bei 37 ° C CO 2 Inkubator für weitere 24 hr.

13. Ernte transduzierten Knochenmark (Tag 4)

  1. Nach 24 Stunden, sammeln die Knochenmarkszellen aus den Sechs-Well-Platten. Waschen Sie die Platten kräftig mit PBS alle nicht-adhärente Zellen zu entfernen.
    1. Zentrifugieren der Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und dekantiert den Überstand.
    2. Resuspendieren des Knochenmarks in einem kleinen Volumen (1 ml) PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS. Halten Sie Zellen auf Eis.
  2. Nehmen Sie eine 10-ul-Probe jeder Knochenmark Zustand und zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Unter der Annahme , 1 - mindestens 4 x 10 6 Zellen zu übertragen pro Empfängermaus 2 - Donor pro Empfänger, wird die Ausbeute ausreichend sein. Resuspendieren des Knochenmarks in einem ausreichenden Volumen von PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS 200 einzuspritzen - 300 & mgr; l pro Maus.
    1. Injizieren mindestens 2 x 10 6 Zellen mit einer Transduktionseffizienz(injizieren bis zu 8 x10 6 Zellen) pro Maus intravenös von 25%.
      HINWEIS: Es wird routinemßig fünf Empfängermäuse injizieren pro zwei Platten mit 6 Vertiefungen von Knochenmarkszellen. Wenn die Ausbeute wesentlich geringer, mehr Donormäusen ist, sollte bis kann eine ausreichende Knochenmark verwendet werden Zahl erhalten werden. Um eine optimale Wiederherstellung zu erreichen, von mindestens 5 x 10 5 transduzierte (fluoreszierend positive) sollte in jedem Empfänger injiziert werden.
  3. Mit einem Mikro - Pipette, nehmen Sie eine 10-ul - Probe von jeder Bedingung Knochenmark und Transduktionseffizienz durch Fluss analysieren Zytometrie basierend auf der Expression des fluoreszierenden Marker (Abbildung 1A) 11.
    HINWEIS: In der Regel ist der Anteil der Fluoreszenz-positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Die Zahl der transduzierten Knochenmarkzellen erforderlich a subletal bestrahlen Maus zu rekonstituieren kann abhängig von der Transduktionseffizienz variieren. Je niedriger die transduction Effizienz, benötigt die mehr Knochenmarkzellen und umgekehrt, je höher die Knochenmark Transduktionseffizienz, die geringere Anzahl von Zellen für die Rekonstitution benötigt. Transduktionseffizienz unter 25% ist suboptimal und kann zu einer unzureichenden Rekonstitution und Überleben führen. Um eine optimale Knochenmark Erholung und Transduktionseffizienz zu gewährleisten, verwenden Sie frisch zubereitete Gewebekulturmedien und Zytokinen. Wenn ein neues TCR Expression des retrogenic System verwendet wird , ist die Auswahl des TCR in vivo unbekannt. In Abhängigkeit von jedem einzelnen TCR - Affinität, TCR Selektion im Thymus und peripheren T - Zell - Expression wird 17 variieren.

14. Maus-Bestrahlung, Knochenmark-Injection und Pflege

  1. Bestrahlen Mäuse am Tag vor der Knochenmark-Injektion (am selben Tag wie Schritt 13). Verwenden Sie die folgenden Dosen: C57BL / 6 - Mäuse (und andere Wildtyp - Stämme), 900 rads; Rag1 - / - Mäuse, 500 Rad; SCID - Mäuse, 300 rad).
    1. Platz Empfängermäuse auf Amoxicillin (50 mg / kg / Tag) oder ein anderes Antibiotikum Wasserbehandlung vor der Bestrahlung, und halten Sie auf Antibiotika für die ersten zwei Wochen nach der Knochenmark-Injektion.
      HINWEIS: Die optimale Bestrahlungsdosis kann empirisch bestimmt werden müssen.
  2. Für die Injektion laden die Zellen aus Schritt 13.1 in eine 1-ml-Spritze mit stumpfen Nadeln unmittelbar vor der Injektion, dann Injektion die Nadel 27er ändern, zu vertreiben jegliche Luft Luftembolie zu vermeiden. Wärme Mäuse unter einer Wärmelampe und 0,2 ml Knochenmark pro Maus intravenös injiziert.
    HINWEIS: Lassen Sie sich nicht Zellen in der Spritze für längere Zeit oder die Zellen absetzen sitzen.
  3. Überwachen Sie die Mäuse wöchentlich, um sicherzustellen, dass sie gesund bleiben.
  4. Nach 5 - 6 Wochen, bluten die Mäuse zur Rekonstitution auf der Grundlage von GFP zu überprüfen + / ametrine + und TCR Co-Expression (Abbildung 1B) 11.

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Ergebnisse

Knochenmark Transduktionseffizienz bei Schritt 13.3 des Protokolls überprüft , bevor das Knochenmark in Schwanzvene iv In der repräsentativen bone marrow Transduktion Figur (1A) eingespritzt wird, ungefähr 10 & mgr; l der geernteten Knochenmark wurden zu 100-ul PBS und für ametrine Expression analysiert. Im allgemeinen der Prozentsatz der fluoreszierenden positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Nach 6 Wochen Knoc...

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Diskussion

In dem Protokoll wir ausführlich einige kritische Schritte optimale Knochenmark Gesundheit, Transduktionseffizienz und Rekonstitution zu gewährleisten. Erster wichtiger Schritt ist die Erzeugung und die ordnungsgemäße Wartung der GP + E86 Virusproduzentenzellen. Verwenden frühen Passage Produktionszelllinien und halten bei 80% Konfluenz oder niedriger vor der Verwendung. Wenn frisch machen viralen Produzentenzellen GP + E86, sicherzustellen, sind die 293T-Zellen frühen Passage und wachsen in der Kultur für 24 bis 48 Stu...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (5K22A1119151-01 und 1R56DK104903-01) zu MLB, Pilot / Machbarkeits Programm des Diabetes Research Center (P30-DK079638) bei BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA unterstützt 1-15-JF-07, AAI Karriere in Immunology Fellowship MB und The Robert und Janice McNair-Stiftung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM, hoher Glukosegehalt +Glutamin Corning Cellgro10-013-CVDulbecco's Modifikation von Eagle's Medium mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat
FBSAtlanta BiologicalS11550
Trypsin-VersenLonza17-161F
0,45 µ m SpritzenvorsatzfilterThermo Scientific194-2545
PolybreneSigmaH9268-10GSterilfiltriert in dH2O
Ciprofloxacin VWRAAJ61970-06
5-Fluorouracil (5-FU)VWRAAA13456-06
NatriumpyruvatCorning Cellgro25-000-CI
MEM nichtessentielle AminosäurenCorning Cellgro25-025-CI
HEPES 1 M LösungCorning Cellgro25-060-CI
2-MercaptoethanolGibco von Life Technologies21985-023
Pen/StreptCorning Cellgro30-002-CI
L-GlutaminCorning Cellgro25-005-CI
150 mm GewebekulturschalenGreiner Bio-one639160
Tisue kulturbehandelte 6-Well-FlachplatteGreiner Bio-one657160
70 µ m Nylon-ZellsiebeFalcon352350
Maus IL-3InvitrogenPMC0033
Humanes IL-6Invitrogen 
Maus StammzellfaktorInvitrogenPMC2113L
10x PBSCorning Cellgro46-D13-CM
HANKS BufferCorning Cellgro21020147
BD 10 ml SpritzeBD300912
BD 1 ml SpritzeBD309659
27 G x 1/2 BD Präzisions-GleitnadelBD
30 G x 1/2 BD Präzisions-GleitnadelBD305106
PHC0063305109

Referenzen

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