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Methodenartikel

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch

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DOI:

10.3791/54210

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6. Juli 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, University of Melbourne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Erregern und ihren Wirten ist ein wichtiger Bereich der biologischen Forschung. Hier beschreiben wir die notwendigen Techniken Effektor - Translokation durch Coxiella burnetii während siRNA Gen - Silencing mit BlaM Substrat zu messen.

Zusammenfassung

Coxiella burnetii, der Erreger des Q - Fiebers, ist ein intrazelluläres Pathogen , das IV Dot / Icm Sekretionssystem auf einer Art setzt eine replikative Nische zu etablieren. Eine Kohorte von Effektoren werden durch dieses System in die Wirtszelle Host-Prozesse transloziert und ermöglichen die Schaffung eines einzigartigen Lysosom abgeleiteten Vakuole für die Replikation zu manipulieren. Die hier vorgestellte Methode beinhaltet die Kombination von zwei gut etablierte Techniken: spezifische Silencing Gen siRNA und Messung der Effektor-Translokation mit einem FRET-basierten Substrat verwenden, die auf β-Lactamase-Aktivität beruht. Die Anwendung dieser beiden Ansätze können wir damit beginnen, die Rolle von Wirtsfaktoren in bakteriellen Sekretionssystem Funktion und Effektor-Translokation zu verstehen. In dieser Studie untersuchten wir die Rolle der RAB5A und Rab7A, die beide wichtige Regulatoren des endocytic Handel Weg. Wir zeigen, dass eine Abnahme der Effektor translocatio die Expression von Protein Ergebnisse Silencingn Effizienz. Diese Verfahren können leicht modifiziert werden, um andere intra- und extrazellulären Krankheitserregern zu untersuchen, die auch die Sekretion Systeme nutzen. Auf diese Weise kann aufgedeckt werden ein globales Bild Faktoren Wirt in bakteriellen Effektor-Translokation beteiligt.

Einleitung

Coxiella burnetii ist ein einzigartiges intrazelluläre Erreger der zoonotischen Infektionen beim Menschen Q - Fieber verursacht. Diese Krankheit wird mit einem breiten Spektrum von klinischen Präsentationen im Zusammenhang von asymptomatischen Serokonversion zu lebensbedrohlichen chronischen Infektion erstreckt , die als Endokarditis Jahre nach der Exposition 1 oft manifestiert. Die Infektion des Menschen erfolgt in erster Linie durch das Einatmen von kontaminierten Aerosolen mit Wiederkäuern der großen Reservoir für Infektionen, insbesondere Milchkühe, Schafe und Ziegen. Obwohl Coxiella Infektion bei diesen Tieren der Regel subklinischen ist, kann die Infektion Abtreibung auslösen und die erhebliche bakterielle Belastung innerhalb der Entbindungs ​​Flüssigkeit und Plazenta kann die lokale Umgebung 1 verunreinigen. Ein Beispiel für die enorme Belastung eine solche Kontamination kann sowohl auf die öffentliche Gesundheit haben und die Agrarindustrie vor kurzem in der Q - Fieber - Ausbruch beobachtet wurde , die in den Niederlanden 2 aufgetreten ist . Zwischen 2007 und2010 mehr als 4.000 menschliche Fälle von Q - Fieber diagnostiziert wurden und dieser Ausbruch zu erheblichen Kontamination von Ziegenbetriebe 3 wurde verknüpft. Darüber hinaus ist Coxiella eine potenzielle biologische Waffe, wie für Disease Control von den US Centers klassifiziert und Prävention, durch die Umweltstabilität der Bakterien und geringe Infektionsdosis erforderlich schwere Morbidität und Mortalität 4 zu verursachen.

Coxiella existiert in zwei Phasen: Phase I Organismen, isoliert aus natürlichen Quellen, sind extrem virulent und Phase - II - Organismen in vivo stark gedämpft. Beispielsweise nach mehreren in vitro Passagen Coxiella burnetii Nine Mile Phase I Organismen, Phase II Bakterien produziert wurden , die eine irreversible chromosomale Deletion in abgeschnittene Lipopolysaccharid (LPS) enthalten 5. Dieser Stamm, C. burnetii NMII ist phänotypisch ähnlich ich in Gewebekulturmodellen zu Phase und bietet einen sichereren Modusl für Forscher Coxiella Pathogenese in Laboratorien zu untersuchen 5. In den letzten Jahren haben mehrere Durchbrüche auf dem Gebiet der Genetik Coxiella rasch vorangetrieben . Vor allem die Entwicklung von axenic Medien (Citrat Cystein Medium angesäuert - ACCM-2) hat die zellfreie Wachstum von Coxiella sowohl in flüssiger und auf festen Medien 6,7 erlaubt. Dies führte zu direkten Verbesserungen der genetischen Werkzeuge zur Verfügung , für Coxiella einschließlich eines induzierbaren Genexpressionssystem, Shuttle - Vektoren und zufällige Transposon - Systeme 11.08. In jüngster Zeit werden zwei Verfahren zur gezielten Geninaktivierung sind ebenfalls entwickelt worden, die den Weg für 12 spezifische Virulenzgen Kandidaten untersucht.

Folgende Internalisierung durch Alveolarmakrophagen, repliziert Coxiella zu hohen Zahlen innerhalb eines membrangebundenen Kompartiment bezeichnet die Coxiella- enthält Vakuole (CCV). Der CCV erfordert Host endocytic Handel thrau frühen und späten Endosomen , bis es reift in ein Lysosom abgeleiteten Organell 13. Im Laufe dieses Prozesses erwirbt der CCV Wirtsfaktoren , die entweder vorübergehend erscheinen oder bleiben mit der Vakuole verbunden sind , einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Rab5, Rab7, CD63 und LAMP-1 . 13-15 Die Replikation von Coxiella innerhalb von Wirtszellen ist völlig abhängig von einem voll funktionsfähigen Dot / Icm Typ IVB - Sekretionssystem (T4SS) 8,16,17. Dieses Sekretionssystem ist ein Multi-Proteinstruktur ancestrally Konjugation Systemen und erstreckt sich über sowohl bakterielle als auch vacuolar Membranen bakterielle Proteine ​​zu liefern, bezeichnet als Effektoren in das Wirts Zytoplasma 18. Die Coxiella T4SS funktionell sehr ähnlich dem gut charakterisierten Typ IVB Dot / Icm Sekretionssystem von Legionellen pneumophila 19,20. Interessanterweise Aktivierung des T4SS und nachfolgende Translokation Effektor nicht auftritt , bis die saure Coxiella Lysosom-derived erreichtOrganell, etwa 8 Stunden nach der Infektion 17,21. Bis heute sind über 130 Dot / Icm Effektoren wurden 9,17,22-24 identifiziert. Viele dieser Effektoren spielen wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Replikation von Coxiella in Wirtszellen; jedoch nur wenige Effektoren wurden funktionell 25-29 charakterisiert.

In dieser Studie nutzen wir eine fluoreszenzbasierten Translokation Assay, der auf der Spaltung des (bezeichnet im Folgenden als BlaM Substrat) CCF2-AM FRET Substrat stützt über β-Lactamase - Aktivität in der Wirtszelle Zytoplasma (Abbildung 1). Das Gen von Interesse fusioniert an TEM-1-β-Lactamase (BlaM) auf einem Reporterplasmid, das eine konstitutive Expression sorgt. Das BlaM Substrat besteht aus zwei Fluorophore (Cumarin und Fluorescein), die ein FRET-Paar bilden. Anregung der Cumarin Ergebnisse in FRET des Fluorescein und grüne Fluoreszenzemission in Abwesenheit von Effektorzellen Translokation; Wenn jedoch die BlaM-Effektor-Fusionsprotein wird in das Wirts Zytoplasma transloziert, die sich ergebende β-Lactamase-Aktivität spaltet die β-Lactam-Ring des BlaM Substrat, wobei das FRET-Paar produzieren blaue Fluoreszenzemission nach Anregung zu trennen. Diese Translokation Assay wurde als ein Ansatz zur Identifizierung Effektor - Proteine ​​aus einer Reihe von verschiedenen intra- und extrazellulären Bakterien gut bewährt, einschließlich C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, darmpathogene E. coli, Salmonella und Brucella 17,30-35.

Um die Rolle der spezifischen Wirtsfaktoren auf Coxiella Effektor Translokation bestimmen verwenden wir ein gut etabliertes Verfahren zur Gen - Silencing als RNA - Interferenz bekannt, insbesondere small interfering RNA (siRNA). Ursprünglich in Caenorhabditis elegans identifiziert, ist die RNA - Interferenz ein konserviertes endogenen zellulären Prozess für angeborene defe verwendetnse gegen Viren sowie der Genregulation 36,37. Von sequenzspezifischen siRNA, Abbau von mRNA erfolgt durch RISC (RNA-induced silencing complex) , was zu spezifischen Gen - Silencing oder Zuschlags 38 nach der Bindung. In dieser Studie wurde siRNA zwei Wirtsproteine ​​zu zielen, RAB5A und Rab7A, die wichtige Regulatoren des endocytischen sind. Die Auswirkungen der RAB5A und Rab7A auf Effektor - Translokation zum Schweigen zu bringen wurde mit C ermittelt burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 ausgewählt wurde , wie es zuvor durch die Dot / Icm Sekretionssystem von Coxiella 17 transloziert werden , wurde gezeigt.

Unter Verwendung sowohl siRNA Gen - Silencing und die fluorescencebased Translokation Assay hier beschrieben, beginnen wir eine Rolle für die Wirtsfaktoren bei der Translokation von Effektor - Proteine ​​, die durch Coxiella zu etablieren. Dieser Ansatz kann auf eine breite Palette von sowohl intra- und extrazellulären Bakterien angewendet werden, die ähnliche secretio besitzenn-Systeme, die für die Translokation von Effektor-Proteine.

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Protokoll

Hinweis: Alle Verfahren , das Wachstum oder die Manipulation von Coxiella burnetii RSA439 NMII Beteiligung sollte in einem physikalischen Sicherheitsstufe 2 Labor und in einem biologischen Sicherheitsschrank unter Beachtung der örtlichen Richtlinien durchgeführt werden. Ein schematisches Diagramm der reversen Transfektion und Translokation Assay Workflow unten beschrieben ist in Abbildung 2 dargestellt.

1. Herstellung von C. burnetii Kultur Ausdruck CBU0077 Fused zu ß-Lactamase (pBlaM-CBU0077) (Tag 1)

  1. Bereiten 1X ACCM-2 6:
    1. Kombinieren Sie die aufgeführten Komponenten in Tabelle 1 aufgeführt . Der pH - Wert auf 4,75 mit 6 M NaOH und Filter zu sterilisieren (Sterilisieren nicht). ACCM-2 ist für ca. drei Wochen gelagert bei 4 ° C stabil.
  2. Generieren C. burnetii pBlaM-CBU0077 Aktien.
    1. Infect HeLa 229 - Zellen mit dem C. burnetii Stamm trägt pBlaM-CBU0077 und Passage bis große vacuoles werden in der Mehrzahl der Zellen beobachtet.
      1. Wachsen die C. burnetii Stamm trägt pBlaM-CBU0077 in 20 ml ACCM-2 , enthaltend 3 & mgr; g / ml Chloramphenicol in einem 75 cm 2 Gewebekulturflasche mit belüftete Kappe für 7 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2.
      2. Zentrifugieren Sie die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
      3. Resuspendieren des Pellets in 20 ml DMEM + 10% fötales Kälberserum (FCS) + 3 & mgr; g / ml Chloramphenicol (Erhaltungsmedium). Entfernen Sie das Medium aus einer 50% konfluenten 75 cm 2 Kolben von HeLa - 229 - Zellen. In resuspendierten C. burnetii zu HeLa - 229 - Zellen. Inkubieren für 2 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2 Infektion von HeLa - 229 - Zellen zu ermöglichen , zu schaffen.
      4. Split - Zellen in 175 cm 2 Gewebekulturflasche.
        1. Entfernen Sie das Medium aus dem 75 cm 2 Kolben und waschen Sie die Monoschicht zweimal mit 10 ml vorgewärmtes PBS.
        2. 1 ml of 0,05% Trypsin-EDTA - Lösung und Ortszellen bei 37 ° C + 5% CO 2 3 - 5 min Zellen zu lösen.
        3. Re-suspendieren Zellen in 10 ml Erhaltungsmedium. 2 ml resuspendierten Zellen in einen 175 cm 2 -Kolben 38 ml Erhaltungsmedium enthält.
        4. Bei 37 ° C inkubieren in 5% CO 2 für weitere 3 bis 5 Tage bis zu 100% Konfluenz erreicht ist , und große Vakuolen beobachtet.
    2. Sammeln Überstand aus dem 175 cm 2 Kolben, 10 ml dH 2 O , um die infizierten HeLa - 229 - Zellen zu bedecken und für 15 min Inkubation auf infizierte Zellen lysieren.
    3. Kombinieren Überstand und Pellet lysierten Zellen und bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
    4. Re-suspendieren Pellet in 10 ml dH 2 O. Lysieren Zellen weiter, indem wiederholt die Resuspension durch eine 23G Nadel vorbei an einer 10 ml-Spritze mindestens 20 Mal. Pellet bei 500 × g für 5 min um Zelltrümmer zu entfernen.
    5. 15 min bei RT mit 15.000 × g entfernen und Pelletüberstand C. sammeln burnetii.
    6. Re-suspendieren C. burnetii in DMEM + 10% FCS und die Anzahl der Bakterien pro 4 quantifizieren. Die Lösung wird bis 1 × 10 9 Genome / ml mit DMEM + 10% FCS + 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), aliquote 50 ul Bestände in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C.
  3. Beimpfen von 10 ml vorgewärmtes ACCM-2 , enthaltend 3 & mgr; g / ml Chloramphenicol mit 20 & mgr; l C. burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm 17 (von Aktien generiert in 1,2 bei -80 ° C gelagert) in einem 25 cm 2 Gewebekulturflasche mit Filtrierkappe. Wachsen Bakterienkultur für 7 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2.

2. Reverse - Transfektion von siRNA und Seeding von HeLa - 229 - Zellen (Tag 4)

  1. Wenn die experimentelle siRNA zum ersten Mal unter Verwendung vorbereitendie siRNA, wie folgt:
    1. Zentrifuge kurz die lyophilisierte siRNA, um sicherzustellen, daß das siRNA Pellet am Boden des Röhrchens gesammelt wird.
    2. Re-suspend die pelle siRNA zu einer endgültigen Lager - Konzentration von 20 & mgr; M durch Pipettieren das entsprechende Volumen 1x siRNA - Puffer (Tabelle 2).
    3. Pipette, um die Lösung auf und ab 3 bis 5-mal zu mischen und auf einem Orbitalmischer für 30 min bei RT, Umdrehen des Röhrchens alle 5 - 10 min.
    4. Zentrifuge kurz die Röhre die siRNA gesammelt am Ende des Rohres zu gewährleisten.
    5. Aliquot der siRNA in 50 ul-Aliquoten in Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C, bis sie benötigt.
    6. Um 1 uM erzeugen Arbeitskonzentration von siRNA, Pipette 950 ul 1X siRNA-Puffer in ein 50-ul-Aliquot Lager (20 & mgr; M), wenn nötig. Hinweis: Diese 1 uM Arbeitskonzentration mehrfach für die wiederholte Transfektionen gefrieraufgetaut werden kann.
  2. Platzieren DMEM + 10% FCS,vor erwärmen verwenden 0,05% für 30 min in einem 37 ° C Wasserbad (oder ein Äquivalent) Trypsin-EDTA und PBS;.
  3. Herstellung von Transfektionskomponenten:
    Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für HeLa-229-Zellen in einer 96-Well-Mikroplatte mit schwarzen Wänden und flachen, transparenten Boden optimiert. Optimierung der Menge des Transfektionsreagenz, die Konzentration der siRNA und Einsaatdichte von Zellen für verschiedene Zelllinien erforderlich.
    1. Für jede Vertiefung wurden 0,1 ul Transfektionsreagenz verwenden, 15,9 ul reduzierten Serum Medium und 4 ul von 1 uM siRNA (was zu einer endgültigen siRNA - Konzentration von 40 nM) (minimal essential Medien für Transfektionen siehe Tabelle der verwendeten Materialien). Verwenden Sie separate Mikrozentrifugenröhrchen für OTP, PLK1, RAB5A und Rab7A. Messen Sie jeden Testbedingungen in dreifacher Ausfertigung. Ein Beispiel einer 96-Well - Platte Layout wird in Abbildung 3 dargestellt.
      Hinweis: Dieses Protokoll umfasst die Verwendung von zwei Steuerungen: OTP und PLK1. OTP istbestehend aus vier gepoolten siRNA, die optimiert wurden, Nebeneffekte zu reduzieren und somit wird OTP als negative, nicht-Targeting-Kontrolle verwendet. Verwürfelten siRNA könnte auch als negative Kontrolle verwendet werden. Verlust von PLK1 Expression zu ausgedehnten Zelltod in einer Reihe von Zelllinien durch pro-apoptotische Wege induzieren und daher PLK1 siRNA als positive Kontrolle für die Transfektionseffizienz verwendet, bei denen Zelltod Transfektionseffizienz korreliert.
      1. Für jede experimentelle siRNA-Transfektion, kombinieren 0,4 ul Transfektionsreagenz und 63,6 ul reduzierten Serum Medium in einem einzelnen Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex alle Mikrozentrifugenröhrchen und lassen Komponenten Komplex für 5 min bei RT.
      2. Hinzufügen, 16 ul von jeder experimentellen siRNA in die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen Transfektionskomplex enthält. Vortexen und 20 min bei RT inkubiert. Hinweis: Es ist wichtig, nicht mehr als 30 min zu überschreiten, da die Transfektionseffizienz verringern.
  4. Während der 20 min incubation (2.3.1.2) 20 ul des Transfektionsreagenz hinzufügen + reduziertem Serum - Medium + siRNA in die Vertiefungen einer sterilen schwarz, flach klarer Boden 96-Well - Fach ein .
  5. Sobald die 20 min Inkubationszeit vollständig, Saatgut HeLa 229 - Zellen bei einer Dichte von 3,92 × 10 3 Zellen / Vertiefung.
    1. Ernte HeLa 229 - Zellen aus einem konfluenten oder subkonfluenten 75 cm 2 Gewebekulturkolben in vorgewärmten DMEM + 10% FCS und resuspendieren Zellen zu einer Enddichte von 4,9 × 10 4 Zellen / ml nach Standardmethoden. Um sicherzustellen , dass die Transfektionseffizienz nicht beeinträchtigt wird, bereiten Zellen während der 20 Minuten Inkubationszeit (2.3.1.2).
      1. Wasche die Monoschicht von HeLa 229-Zellen zweimal mit 10 ml vorgewärmtes PBS.
      2. 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA - Lösung und statt 229 HeLa - Zellen bei 37 ° C + 5% CO 2 für 3 bis 5 min Zellen abzulösen.
      3. Sammeln Zellen in 9 ml vorgewärmtem DMEM + 10% FCS. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und DMEM + 10% FCS unter Verwendung von Zellen auf eine Enddichte von 4,9 × 10 4 Zellen / ml herzustellen.
    2. Pipette 80 ul HeLa 229 - Zellen bei einer Dichte von 4,9 × 10 4 Zellen / ml in jeder Vertiefung, die das Transfektionsreagenz + reduzierte serumhaltigem Medium + siRNA Mischung enthält. Dies entspricht einer Zelldichte von 3,92 × 10 3 Zellen / Vertiefung.
      Hinweis: Hintergrundkorrektur ist für das BlaM Substrat erforderlich.
      1. Fügen Sie keine Zellen oder siRNA zu "leeren" Brunnen (Abbildung 3). Stattdessen fügen 80 ul DMEM + 10% FCS auf diese Vertiefungen in dreifacher Ausfertigung eingerichtet.
    3. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C + 5% CO 2.

3. Ändern Medien (TAG 5)

  1. Nach 24 Stunden entfernen Medien einen Mehrkanal-Adapter mit einer Vakuumquelle oder manuell mit einer Mehrkanalpipette angebracht verwendet und ersetzen mit 100 ul frisch vorwärmened DMEM + 10% FCS.
  2. Inkubieren für weitere 48 h bei 37 ° C + 5% CO 2.
  3. An diesem Punkt überprüfen die Lebensfähigkeit der Zellen optisch ein Standard-Lichtmikroskop. Wenn die umgekehrte Transfektion erfolgreich war, signifikante Zelltod wird in den Vertiefungen, enthaltend PLK1 siRNA Vergleich zu OTP siRNA beobachtet werden.

4. Quantifizierung von Coxiella burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm mit qPCR (Tag 7)

  1. Nach 7 Tagen Wachstum in ACCM-2 bei 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2 (1.3), der Zentrifuge 10 ml C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur bei 15.000 × g für 15 min bei RT.
  2. Re-suspendieren das Bakterienpellet in 10 ml des vorgewärmten DMEM + 10% FCS. Bereiten 1:10 und 1: 100 Verdünnungen der Kultur (Probe) unter Verwendung von dH 2 O.
  3. Richten Sie die Komponenten für die qPCR erforderlich.
    Hinweis: gDNA Extraktion kann im voraus und bei -20 ° C durchgeführt werden until erforderlich.
    1. Ausarbeitung von Normen:
      1. Auszug gDNA von Coxiella burnetii RSA439 NMII Wildtyp - Stamm gewachsen in ACCM-2 bei 37 ° C in 5% CO 2, 2,5% O 2 für 7 Tage mit einem gDNA - Extraktions - Kits, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      2. Messen der gDNA-Konzentration (g / & mgr; l), um eine Nanodrop (oder Äquivalent) bei einer Absorption von 260 nm verwendet wird.
      3. Berechnung der Anzahl der Genomkopien pro ul der folgenden Formel unter Verwendung von und zu konvertieren Anzahl von Genomen / ml.
        figure-protocol-1
      4. Stellen Sie die Anzahl von Genomen / ml bis 10 9 / ml (in einem Endvolumen von 100 & mgr; l) in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von dH 2 O. Dies kann für 10 min und bei -20 ° C gekocht werden, bis sie benötigt wurden.
      5. Am Tag der Infektion erzeugen 10fache Reihenverdünnungen von 10 8 Genome / ml bis 10 5 Genomen / ml von der 10 9 Genoms / ml Lager.
        1. Pipette 10 ul 10 9 Genome / ml in 90 ul dH & sub2 ; O 10 8 Genome / ml zu erzeugen. Vortex mischen. Pipette 10 ul 10 8 Genome / ml in 90 ul dH & sub2 ; O 10 7 Genomen / ml zu erzeugen. Vortex und wiederholen , bis 10 5 Genomen / ml.
    2. Richten Sie qPCR Reaktion. Erstellen Sie einen Master-Mix für 25 Brunnen für alle Pipettierfehler zu berücksichtigen. Für jede Vertiefung verwenden 10 ul qPCR Master Mix; 2 ul ompA Zündmittelgemisch (4.3.2.2) und 3 & mgr; l dH 2 O.
      Hinweis: OmpA ist ein Außenmembranprotein von C. burnetii '39 und ein 82-Basenpaar - Abschnitt innerhalb einer hochkonservierten Region wurde zur Verwendung als Sonde ausgewählt , wie zuvor beschrieben 40.
      1. Einrichten jeden Standard (dH 2 O, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9 Genome / ml) und Probe (1:10 und 1: 100 Verdünnung) in eine 96-well PCR losreißen Platte (nicht umsäumte) doppelt oder dreifach sind. In 5 ul Probe oder Standard in die Vertiefungen.
      2. Verwendung von dH 2 O, verdünnter sowohl die ompA Vorwärtsprimer (5'-CAGAGCCGGGAGTCAAGCT-3 ') und ompA - Rückwärtsprimer (5'-CTGAGTAGGAGATTTGAATCGC-3') bis zu einer Endkonzentration von 4 & mgr; M und verbinden sich zu dem gleichen Mikrozentrifugenröhrchen.
        Hinweis: Das ompA Zündmittelmischung kann im Voraus gespeichert und bei -20 ° C hergestellt werden , bis sie benötigt wurden .
      3. Kombinieren Sie 250 ul qPCR Master Mix, 50 ul ompA - Primer - Gemisch, 75 & mgr; l dH 2 O und Wirbel zu mischen. In 15 ul dieses Mastermixes in die Vertiefungen entweder Standards oder Proben enthalten.
      4. Legen Sie 8-Deckel PCR Streifen Kappen auf die entsprechenden Vertiefungen und pulszentrifugieren PCR-Röhrchen alles, um sicherzustellen, ist im Boden der Röhrchen gesammelt.
      5. Stellen Sie das folgende Programm auf einer quantitativen PCR ma upchine: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min, gefolgt von 45 Zyklen von 95 ° C für 1 sec und 60 ° C für 20 sec (4A).
    3. Analysieren Sie den Ct (cycle threshold) Werte aus der qPCR:
      1. Übertragen Sie die Ct-Werte in eine Tabelle mit der Exportfunktion des Programms.
      2. Erstellen Sie ein Streudiagramm der Standards 10 5 Genomen / ml bis zu 10 9 Genome / ml (als Log - Werte ausgedrückt). Entsorgen Sie alle offensichtliche Ausreißer unter den dreifachen Proben. Generieren Sie eine logarithmische Trendlinie und bestimmen die Gleichung des Graphen.
      3. Berechnen der Gesamtzahl der Genome / ml in der Probe durch die Gleichung in 4.3.3.2 erzeugt. Vergessen Sie nicht, für die anfängliche Verdünnung zu berücksichtigen (1:10 und 1: 100) der Proben.

5. Die Infektion von Reverse-transfizierter Zellen (Tag 7)

  1. Nachdem die gesamten Genome / ml in der C Berechnung Klettenetii pBlaM-CBU0077 Kultur zur Infektion verwendet werden, stellen Bakterienkultur resuspendierten Zellen bei einer MOI von 300 in einem Endvolumen von 50 ul zu infizieren / Vertiefung unter Verwendung vorgewärmtem DMEM + 10% FCS.
    Anmerkung: Die erwartete Dichte der beimpften HeLa 229 - Zellen mit einer normalen Verdopplungszeit nach 72 h 3,136 × 10 4 Zellen / Vertiefung. Die Menge an Bakterien bei einem MOI von 300 infiziert erforderlich ist 9,408 × 10 6 in 50 & mgr; l, das auf 1,88 × 10 8 Bakterien / ml entspricht.
    1. Unter Verwendung des Wertes aus den qPCR berechnet (Genome / ml) (4.3.3.3), verdünnen die resuspendierten Bakterien mittels vorgewärmten DMEM + 10% FCS in einem Gesamtvolumen von 2 ml , die Reverse - transfizierten Zellen zu infizieren.
  2. Entfernen Sie den vorhandenen Medien aus dem Rohling und transfizierten Zellen umkehren.
  3. In 50 ul der verdünnten Bakterien (1,88 × 10 8 Bakterien / ml) in die entsprechenden Vertiefungen. Zugabe von 50 & mgr; l DMEM + 10% FCS sowohl mit dem Rohling und uninfected Brunnen.
  4. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C + 5% CO 2.

6. Zugabe von BlaM Substrat zu bestimmen Niveau Translokation (TAG 8)

  1. Bereiten Sie die Lösungen für die BlaM Substrat 6x Beladungslösung.
    Hinweis: Lösung A, B und C sind vorgesehen , innerhalb des BlaM Substrat Kit (Siehe Tabelle der Materialien). Lösung B kann einen Niederschlag bei RT bilden. Erwärmen, diese Lösung auf 37 ° C vor der Verwendung und der Niederschlag sollte aufzulösen.
    1. Wenn das Kit zum ersten Mal verwenden, fügen Sie 185 ul DMSO (mit dem BlaM Substrat-Kit mitgeliefert) an die ausgetrockneten Lösung A. Anschließend speichern Sie die resuspendierten Lösung A bei -20 ° C.
    2. Bereiten 0,1 M Probenicid Lösung im Voraus und lagern in 1 ml Aliquots bei -20 ° C, bis sie benötigt.
      1. Bereiten 0,4 M NaOH (1,6 g in 100 ml dH 2 O).
      2. Herstellung von 100 mM Na - Phosphatpuffer pH 8 (1,56 g NaH 2 PO 4 .2H 2 O und 1,41 g Na 2 HPO 4 in 100 ml dH 2 O).
      3. Man löst 1,25 g Probenicid in 22 ml von 0,4 M NaOH unter kräftigem Rühren.
      4. In 22 ml 100 mM Na-Phosphat-Puffer pH 8 (Lösung wird trüb) und rühren Sie die sich bildende Niederschlag aufzulösen.
      5. Der pH-Wert 8 (falls erforderlich) unter Verwendung von 1 M NaOH / HCl.
      6. Gut durchrühren und erhitzen mild (<50 ° C), bis die Lösung meist klar.
      7. Filter (0,2 & mgr; m Porengröße) und aliquoten in 1 ml Volumen. Store Aliquots bei -20 ° C.
  2. Für jede Vertiefung verwenden 0,06 ul Lösung A, 0,54 ul Lösung B, 7,9 ul Lösung C und 1,5 ul 0,1 M Probenicid. Erstellen eines Master-Mix für 30 Vertiefungen, indem zuerst 1,8 ul Lösung A und 16,2 ul Lösung B zusammen in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert. Gut mischen einen Wirbel verwenden. Hinzufügen 237 ul Lösung C und 45 ul 0,1 M Probenicid. Vortex zu vereinen alle components.
    Hinweis: Die 6x Ladelösung für bis zu 4 Stunden (im Dunkeln) stabil ist, aber sollte so nah wie möglich vor der Anwendung hergestellt werden.
  3. In 10 ul der 6-fachem Beladungslösung direkt in alle leer und Reverse-transfizierten Brunnen, ohne die vorhandene Medien zu entfernen.
  4. Inkubiere die Platte bei RT für 2 h im Dunkeln.
  5. Um das Niveau der Translokation bestimmen, quantifizieren die Menge der Fluoreszenz eines Mikroplattenleser.
    Hinweis: Das folgende Verfahren ist spezifisch für die ClarioSTAR Mikroplatten-Reader. Equivalent Mikrotiterplatten-Leser können ebenfalls verwendet werden.
    1. Erstellen Sie eine neue Fluoreszenzintensität Protokoll Endpunkt als Lesemodus.
    2. Passen Sie die grundlegenden Parameter wie folgt:
      1. Wählen Sie 96-well Mikrotiterplatten.
      2. Unter Optik-Einstellungen wählen Sie 2 multichromatics mit den folgenden benutzerdefinierten Einstellungen: (1) Eingang 410-10 nm Anregung und 520-10 nm-Emission. (2) Eingaben 410-10 nm Anregung und 450-10 nm-Emission. Stellen Sie sicher, gut multichromatics ausgewählt ist.
      3. Wählen orbital Lungs mit einem Durchmesser von 3 mm.
      4. Unter Optik, untere Optik aus.
      5. Unter Geschwindigkeit und Präzision, wählen Sie präzise. Dies entspricht acht Regionen pro Vertiefung.
    3. Stellen Sie den Plattenlayout, indem Sie die entsprechenden Wells als Proben ausgewählt.
    4. Wählen Sie das Startmessung.
    5. Entfernen Sie den Deckel und legen Sie das Fach in den Plattenleser. Um zu vermeiden, maximale Fluoreszenzwerte zu erreichen, stellen Sie sicher der Verstärkungswert eingestellt wird. Dazu führen Sie so eine Verstärkungseinstellung an einem der infizierten Wells, die Reverse-transfiziert mit OTP siRNA wurde. Dies entspricht der höchsten erwarteten Translokation.
    6. Wählen Sie das Start Messung alle geeigneten Vertiefungen mit Boden Fluoreszenz bei einer Anregung von 410 nm und einer Emission von sowohl 450 nm und 520 nm für blaue und grüne Fluoreszenz zu messen sind.

7. Analyse der Ergebnisse:

  1. Berechnen Sie das Verhältnisvon 450 nm bis 520 nm (blau bis grün) für alle Proben nach Leer Reduktion und zur nicht infizierten OTP Probe relativ auszudrücken.
    Hinweis: Die folgenden Analyseschritte sind für ein einfaches Kalkulationsprogramm zur Verfügung gestellt.
    1. Mit der Exportfunktion auf den Mikroplatten - Reader, übertragen Sie die Rohwerte Fluoreszenz sowohl für 520 nm und 450 nm Emissionswellenlängen erhalten (6,5) in eine Tabelle.
    2. Berechnen Sie den Mittelwert der "leeren" Lesungen (Medien nur, keine Zellen) für die 520 nm Wellenlänge durch Zugabe der rohen 520 nm Fluoreszenzwerte und dividiert durch die Anzahl der Vertiefungen (3). Wiederholen Sie die Leer 450 nm Wellenlänge Werten. Diese Werte stellen die Hintergrundfluoreszenz aufgrund der 96-Well-Platte und Medien.
    3. Ziehen Sie die Hintergrundfluoreszenz. Unter Verwendung der erhaltenen Werte in 7.1.2 subtrahieren den Mittelwert des Rohlings 520 nm Wellenlänge , die von allen Proben 520 nm Fluoreszenzwerte. Wiederholen Sie dies für die 450 nm Wellenlänge Werte.
    4. So erhalten die 450: 520 nm Verhältnis der Leer korrigierten Werte verwenden (7.1.3). Teilen Sie jede Probe 450 nm Fluoreszenzwert durch seine 520 nm Wert entspricht.
    5. Berechne den Mittelwert der nicht infizierten OTP Verhältniswerte durch die Zugabe von 450: 520 nm Verhältniswerte (von 7.1.4) und Dividieren durch die Anzahl von Vertiefungen (3).
    6. Berechnen des Verhältnisses der Proben relativ zu uninfizierten OTP durch das Dividieren 450: in 7.1.4 durch den Durchschnitt der nicht infizierten OTP Verhältniswert in 7.1.5 berechneten 520 nm - Verhältnis.

8. Zugabe von Nuclei Stain zu bestimmen Zellzahl nach der Translokation Assay (TAG 8)

  1. Folgende Quantifizierung der Fluoreszenz, entfernen Medien mit 6x Beladungslösung aus allen Vertiefungen unter Verwendung von entweder einem Mehrkanaladapter an eine Vakuumquelle angeschlossen oder von Hand mit einer Mehrkanalpipette.
  2. In 50 ul 4% PFA (Paraformaldehyd) Lösungin PBS zu allen geeigneten Vertiefungen Zellen zu fixieren. 20 min bei RT inkubiert.
  3. Entfernen Sie die 4% PFA PBS - Lösung (gemäß 8.1) und waschen Sie die Zellen zweimal mit 75 ul PBS.
  4. Werden 50 ul einer Zell permeable Kernfärbung, beispielsweise DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol), zu jeder Vertiefung. Erwerb von Bildern mit einem Fluoreszenzmikroskop und zu quantifizieren , die Anzahl der Kerne , die in jeder Vertiefung nach siRNA Behandlung mit geeigneten Bildanalysesoftware, wie ImageJ 41.

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Ergebnisse

Für diese Studie wurden die C. burnetii pBlaM-CBU0077 Stamm wurde ausgewählt als CBU0077 wurde zuvor ein transloziert Effektor des Coxiella Dot / Icm Sekretionssystem 17 gezeigt ist. Vor der Infektion, die Gesamtzahl der Genome / ml in der 7 Tage C. burnetii pBlaM-CBU0077 Kultur aufgezählt wurde qPCR unter Verwendung dar. 4 zeigt ein Beispiel des Zyklus Schwellenwert (Ct) -Werte von beiden Standards erwartet und Proben nach qPCR. Die...

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Diskussion

Sekret-Systeme sowie der bakteriellen Effektor-Proteine ​​diese Systeme Transport in das Zytoplasma der Wirtszellen, sind eine wichtige Komponente, die Virulenz viele pathogene Bakterien verwenden, um eine Infektion innerhalb von einzigartigen replikativen Nischen zu etablieren. Im Mittelpunkt vieler Forschungsgruppen wurde das Zusammenspiel zwischen bakteriellen Effektoren und Wirtsproteinen und dem Einfluss diese Effektoren auf Host zellulären Wege haben zu untersuchen. Sehr begrenzte Forschung, wenn überhaupt, hat da...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Health and Medical Research Council (NHMRC) (Grant ID 1062383 und 1063646) unterstützt, die an HJN vergeben wurden. EAL wird durch einen Australian Postgraduate Award unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
ZitronensäureSigmaC0759ACCM-2 Mittelkomponente
NatriumcitratSigmaS4641ACCM-2 Mittelkomponente
KaliumphosphatSigma60218ACCM-2 Mittelkomponente
MagnesiumchloridCalbiochem442611ACCM-2 Medium Komponente
CalciumchloridSigmaC5080ACCM-2 mittelkomponentig
EisensulfatFisherS93248ACCM-2 mittelkomponentig
NatriumchloridSigmaS9625ACCM-2 mittelkomponentig
L-CysteinSigmaC6852ACCM-2 mittelkomponentig
Bacto-NeopeptonBD211681ACCM-2 medium Komponente
CasaminosäurenFisherBP1424ACCM-2 mittlere Komponente
Methyl-Beta-CyclodextrinSigmaC4555ACCM-2 mittlere Komponente
RPMI + GlutamaxThermoFisher Scientific61870-036ACCM-2 mittlere Komponente
ChloramphenicolSigmaC0378Für Bakterienkulturen
ON-TARGETplus Non-targeting-Kontrolle Pool (OTP)DharmaconD-001810-10-05
siRNA für humane PLK1 (5347) siRNA ohne Zielkontrolle - SMARTpoolDharmaconM-003290-01-005Verursacht den Zelltod; Messung der Transfektionseffizienz
siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-004009-00-0005
siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpoolDharmaconM-010388-00-0005
5x siRNA-PufferDharmaconB-002000-UB-100Verwenden Sie steriles RNase-freies Wasser, um 5x siRNA-Puffer auf 1x siRNA-Puffer zu verdünnen
DharmaFECT-1 TransfektionsreagenzDharmaconT-2001-01Für die Transfektion
Opti-MEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific51985-034Serumreduziertes Medium für die Transfektion
DMEM + GlutaMAXThermoFisher Scientific10567-014Für Zellkulturen und Infektionen
Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS)Thermo ScientificSH30071.03Kann ein alternatives gleichwertiges Produkt verwenden
DMSOSigmaD8418Für die Lagerung von Coxiella-Stamm
PBSFür Zellkulturen
0,05 % Trypsin + EDTAThermoFisher Scientific25300-054Für Zellkulturen
dH2OZur Verdünnung von Proben und Standards für die qPCR
Quick-gDNA Mini PrepZYMO ResearchD3007Kann ein alternatives äquivalentes Produkt zur Extraktion von gDNA
verwenden SensiFAST SYBR No-ROX KitBiolineBIO-98020Kann ein alternatives äquivalentes qPCR-Mastermix-Produkt für die qPCR-Reaktion
verwenden LiveBLAzer FRET-B/G Ladekit mit CCF2-AMInvitrogenK1032Zur Messung der Translokation mittels Fluoreszenz und Erzeugung der 6X-Beladungslösung (enthält Lösung A, B, C und DMSO)
NatronlaugeMerck106469Probenicid-Lösungskomponente
Natriumphosphat monobasischSigma71505Probenicid-Lösungskomponente
Di-NatriumhydrogenorthophosphatMerck106586Probenicid-Lösung Komponente
ProbenicidSigmaP8761Probenicid-Lösung Komponente
DRAQ5 Fluoreszenzsondenlösung (5 mM)ThermoFisher Scientific62251Zellkernfärbung zur Bestimmung der Zellviablität. Verwenden Sie 1:4000 verdünnt in PBS.
4%ige PFA-Lösung (Paraformaldehyd) in PBSSigmaP6148Fixierlösung für HeLa 229 Zellen
25 cm2 Gewebekulturflasche mit belüfteter KappeCorning430639Für das Wachstum von Bakterienstamm
96 Well Flacher Boden Schwarzer Polystyrol TC-behandelte Mikrotiterplatten, einzeln verpackt, mit Deckel, sterilCorning3603
75 cm2 Gewebekulturflasche mit belüfteter KappeCorning430641Für das Wachstum von HeLa 229 Zellen
175 cm2 Gewebekulturflasche mit belüfteter KappeCorning431080Für das Wachstum von HeLa 229 Zellen
HämozytometerZur Quantifizierung von HeLa 229 Zellen
Tear-A-Way 96 Well PCR Platten4titude4ti-0750/TAFür qPCR Reaktion
8-Deckel-Kette, flachSarstedt65.989.002Für qPCR-Reaktion
NameCompanyKatalognummerKommentare<
strong>Ausrüstung
Tisch-Mikrofuge
Tisch-Wirbelmischer
Orbitalmischer
ZentrifugeEppendorf5810 RFür die Pelletierung von Bakterienkulturen
NanodropFür die gDNA-Quantifizierung
Mx3005P QPCR-MaschineAligent Technologies401456Für die Quantifizierung von Coxiella-Genomen in 7-Tage-Kultur
ClarioSTAR Mikroplatte ReaderBMG LabTechZur Messung der Fluoreszenz

Referenzen

  1. Delsing, C. E., Warris, A., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever: still more queries than answers. Adv Exp Med Biol. 719, 133-143 (2011).
  2. Delsing, C. E., Kullberg, B. J., Bleeker-Rovers, C. P. Q fever in the Netherlands from 2007 to. Neth J Med. 68, 382-387 (2010).
  3. van der Hoek, W., et al. Epidemic Q fever in humans in the Netherlands. Adv Exp Med Biol. 984, 329-364 (2012).
  4. Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. Q fever: a biological weapon in your backyard. Lancet Infect Dis. 3, 709-721 (2003).
  5. Hoover, T. A., Culp, D. W., Vodkin, M. H., Williams, J. C., Thompson, H. A. Chromosomal DNA deletions explain phenotypic characteristics of two antigenic variants, phase II and RSA 514 (crazy), of the Coxiella burnetii nine mile strain. Infect Immun. 70, 6726-6733 (2002).
  6. Omsland, A., et al. Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii are facilitated by an improved axenic growth medium. Appl Environ Microbiol. 77, 3720-3725 (2011).
  7. Omsland, A., et al. Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4430-4434 (2009).
  8. Beare, P. A., et al. Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages. MBio. 2, e00175-e00111 (2011).
  9. Chen, C., et al. Large-scale identification and translocation of type IV secretion substrates by Coxiella burnetii. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 21755-21760 (2010).
  10. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii cryptic plasmid is enriched in genes encoding type IV secretion system substrates. J Bacteriol. 193, 1493-1503 (2011).
  11. Beare, P. A., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. A. Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens. Front Microbiol. 2, 97(2011).
  12. Beare, P. A., Larson, C. L., Gilk, S. D., Heinzen, R. A. Two systems for targeted gene deletion in Coxiella burnetii. Appl Environ Microbiol. 78, 4580-4589 (2012).
  13. Howe, D., Shannon, J. G., Winfree, S., Dorward, D. W., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii phase I and II variants replicate with similar kinetics in degradative phagolysosome-like compartments of human macrophages. Infect Immun. 78, 3465-3474 (2010).
  14. Heinzen, R. A., Scidmore, M. A., Rockey, D. D., Hackstadt, T. Differential interaction with endocytic and exocytic pathways distinguish parasitophorous vacuoles of Coxiella burnetii and Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 64, 796-809 (1996).
  15. Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cell Microbiol. 9, 891-909 (2007).
  16. Beare, P. A. Genetic manipulation of Coxiella burnetii. Adv Exp Med Biol. 984, 249-271 (2012).
  17. Carey, K. L., Newton, H. J., Luhrmann, A., Roy, C. R. The Coxiella burnetii Dot/Icm system delivers a unique repertoire of type IV effectors into host cells and is required for intracellular replication. PLoS Pathog. 7, e1002056(2011).
  18. Segal, G., Shuman, H. A. Possible origin of the Legionella pneumophila virulence genes and their relation to Coxiella burnetii. Mol Microbiol. 33, 669-670 (1999).
  19. Zamboni, D. S., McGrath, S., Rabinovitch, M., Roy, C. R. Coxiella burnetii express type IV secretion system proteins that function similarly to components of the Legionella pneumophila Dot/Icm system. Mol Microbiol. 49, 965-976 (2003).
  20. Zusman, T., Yerushalmi, G., Segal, G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella'burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 71, 3714-3723 (2003).
  21. Newton, H. J., McDonough, J. A., Roy, C. R. Effector Protein Translocation by the Coxiella burnetii Dot/Icm Type IV Secretion System Requires Endocytic Maturation of the Pathogen-Occupied Vacuole. PLoS One. 8, e54566(2013).
  22. Lifshitz, Z., et al. Computational modeling and experimental validation of the Legionella and Coxiella virulence-related type-IVB secretion signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E707-E715 (2013).
  23. Voth, D. E., et al. The Coxiella burnetii ankyrin repeat domain-containing protein family is heterogeneous, with C-terminal truncations that influence Dot/Icm-mediated secretion. J Bacteriol. 191, 4232-4242 (2009).
  24. Weber, M. M., et al. Identification of C. burnetii type IV secretion substrates required for intracellular replication and Coxiella-containing vacuole formation. J Bacteriol. , (2013).
  25. Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Luhrmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-678 (2013).
  26. Larson, C. L., Beare, P. A., Howe, D., Heinzen, R. A. Coxiella burnetii effector protein subverts clathrin-mediated vesicular trafficking for pathogen vacuole biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4770-E4779 (2013).
  27. Luhrmann, A., Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetii type IV effector protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18997-19001 (2010).
  28. Newton, H. J., et al. A screen of Coxiella burnetii mutants reveals important roles for Dot/Icm effectors and host autophagy in vacuole biogenesis. PLoS Pathog. 10, (2014).
  29. Pan, X., Luhrmann, A., Satoh, A., Laskowski-Arce, M. A., Roy, C. R. Ankyrin repeat proteins comprise a diverse family of bacterial type IV effectors. Science. 320, 1651-1654 (2008).
  30. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
  31. de Felipe, K. S., et al. Legionella eukaryotic-like type IV substrates interfere with organelle trafficking. PLoS Pathog. 4, e1000117(2008).
  32. de Jong, M. F., Sun, Y. H., den Hartigh, A. B., van Dijl, J. M., Tsolis, R. M. Identification of VceA and VceC, two members of the VjbR regulon that are translocated into macrophages by the Brucella type IV secretion system. Mol Microbiol. 70, 1378-1396 (2008).
  33. Raffatellu, M., et al. Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhi is not caused by functional alteration of SipA, SopB, or SopD. Infect Immun. 73, 7817-7826 (2005).
  34. Wood, R. E., Newton, P., Latomanski, E. A., Newton, H. J. Dot/Icm Effector Translocation by Legionella longbeachae Creates a Replicative Vacuole Similar to That of Legionella pneumophila despite Translocation of Distinct Effector Repertoires. Infect Immun. 83, 4081-4092 (2015).
  35. Mueller, K. E., Fields, K. A. Application of beta-lactamase reporter fusions as an indicator of effector protein secretion during infections with the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. PLoS One. 10, (2015).
  36. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  37. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  38. Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e252(2015).
  39. Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. Identification of OmpA, a Coxiella burnetii protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening. PLoS Pathog. 10, e1004013(2014).
  40. Jaton, K., Peter, O., Raoult, D., Tissot, J. D., Greub, G. Development of a high throughput PCR to detect Coxiella burnetii and its application in a diagnostic laboratory over a 7-year period. New Microbes New Infect. 1, 6-12 (2013).
  41. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  42. Prashar, A., Terebiznik, M. R. Legionella pneumophila: homeward bound away from the phagosome. Curr Opin Microbiol. 23C, 86-93 (2014).
  43. McDonough, J. A., et al. Host Pathways Important for Coxiella burnetii Infection Revealed by Genome-Wide RNA Interference Screening. MBio. 4 (1), e00606-e00612 (2013).
  44. Farfan, M. J., Toro, C. S., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella enterotoxin-2 is a type III effector that participates in Shigella-induced interleukin 8 secretion by epithelial cells. FEMS Immunol Med Microbiol. 61, 332-339 (2011).
  45. Al-Khodor, S., Price, C. T., Habyarimana, F., Kalia, A., Abu Kwaik, Y. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa. Mol Microbiol. 70, 908-923 (2008).
  46. Geddes, K., Worley, M., Niemann, G., Heffron, F. Identification of new secreted effectors in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Infect Immun. 73, 6260-6271 (2005).
  47. Sory, M. P., Boland, A., Lambermont, I., Cornelis, G. R. Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages, using the cyaA gene fusion approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 11998-12002 (1995).

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