Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch Coxiella burnetii Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii ist ein einzigartiges intrazelluläre Erreger der zoonotischen Infektionen beim Menschen Q - Fieber verursacht. Diese Krankheit wird mit einem breiten Spektrum von klinischen Präsentationen im Zusammenhang von asymptomatischen Serokonversion zu lebensbedrohlichen chronischen Infektion erstreckt , die als Endokarditis Jahre nach der Exposition ¹ oft manifestiert. Die Infektion des Menschen erfolgt in erster Linie durch das Einatmen von kontaminierten Aerosolen mit Wiederkäuern der großen Reservoir für Infektionen, insbesondere Milchkühe, Schafe und Ziegen. Obwohl Coxiella Infektion bei diesen Tieren der Regel subklinischen ist, kann die Infektion Abtreibung auslösen und die erhebliche bakterielle Belastung innerhalb der Entbindungs ​​Flüssigkeit und Plazenta kann die lokale Umgebung ¹ verunreinigen. Ein Beispiel für die enorme Belastung eine solche Kontamination kann sowohl auf die öffentliche Gesundheit haben und die Agrarindustrie vor kurzem in der Q - Fieber - Ausbruch beobachtet wurde , die in den Niederlanden ² aufgetreten ist . Zwischen 2007 und2010 mehr als 4.000 menschliche Fälle von Q - Fieber diagnostiziert wurden und dieser Ausbruch zu erheblichen Kontamination von Ziegenbetriebe ³ wurde verknüpft. Darüber hinaus ist Coxiella eine potenzielle biologische Waffe, wie für Disease Control von den US Centers klassifiziert und Prävention, durch die Umweltstabilität der Bakterien und geringe Infektionsdosis erforderlich schwere Morbidität und Mortalität ⁴ zu verursachen.

Coxiella existiert in zwei Phasen: Phase I Organismen, isoliert aus natürlichen Quellen, sind extrem virulent und Phase - II - Organismen in vivo stark gedämpft. Beispielsweise nach mehreren in vitro Passagen Coxiella burnetii Nine Mile Phase I Organismen, Phase II Bakterien produziert wurden , die eine irreversible chromosomale Deletion in abgeschnittene Lipopolysaccharid (LPS) enthalten ^5. Dieser Stamm, C. burnetii NMII ist phänotypisch ähnlich ich in Gewebekulturmodellen zu Phase und bietet einen sichereren Modusl für Forscher Coxiella Pathogenese in Laboratorien zu untersuchen ^5. In den letzten Jahren haben mehrere Durchbrüche auf dem Gebiet der Genetik Coxiella rasch vorangetrieben . Vor allem die Entwicklung von axenic Medien (Citrat Cystein Medium angesäuert - ACCM-2) hat die zellfreie Wachstum von Coxiella sowohl in flüssiger und auf festen Medien ^6,7 erlaubt. Dies führte zu direkten Verbesserungen der genetischen Werkzeuge zur Verfügung , für Coxiella einschließlich eines induzierbaren Genexpressionssystem, Shuttle - Vektoren und zufällige Transposon - Systeme ^11.08. In jüngster Zeit werden zwei Verfahren zur gezielten Geninaktivierung sind ebenfalls entwickelt worden, die den Weg für ¹² spezifische Virulenzgen Kandidaten untersucht.

Folgende Internalisierung durch Alveolarmakrophagen, repliziert Coxiella zu hohen Zahlen innerhalb eines membrangebundenen Kompartiment bezeichnet die Coxiella- enthält Vakuole (CCV). Der CCV erfordert Host endocytic Handel thrau frühen und späten Endosomen , bis es reift in ein Lysosom abgeleiteten Organell ^13. Im Laufe dieses Prozesses erwirbt der CCV Wirtsfaktoren , die entweder vorübergehend erscheinen oder bleiben mit der Vakuole verbunden sind , einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Rab5, Rab7, CD63 und LAMP-1 . ^13-15 Die Replikation von Coxiella innerhalb von Wirtszellen ist völlig abhängig von einem voll funktionsfähigen Dot / Icm Typ IVB - Sekretionssystem (T4SS) ^8,16,17. Dieses Sekretionssystem ist ein Multi-Proteinstruktur ancestrally Konjugation Systemen und erstreckt sich über sowohl bakterielle als auch vacuolar Membranen bakterielle Proteine ​​zu liefern, bezeichnet als Effektoren in das Wirts Zytoplasma ^18. Die Coxiella T4SS funktionell sehr ähnlich dem gut charakterisierten Typ IVB Dot / Icm Sekretionssystem von Legionellen pneumophila ^19,20. Interessanterweise Aktivierung des T4SS und nachfolgende Translokation Effektor nicht auftritt , bis die saure Coxiella Lysosom-derived erreichtOrganell, etwa 8 Stunden nach der Infektion ^17,21. Bis heute sind über 130 Dot / Icm Effektoren wurden ^9,17,22-24 identifiziert. Viele dieser Effektoren spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Replikation von Coxiella in Wirtszellen; jedoch nur wenige Effektoren wurden funktionell ^25-29 charakterisiert.

In dieser Studie nutzen wir eine fluoreszenzbasierten Translokation Assay, der auf der Spaltung des (bezeichnet im Folgenden als BlaM Substrat) CCF2-AM FRET Substrat stützt über β-Lactamase - Aktivität in der Wirtszelle Zytoplasma (Abbildung 1). Das Gen von Interesse fusioniert an TEM-1-β-Lactamase (BlaM) auf einem Reporterplasmid, das eine konstitutive Expression sorgt. Das BlaM Substrat besteht aus zwei Fluorophore (Cumarin und Fluorescein), die ein FRET-Paar bilden. Anregung der Cumarin Ergebnisse in FRET des Fluorescein und grüne Fluoreszenzemission in Abwesenheit von Effektorzellen Translokation; Wenn jedoch die BlaM-Effektor-Fusionsprotein wird in das Wirts Zytoplasma transloziert, die sich ergebende β-Lactamase-Aktivität spaltet die β-Lactam-Ring des BlaM Substrat, wobei das FRET-Paar produzieren blaue Fluoreszenzemission nach Anregung zu trennen. Diese Translokation Assay wurde als ein Ansatz zur Identifizierung Effektor - Proteine ​​aus einer Reihe von verschiedenen intra- und extrazellulären Bakterien gut bewährt, einschließlich C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, darmpathogene E. coli, Salmonella und Brucella ^17,30-35.

Um die Rolle der spezifischen Wirtsfaktoren auf Coxiella Effektor Translokation bestimmen verwenden wir ein gut etabliertes Verfahren zur Gen - Silencing als RNA - Interferenz bekannt, insbesondere small interfering RNA (siRNA). Ursprünglich in Caenorhabditis elegans identifiziert, ist die RNA - Interferenz ein konserviertes endogenen zellulären Prozess für angeborene defe verwendetnse gegen Viren sowie der Genregulation ^36,37. Von sequenzspezifischen siRNA, Abbau von mRNA erfolgt durch RISC (RNA-induced silencing complex) , was zu spezifischen Gen - Silencing oder Zuschlags ³⁸ nach der Bindung. In dieser Studie wurde siRNA zwei Wirtsproteine ​​zu zielen, RAB5A und Rab7A, die wichtige Regulatoren des endocytischen sind. Die Auswirkungen der RAB5A und Rab7A auf Effektor - Translokation zum Schweigen zu bringen wurde mit C ermittelt burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ausgewählt wurde , wie es zuvor durch die Dot / Icm Sekretionssystem von Coxiella ¹⁷ transloziert werden , wurde gezeigt.

Unter Verwendung sowohl siRNA Gen - Silencing und die fluorescencebased Translokation Assay hier beschrieben, beginnen wir eine Rolle für die Wirtsfaktoren bei der Translokation von Effektor - Proteine ​​, die durch Coxiella zu etablieren. Dieser Ansatz kann auf eine breite Palette von sowohl intra- und extrazellulären Bakterien angewendet werden, die ähnliche secretio besitzenn-Systeme, die für die Translokation von Effektor-Proteine.

Hinweis: Alle Verfahren , das Wachstum oder die Manipulation von Coxiella burnetii RSA439 NMII Beteiligung sollte in einem physikalischen Sicherheitsstufe 2 Labor und in einem biologischen Sicherheitsschrank unter Beachtung der örtlichen Richtlinien durchgeführt werden. Ein schematisches Diagramm der reversen Transfektion und Translokation Assay Workflow unten beschrieben ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Herstellung von C. burnetii Kultur Ausdruck CBU0077 Fused zu ß-Lactamase (pBlaM-CBU0077) (Tag 1)

1. Bereiten 1X ACCM-2 ^6:
   1. Kombinieren Sie die aufgeführten Komponenten in Tabelle 1 aufgeführt . Der pH - Wert auf 4,75 mit 6 M NaOH und Filter zu sterilisieren (Sterilisieren nicht). ACCM-2 ist für ca. drei Wochen gelagert bei 4 ° C stabil.
2. Generieren C. burnetii pBlaM-CBU0077 Aktien.
   1. Infect HeLa 229 - Zellen mit dem C. burnetii Stamm trägt pBlaM-CBU0077 und Passage bis große vacuoles werden in der Mehrzahl der Zellen beobachtet.
      1. Wachsen die C. burnetii Stamm trägt pBlaM-CBU0077 in 20 ml ACCM-2 , enthaltend 3 & mgr; g / ml Chloramphenicol in einem 75 cm ² Gewebekulturflasche mit belüftete Kappe für 7 Tage bei 37 ° C in 5% CO _2, 2,5% O _2.
      2. Zentrifugieren Sie die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
      3. Resuspendieren des Pellets in 20 ml DMEM + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 3 & mgr; g / ml Chloramphenicol (Erhaltungsmedium). Entfernen Sie das Medium aus einer 50% konfluenten 75 cm ² Kolben von HeLa - 229 - Zellen. In resuspendierten C. burnetii zu HeLa - 229 - Zellen. Inkubieren für 2 Tage bei 37 ° C in 5% CO ₂ Infektion von HeLa - 229 - Zellen zu ermöglichen , zu schaffen.
      4. Split - Zellen in 175 cm ² Gewebekulturflasche.
         1. Entfernen Sie das Medium aus dem 75 cm ² Kolben und waschen Sie die Monoschicht zweimal mit 10 ml vorgewärmtes PBS.
         2. 1 ml of 0,05% Trypsin-EDTA - Lösung und Ortszellen bei 37 ° C + 5% CO ₂ 3 - 5 min Zellen zu lösen.
         3. Re-suspendieren Zellen in 10 ml Erhaltungsmedium. 2 ml resuspendierten Zellen in einen 175 cm ² -Kolben 38 ml Erhaltungsmedium enthält.
         4. Bei 37 ° C inkubieren in 5% CO ₂ für weitere 3 bis 5 Tage bis zu 100% Konfluenz erreicht ist , und große Vakuolen beobachtet.
   2. Sammeln Überstand aus dem 175 cm ² Kolben, 10 ml dH ₂ O , um die infizierten HeLa - 229 - Zellen zu bedecken und für 15 min Inkubation auf infizierte Zellen lysieren.
   3. Kombinieren Überstand und Pellet lysierten Zellen und bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
   4. Re-suspendieren Pellet in 10 ml dH ₂ O. Lysieren Zellen weiter, indem wiederholt die Resuspension durch eine 23G Nadel vorbei an einer 10 ml-Spritze mindestens 20 Mal. Pellet bei 500 × g für 5 min um Zelltrümmer zu entfernen.
   <li> 15 min bei RT mit 15.000 × g entfernen und Pelletüberstand C. sammeln burnetii.
3. Re-suspendieren C. burnetii in DMEM + 10% FCS und die Anzahl der Bakterien pro 4 quantifizieren. Die Lösung wird bis 1 × 10 ⁹ Genome / ml mit DMEM + 10% FCS + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), aliquote 50 ul Bestände in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C.

2. Reverse - Transfektion von siRNA und Seeding von HeLa - 229 - Zellen (Tag 4)

1. Wenn die experimentelle siRNA zum ersten Mal unter Verwendung vorbereitendie siRNA, wie folgt:
   1. Zentrifuge kurz die lyophilisierte siRNA, um sicherzustellen, daß das siRNA Pellet am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
   2. Re-suspend die pelle siRNA zu einer endgültigen Lager - Konzentration von 20 & mgr; M durch Pipettieren das entsprechende Volumen 1x siRNA - Puffer (Tabelle 2).
   3. Pipette, um die Lösung auf und ab 3 bis 5-mal zu mischen und auf einem Orbitalmischer für 30 min bei RT, Umdrehen des Röhrchens alle 5 - 10 min.
   4. Zentrifuge kurz die Röhre die siRNA gesammelt am Ende des Rohres zu gewährleisten.
   5. Aliquot der siRNA in 50 ul-Aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C, bis sie benötigt.
   6. Um 1 uM erzeugen Arbeitskonzentration von siRNA, Pipette 950 ul 1X siRNA-Puffer in ein 50-ul-Aliquot Lager (20 & mgr; M), wenn nötig. Hinweis: Diese 1 uM Arbeitskonzentration mehrfach für die wiederholte Transfektionen gefrieraufgetaut werden kann.
2. Platzieren DMEM + 10% FCS,vor erwärmen verwenden 0,05% für 30 min in einem 37 ° C Wasserbad (oder ein Äquivalent) Trypsin-EDTA und PBS;.
3. Herstellung von Transfektionskomponenten:
   Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für HeLa-229-Zellen in einer 96-Well-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und flachen, transparenten Boden optimiert. Optimierung der Menge des Transfektionsreagenz, die Konzentration der siRNA und Einsaatdichte von Zellen für verschiedene Zelllinien erforderlich.
   1. Für jede Vertiefung wurden 0,1 ul Transfektionsreagenz verwenden, 15,9 ul reduzierten Serum Medium und 4 ul von 1 uM siRNA (was zu einer endgültigen siRNA - Konzentration von 40 nM) (minimal essential Medien für Transfektionen siehe Tabelle der verwendeten Materialien). Verwenden Sie separate Mikrozentrifugenröhrchen für OTP, PLK1, RAB5A und Rab7A. Messen Sie jeden Testbedingungen in dreifacher Ausfertigung. Ein Beispiel einer 96-Well - Platte Layout wird in Abbildung 3 dargestellt.
      Hinweis: Dieses Protokoll umfasst die Verwendung von zwei Steuerungen: OTP und PLK1. OTP istbestehend aus vier gepoolten siRNA, die optimiert wurden, Nebeneffekte zu reduzieren und somit wird OTP als negative, nicht-Targeting-Kontrolle verwendet. Verwürfelten siRNA könnte auch als negative Kontrolle verwendet werden. Verlust von PLK1 Expression zu ausgedehnten Zelltod in einer Reihe von Zelllinien durch pro-apoptotische Wege induzieren und daher PLK1 siRNA als positive Kontrolle für die Transfektionseffizienz verwendet, bei denen Zelltod Transfektionseffizienz korreliert.
      1. Für jede experimentelle siRNA-Transfektion, kombinieren 0,4 ul Transfektionsreagenz und 63,6 ul reduzierten Serum Medium in einem einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex alle Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Komponenten Komplex für 5 min bei RT.
      2. Hinzufügen, 16 ul von jeder experimentellen siRNA in die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen Transfektionskomplex enthält. Vortexen und 20 min bei RT inkubiert. Hinweis: Es ist wichtig, nicht mehr als 30 min zu überschreiten, da die Transfektionseffizienz verringern.
4. Während der 20 min incubation (2.3.1.2) 20 ul des Transfektionsreagenz hinzufügen + reduziertem Serum - Medium + siRNA in die Vertiefungen einer sterilen schwarz, flach klarer Boden 96-Well - Fach ein .
5. Sobald die 20 min Inkubationszeit vollständig, Saatgut HeLa 229 - Zellen bei einer Dichte von 3,92 × 10 ³ Zellen / Vertiefung.
   1. Ernte HeLa 229 - Zellen aus einem konfluenten oder subkonfluenten 75 cm ² Gewebekulturkolben in vorgewärmten DMEM + 10% FCS und resuspendieren Zellen zu einer Enddichte von 4,9 × 10 ⁴ Zellen / ml nach Standardmethoden. Um sicherzustellen , dass die Transfektionseffizienz nicht beeinträchtigt wird, bereiten Zellen während der 20 Minuten Inkubationszeit (2.3.1.2).
      1. Wasche die Monoschicht von HeLa 229-Zellen zweimal mit 10 ml vorgewärmtes PBS.
      2. 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA - Lösung und statt 229 HeLa - Zellen bei 37 ° C + 5% CO ₂ für 3 bis 5 min Zellen abzulösen.
      3. Sammeln Zellen in 9 ml vorgewärmtem DMEM + 10% FCS. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und DMEM + 10% FCS unter Verwendung von Zellen auf eine Enddichte von 4,9 × 10 ⁴ Zellen / ml herzustellen.
   2. Pipette 80 ul HeLa 229 - Zellen bei einer Dichte von 4,9 × 10 ⁴ Zellen / ml in jeder Vertiefung, die das Transfektionsreagenz + reduzierte serumhaltigem Medium + siRNA Mischung enthält. Dies entspricht einer Zelldichte von 3,92 × 10 ³ Zellen / Vertiefung.
      Hinweis: Hintergrundkorrektur ist für das BlaM Substrat erforderlich.
      1. Fügen Sie keine Zellen oder siRNA zu "leeren" Brunnen (Abbildung 3). Stattdessen fügen 80 ul DMEM + 10% FCS auf diese Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung eingerichtet.
   3. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C + 5% CO _2.

3. Ändern Medien (TAG 5)

1. Nach 24 Stunden entfernen Medien einen Mehrkanal-Adapter mit einer Vakuumquelle oder manuell mit einer Mehrkanalpipette angebracht verwendet und ersetzen mit 100 ul frisch vorwärmened DMEM + 10% FCS.
2. Inkubieren für weitere 48 h bei 37 ° C + 5% CO _2.
3. An diesem Punkt überprüfen die Lebensfähigkeit der Zellen optisch ein Standard-Lichtmikroskop. Wenn die umgekehrte Transfektion erfolgreich war, signifikante Zelltod wird in den Vertiefungen, enthaltend PLK1 siRNA Vergleich zu OTP siRNA beobachtet werden.

4. Quantifizierung von Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm mit qPCR (Tag 7)

1. Nach 7 Tagen Wachstum in ACCM-2 bei 37 ° C in 5% CO _2, 2,5% O ₂ (1.3), der Zentrifuge 10 ml C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
2. Re-suspendieren das Bakterienpellet in 10 ml des vorgewärmten DMEM + 10% FCS. Bereiten 1:10 und 1: 100 Verdünnungen der Kultur (Probe) unter Verwendung von dH ₂ O.
3. Richten Sie die Komponenten für die qPCR erforderlich.
   Hinweis: gDNA Extraktion kann im voraus und bei -20 ° C durchgeführt werden until erforderlich.
   1. Ausarbeitung von Normen:
      1. Auszug gDNA von Coxiella burnetii RSA439 NMII Wildtyp - Stamm gewachsen in ACCM-2 bei 37 ° C in 5% CO _2, 2,5% O ₂ für 7 Tage mit einem gDNA - Extraktions - Kits, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      2. Messen der gDNA-Konzentration (g / & mgr; l), um eine Nanodrop (oder Äquivalent) bei einer Absorption von 260 nm verwendet wird.
      3. Berechnung der Anzahl der Genomkopien pro ul der folgenden Formel unter Verwendung von und zu konvertieren Anzahl von Genomen / ml.
         
      4. Stellen Sie die Anzahl von Genomen / ml bis 10 ⁹ / ml (in einem Endvolumen von 100 & mgr; l) in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von dH ₂ O. Dies kann für 10 min und bei -20 ° C gekocht werden, bis sie benötigt wurden.
      5. Am Tag der Infektion erzeugen 10fache Reihenverdünnungen von 10 ⁸ Genome / ml bis 10 ⁵ Genomen / ml von der 10 ⁹ Genoms / ml Lager.
         1. Pipette 10 ul 10 ⁹ Genome / ml in 90 ul dH & _sub2 ; O 10 ⁸ Genome / ml zu erzeugen. Vortex mischen. Pipette 10 ul 10 ⁸ Genome / ml in 90 ul dH & _sub2 ; O 10 ⁷ Genomen / ml zu erzeugen. Vortex und wiederholen , bis 10 ⁵ Genomen / ml.
   2. Richten Sie qPCR Reaktion. Erstellen Sie einen Master-Mix für 25 Brunnen für alle Pipettierfehler zu berücksichtigen. Für jede Vertiefung verwenden 10 ul qPCR Master Mix; 2 ul ompA Zündmittelgemisch (4.3.2.2) und 3 & mgr; l dH ₂ O.
      Hinweis: OmpA ist ein Außenmembranprotein von C. burnetii ^'39 und ein 82-Basenpaar - Abschnitt innerhalb einer hochkonservierten Region wurde zur Verwendung als Sonde ausgewählt , wie zuvor beschrieben ^40.
      1. Einrichten jeden Standard (dH ₂ O, 10 ^5, 10 ^6, 10 ^7, 10 ^8, 10 ⁹ Genome / ml) und Probe (1:10 und 1: 100 Verdünnung) in eine 96-well PCR losreißen Platte (nicht umsäumte) doppelt oder dreifach sind. In 5 ul Probe oder Standard in die Vertiefungen.
      2. Verwendung von dH ₂ O, verdünnter sowohl die ompA Vorwärtsprimer (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') und ompA - Rückwärtsprimer (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') bis zu einer Endkonzentration von 4 & mgr; M und verbinden sich zu dem gleichen Mikrozentrifugenröhrchen.
         Hinweis: Das ompA Zündmittelmischung kann im Voraus gespeichert und bei -20 ° C hergestellt werden , bis sie benötigt wurden .
      3. Kombinieren Sie 250 ul qPCR Master Mix, 50 ul ompA - Primer - Gemisch, 75 & mgr; l dH ₂ O und Wirbel zu mischen. In 15 ul dieses Mastermixes in die Vertiefungen entweder Standards oder Proben enthalten.
      4. Legen Sie 8-Deckel PCR Streifen Kappen auf die entsprechenden Vertiefungen und pulszentrifugieren PCR-Röhrchen alles, um sicherzustellen, ist im Boden der Röhrchen gesammelt.
      5. Stellen Sie das folgende Programm auf einer quantitativen PCR ma upchine: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 1 sec und 60 ° C für 20 sec (4A).
   3. Analysieren Sie den Ct (cycle threshold) Werte aus der qPCR:
      1. Übertragen Sie die Ct-Werte in eine Tabelle mit der Exportfunktion des Programms.
      2. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Standards 10 ⁵ Genomen / ml bis zu 10 ⁹ Genome / ml (als Log - Werte ausgedrückt). Entsorgen Sie alle offensichtliche Ausreißer unter den dreifachen Proben. Generieren Sie eine logarithmische Trendlinie und bestimmen die Gleichung des Graphen.
      3. Berechnen der Gesamtzahl der Genome / ml in der Probe durch die Gleichung in 4.3.3.2 erzeugt. Vergessen Sie nicht, für die anfängliche Verdünnung zu berücksichtigen (1:10 und 1: 100) der Proben.

5. Die Infektion von Reverse-transfizierter Zellen (Tag 7)

1. Nachdem die gesamten Genome / ml in der C Berechnung Klettenetii pBlaM-CBU0077 Kultur zur Infektion verwendet werden, stellen Bakterienkultur resuspendierten Zellen bei einer MOI von 300 in einem Endvolumen von 50 ul zu infizieren / Vertiefung unter Verwendung vorgewärmtem DMEM + 10% FCS.
   Anmerkung: Die erwartete Dichte der beimpften HeLa 229 - Zellen mit einer normalen Verdopplungszeit nach 72 h 3,136 × 10 ⁴ Zellen / Vertiefung. Die Menge an Bakterien bei einem MOI von 300 infiziert erforderlich ist 9,408 × 10 ⁶ in 50 & mgr; l, das auf 1,88 × 10 ⁸ Bakterien / ml entspricht.
   1. Unter Verwendung des Wertes aus den qPCR berechnet (Genome / ml) (4.3.3.3), verdünnen die resuspendierten Bakterien mittels vorgewärmten DMEM + 10% FCS in einem Gesamtvolumen von 2 ml , die Reverse - transfizierten Zellen zu infizieren.
2. Entfernen Sie den vorhandenen Medien aus dem Rohling und transfizierten Zellen umkehren.
3. In 50 ul der verdünnten Bakterien (1,88 × 10 ⁸ Bakterien / ml) in die entsprechenden Vertiefungen. Zugabe von 50 & mgr; l DMEM + 10% FCS sowohl mit dem Rohling und uninfected Brunnen.
4. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C + 5% CO _2.

6. Zugabe von BlaM Substrat zu bestimmen Niveau Translokation (TAG 8)

1. Bereiten Sie die Lösungen für die BlaM Substrat 6x Beladungslösung.
   Hinweis: Lösung A, B und C sind vorgesehen , innerhalb des BlaM Substrat Kit (Siehe Tabelle der Materialien). Lösung B kann einen Niederschlag bei RT bilden. Erwärmen, diese Lösung auf 37 ° C vor der Verwendung und der Niederschlag sollte aufzulösen.
   1. Wenn das Kit zum ersten Mal verwenden, fügen Sie 185 ul DMSO (mit dem BlaM Substrat-Kit mitgeliefert) an die ausgetrockneten Lösung A. Anschließend speichern Sie die resuspendierten Lösung A bei -20 ° C.
   2. Bereiten 0,1 M Probenicid Lösung im Voraus und lagern in 1 ml Aliquots bei -20 ° C, bis sie benötigt.
      1. Bereiten 0,4 M NaOH (1,6 g in 100 ml dH ₂ O).
      2. Herstellung von 100 mM Na - Phosphatpuffer pH 8 (1,56 g NaH ₂ PO ₄ .2H ₂ HPO ₄ in 100 ml dH ₂ O).
      3. Man löst 1,25 g Probenicid in 22 ml von 0,4 M NaOH unter kräftigem Rühren.
      4. In 22 ml 100 mM Na-Phosphat-Puffer pH 8 (Lösung wird trüb) und rühren Sie die sich bildende Niederschlag aufzulösen.
      5. Der pH-Wert 8 (falls erforderlich) unter Verwendung von 1 M NaOH / HCl.
      6. Gut durchrühren und erhitzen mild (<50 ° C), bis die Lösung meist klar.
      7. Filter (0,2 & mgr; m Porengröße) und aliquoten in 1 ml Volumen. Store Aliquots bei -20 ° C.
2. Für jede Vertiefung verwenden 0,06 ul Lösung A, 0,54 ul Lösung B, 7,9 ul Lösung C und 1,5 ul 0,1 M Probenicid. Erstellen eines Master-Mix für 30 Vertiefungen, indem zuerst 1,8 ul Lösung A und 16,2 ul Lösung B zusammen in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert. Gut mischen einen Wirbel verwenden. Hinzufügen 237 ul Lösung C und 45 ul 0,1 M Probenicid. Vortex zu vereinen alle components.
   Hinweis: Die 6x Ladelösung für bis zu 4 Stunden (im Dunkeln) stabil ist, aber sollte so nah wie möglich vor der Anwendung hergestellt werden.
3. In 10 ul der 6-fachem Beladungslösung direkt in alle leer und Reverse-transfizierten Brunnen, ohne die vorhandene Medien zu entfernen.
4. Inkubiere die Platte bei RT für 2 h im Dunkeln.
5. Um das Niveau der Translokation bestimmen, quantifizieren die Menge der Fluoreszenz eines Mikroplattenleser.
   Hinweis: Das folgende Verfahren ist spezifisch für die ClarioSTAR Mikroplatten-Reader. Equivalent Mikrotiterplatten-Leser können ebenfalls verwendet werden.
   1. Erstellen Sie eine neue Fluoreszenzintensität Protokoll Endpunkt als Lesemodus.
   2. Passen Sie die grundlegenden Parameter wie folgt:
      1. Wählen Sie 96-well Mikrotiterplatten.
      2. Unter Optik-Einstellungen wählen Sie 2 multichromatics mit den folgenden benutzerdefinierten Einstellungen: (1) Eingang 410-10 nm Anregung und 520-10 nm-Emission. (2) Eingaben 410-10 nm Anregung und 450-10 nm-Emission. Stellen Sie sicher, gut multichromatics ausgewählt ist.
      3. Wählen orbital Lungs mit einem Durchmesser von 3 mm.
      4. Unter Optik, untere Optik aus.
      5. Unter Geschwindigkeit und Präzision, wählen Sie präzise. Dies entspricht acht Regionen pro Vertiefung.
   3. Stellen Sie den Plattenlayout, indem Sie die entsprechenden Wells als Proben ausgewählt.
   4. Wählen Sie das Startmessung.
   5. Entfernen Sie den Deckel und legen Sie das Fach in den Plattenleser. Um zu vermeiden, maximale Fluoreszenzwerte zu erreichen, stellen Sie sicher der Verstärkungswert eingestellt wird. Dazu führen Sie so eine Verstärkungseinstellung an einem der infizierten Wells, die Reverse-transfiziert mit OTP siRNA wurde. Dies entspricht der höchsten erwarteten Translokation.
   6. Wählen Sie das Start Messung alle geeigneten Vertiefungen mit Boden Fluoreszenz bei einer Anregung von 410 nm und einer Emission von sowohl 450 nm und 520 nm für blaue und grüne Fluoreszenz zu messen sind.

7. Analyse der Ergebnisse:

1. Berechnen Sie das Verhältnisvon 450 nm bis 520 nm (blau bis grün) für alle Proben nach Leer Reduktion und zur nicht infizierten OTP Probe relativ auszudrücken.
   Hinweis: Die folgenden Analyseschritte sind für ein einfaches Kalkulationsprogramm zur Verfügung gestellt.
   1. Mit der Exportfunktion auf den Mikroplatten - Reader, übertragen Sie die Rohwerte Fluoreszenz sowohl für 520 nm und 450 nm Emissionswellenlängen erhalten (6,5) in eine Tabelle.
   2. Berechnen Sie den Mittelwert der "leeren" Lesungen (Medien nur, keine Zellen) für die 520 nm Wellenlänge durch Zugabe der rohen 520 nm Fluoreszenzwerte und dividiert durch die Anzahl der Vertiefungen (3). Wiederholen Sie die Leer 450 nm Wellenlänge Werten. Diese Werte stellen die Hintergrundfluoreszenz aufgrund der 96-Well-Platte und Medien.
   3. Ziehen Sie die Hintergrundfluoreszenz. Unter Verwendung der erhaltenen Werte in 7.1.2 subtrahieren den Mittelwert des Rohlings 520 nm Wellenlänge , die von allen Proben 520 nm Fluoreszenzwerte. Wiederholen Sie dies für die 450 nm Wellenlänge Werte.
   4. So erhalten die 450: 520 nm Verhältnis der Leer korrigierten Werte verwenden (7.1.3). Teilen Sie jede Probe 450 nm Fluoreszenzwert durch seine 520 nm Wert entspricht.
   5. Berechne den Mittelwert der nicht infizierten OTP Verhältniswerte durch die Zugabe von 450: 520 nm Verhältniswerte (von 7.1.4) und Dividieren durch die Anzahl von Vertiefungen (3).
   6. Berechnen des Verhältnisses der Proben relativ zu uninfizierten OTP durch das Dividieren 450: in 7.1.4 durch den Durchschnitt der nicht infizierten OTP Verhältniswert in 7.1.5 berechneten 520 nm - Verhältnis.

8. Zugabe von Nuclei Stain zu bestimmen Zellzahl nach der Translokation Assay (TAG 8)

1. Folgende Quantifizierung der Fluoreszenz, entfernen Medien mit 6x Beladungslösung aus allen Vertiefungen unter Verwendung von entweder einem Mehrkanaladapter an eine Vakuumquelle angeschlossen oder von Hand mit einer Mehrkanalpipette.
2. In 50 ul 4% PFA (Paraformaldehyd) Lösungin PBS zu allen geeigneten Vertiefungen Zellen zu fixieren. 20 min bei RT inkubiert.
3. Entfernen Sie die 4% PFA PBS - Lösung (gemäß 8.1) und waschen Sie die Zellen zweimal mit 75 ul PBS.
4. Werden 50 ul einer Zell permeable Kernfärbung, beispielsweise DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol), zu jeder Vertiefung. Erwerb von Bildern mit einem Fluoreszenzmikroskop und zu quantifizieren , die Anzahl der Kerne , die in jeder Vertiefung nach siRNA Behandlung mit geeigneten Bildanalysesoftware, wie ImageJ ^41.

Für diese Studie wurden die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm wurde ausgewählt als CBU0077 wurde zuvor ein transloziert Effektor des Coxiella Dot / Icm Sekretionssystem 17 gezeigt ist. Vor der Infektion, die Gesamtzahl der Genome / ml in der 7 Tage C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur aufgezählt wurde qPCR unter Verwendung dar. 4 zeigt ein Beispiel des Zyklus Schwellenwert (Ct) -Werte von beiden Standards erwartet und Proben nach qPCR. Die Ct - Werte ( der grafischen Darstellung im Amplification Plot (4B) und numerisch (4C)) wurden in 4.3.3 beschrieben exportiert und analysiert. Auf der Grundlage der repräsentativen Daten gezeigt wird , gab es 2,31 × 10 8 Genome / ml in der 10 ml resuspendiert Bakterienkultur (4D). Um die geeignete bakterielle Verdünnung erzeugen (1,88 × 10 8 Genome / ml in 2 ml), 1,63 ml der resuspendierten Bakterien wurden zu 370 & mgr; l frischem, vorgewärmten DMEM + 10% FCS. Zellen mit siRNA transfizierten Reverse wurden anschließend mit C infiziert burnetii pBlaM-CBU0077 bei einer MOI von 300 für 24 Std.

Nach der Inkubation der reversen transfizierten-infizierten Zellen mit BlaM Substrat Quantifizierung von Effektorzellen Translokation kann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät bestimmt werden. Nach der Analyse , wie in 7, alle Verhältniswerte beschrieben, die auf nicht - infizierte OTP normalisiert worden sind , auch auf infizierte OTP normalisiert werden. Die Höhe der Effektor-Translokation nach Genen von Host-Silencing kann in drei Ergebnisse nach Vergleich zu infizierten OTP Steuerung gruppiert werden: (1) Keine Änderung; (2) Effektor Translokation erhöht wird; (3) Verringerte Effektor-Translokation. Die anschließende statistische Analyse, zum Beispiel ein Student t - Test, kann die Bedeutung jeder beobachtete Differenz t zu bestimmen , verwendet werden ,o infiziert OTP Kontrolle. Das Ergebnis entweder RAB5A oder Rab7A auf Effektorzellen Translokation aus drei unabhängigen Experimenten Silencing wird in 5A gezeigt. Eine signifikante Abnahme in der Höhe der BlaM-CBU0077 Translokation aufgetreten beide RAB5A und Rab7A im Vergleich zu OTP Kontrolle während der Silencing (p - Wert = 0,0088 (RAB5A) und p - Wert = 0,0059 (Rab7A), paarig, Student t - Test). Die Auswirkungen der siRNA-Behandlung auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auch festgestellt. Nach der Translokation Assay wurden die Zellen fixiert, mit Kernen Färbung gefärbt und anschließend quantifiziert. Wie in 5C gezeigt, obwohl die Behandlung mit entweder RAB5A oder Rab7A führt zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu OTP Kontrolle (12% bzw. 31% betrugen), ist diese Verringerung nicht so schwerwiegend wie PLK1 ist (97%), ein Gen , bekannten um zu bewirken Zelltod (p-Wert = 0,0102 (RAB5A); p-Wert = 0,0081 (Rab7A); p-Wert <0,0001 (PLK1), paarig, Student t-Test). Diese Ergebnisse zeigen, wie der Host-Silencing-genes siRNA verwendet, kann sich negativ auf die Ebenen der bakteriellen Effektor-Translokation verändern.

Abbildung 1. Der Wirkmechanismus des BlaM Substrat während der Infektion. C. burnetii wird von Wirtszellen aufgenommen und bildet eine Lysosom abgeleitete Vakuole die Coxiella -haltigen Vakuole bezeichnet. 24 Stunden nach der Infektion werden die Zellen mit der Membran permeabel BlaM Substrat geladen , das zwei Fluorophore Bilden eines FRET - Paars (A) besitzt. In der Abwesenheit von β-Lactamase dh keine Translokation des BlaM-CBU0077 Effektor, Anregung des Coumarin an 410 nm Ergebnisse in FRET zu Fluorescein, als grünes Fluoreszenzsignal beobachtet (520 nm) (B). im Falle eines funktionellen Dot / Icm Sekretionssystem, das BlaM-CBU0077 Fusionsprotein wird in die Wirtszelle transloziert und cleave das BlaM Substrat, über β-Lactamase - Aktivität, die Trennung der beiden Farbstoffe verursachen und was zu FRET Unterbrechung und einem blauen Fluoreszenzsignal (450 nm) nach Anregung bei 410 nm (C). Die beiden grünen und blauen Fluoreszenzsignale können sein mit Hilfe eines Fluoreszenzplattenlesegerät erkannt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

. Abbildung 2. Schematische Übersicht über die Reverse - Transfektion und Translokation Assay Workflow - Tag 1: Bereiten Sie die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur . 4. Tag: Reverse - transfizierbaren unter Verwendung von 40 nM siRNA und Samen HeLa - 229 - Zellen bei einer Enddichte von 3,92 × 10 3 Zellen / Well in einer 96-Well - Fach Tag 5: Ch .ange Medien . 7. Tag: Quantifizieren die gesamten Genome / ml des C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur qPCR verwendet und anschließend infizieren Reverse - Zellen , die mit einer MOI von 300 . 8. Tag: In 6x Lade Farbstoff, Fluoreszenz messen und die Zellzahl quantifizieren Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Die 96-Well - Platte - Layout verwendet , um den Reverse - Transfektion und Seeding von HeLa - 229 - Zellen ein. Die "leeren" Brunnen (in rot dargestellt) enthalten Medien nur und brauchen nicht auf die Zugabe von entweder siRNA oder HeLa - 229 - Zellen. Die OTP siRNA (in hellblau für nicht infizierte Brunnen und dunkelblau für infizierte Brunnen gezeigt) ist als nicht-Targeting-Steuerung verwendet, da es optimiert wurdeweniger Nebeneffekte haben. Die kastanienbraun und grün Brunnen stellen die RAB5A und Rab7A siRNA, respectively. PLK1 siRNA (gelb dargestellt) als Maß für die Transfektionseffizienz verwendet wird als Verlust der PLK1 - Expression kann pro-apoptotische Wege induzieren und umfangreiche Zelltod in einer großen Mehrheit der Zelllinien. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Repräsentative qPCR Ct - Werte verwendet , um die Gesamtzahl der Genome / ml in C quantitativ zu bestimmen burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur. (A) Die Zyklusbedingungen in der qPCR verwendet , um die Anzahl der Genome / ml in Coxiella Kulturen aufzuzählen. Die Ct - Werte für beide Standards und Proben werden in grafischen (B) und numerische (C) dargestellt wirdFormate. (D) Die Standard - Ct - Werte wurden gemittelt, grafisch dargestellt und eine logarithmische Trendlinie berechnet. Unter Verwendung der Gleichung und die Mittelwerte der Probe Ct schätzt die Gesamtzahl der Genome / ml in der C burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur wurde bestimmt 2,31 × 10 8 sein. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Translokation des Dot / Icm Effektor BlaM-CBU0077 während siRNA Silencing von RAB5A und Rab7A. HeLa - 229 - Zellen wurden Reverse - transfiziert mit siRNA spezifisch RAB5A (kastanienbraun Balken), Rab7A (grüne Balken), OTP (blaue Balken) oder PLK1 (gelbe Balken) und 72 Stunden vor der Infektion mit dem C inkubiert burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm bei einer MOI von 300 für 24 Stunden. Nach ter Zugabe des BlaM Substrat, Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten - Lesegerät gemessen (A) Die Tabelle der rohen Fluoreszenzwerte zeigt , aus einem einzigen Experiment erhalten neben dem 450:. 520 nm - Verhältnis in Bezug auf nicht - infizierte OTP Kontrolle nach Abzug der Leerwerte (Medien nur, keine Zellen). Die Höhe der Translokation (B) und die Lebensfähigkeit der Zellen (C) als Prozentsatz Mittelwert ± Standardabweichung , bezogen auf OTP Reverse transfizierten infizierten Zellen aus drei unabhängigen Experimenten dargestellt. * P-Wert <0,05; ** P-Wert <0,01; **** P-Wert <0,0001 (gepaart, Student t -Test). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1. Die Komponenten erforderlich , um 1x ACCM-2.

Tabelle 2. Volumen von 1x siRNA Buffer Erforderlich für Feuchtigkeitsspend Lyophilized siRNA auf die geeignete Konzentration.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.