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Methodenartikel

Nicht beschränkende EEG Radiotelemetrie: epidurale und Deep Intrazerebrale Stereotaktische EEG Elektrodenplatzierung

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DOI:

10.3791/54216

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25. Juni 2016

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1Department of Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM), 2Molecular and Cellular Cognition Lab, German Center for Neurodegenerative Diseases (Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen, DZNE)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

EEG Radiotelemetrie Nichteinschränkungs ist eine wertvolle methodische Ansatz zur Aufzeichnung in vivo Langzeit Elektroenzephalogrammen von sich frei bewegenden Nagetiere. Diese detaillierte Protokoll beschreibt stereotaxische epidurale und tiefe intrazerebrale Elektrodenplatzierung in verschiedenen Hirnregionen, um eine zuverlässige Aufnahmen von ZNS-Rhythmik und ZNS im Zusammenhang mit Verhaltensstufen zu erhalten.

Zusammenfassung

Implantierbare EEG Radiotelemetrie ist von zentraler Bedeutung in der neurologischen Charakterisierung von transgenen Mausmodellen von neuropsychiatrischen und neurodegenerativen Erkrankungen sowie Epilepsien. Diese leistungsfähige Technik sorgt nicht nur für wertvolle Einblicke in die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen, dh., Der Ätiopathogenese von ZNS - bedingten Krankheiten, es erleichtert auch die Entwicklung neuer translationale, dh., Therapeutische Ansätze. Die konkurrierenden Techniken, die Verwendung von Recorder Systemen in Jacken oder angebundenen Systeme leiden an ihren unphysiologische Haltehalbhalte Charakter, radiotelemetric EEG-Aufzeichnungen überwinden diese Nachteile zu machen. Technisch ermöglicht, implantierbare EEG Radiotelemetrie für präzise und hochempfindliche Messung von epidurale und tief, intrazerebrale EEGs unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. Zunächst stellen wir ein detailliertes Protokoll eines gerade nach vorne, erfolgreich,schnelle und effiziente Technik für die epidurale (Oberfläche) EEG-Aufzeichnungen in hoher Qualität electrocorticograms führt. Zweitens zeigen wir , wie tief, intrazerebrale EEG - Elektroden zu implantieren, beispielsweise in dem Hippocampus (electrohippocampogram). Bei beiden Ansätzen wird ein computerisiertes 3D stereotaxische Elektrodenimplantationssystem verwendet. Der Hochfrequenzsender ist selbst in eine subkutane Tasche in beiden Mäusen und Ratten implantiert. Besonderes Augenmerk muss auch prä-, peri- und postoperativen Behandlung der Versuchstiere zu bezahlen. Die präoperative Vorbereitung von Mäusen und Ratten, geeignete Anästhesie sowie die postoperative Behandlung und Schmerzbehandlung werden im Detail beschrieben.

Einleitung

Radiotelemetrie ist eine äußerst wertvolle methodische Ansatz für eine Vielzahl von verhaltensmäßigen und physiologischen Parameter in der bewussten, hemmungslos Tiere verschiedener Größen zu messen, insbesondere im Rahmen des EEG, EKG, EMG, Blutdruck, Körpertemperatur oder Aktivitätsmessungen 1-7. Theoretisch kann jede Spezies 3,8 unter Verwendung von implantierbaren EEG Radiotelemetrie von Labor Nagetiere wie Mäuse und Ratten zu Katzen, Hunde, Schweine und Primaten werden analysiert. Auch Fische, Reptilien und Amphibien unterliegen radiotelemetric Untersuchung 9. In den letzten zwei Jahrzehnten hat implantierbare EEG Radiotelemetrie erwiesen bei der Charakterisierung der verschiedenen transgenen Tiermodellen von menschlichen Erkrankungen wertvoll sein, wie Epilepsien, Schlafstörungen, neurodegenerative und neuropsychiatrische Störungen 7,10-12. In der Vergangenheit wurden zahlreiche methodische Ansätze physiologischen Daten einschließlich Biopotentiale von Mäusen und Ratten zu sammeln war abribed. Getragen in der Jacke Recorder Systeme, körperlichen Zwanges Methoden, nicht implantierten radiotransmitters und angebundene Systeme haben die Hauptaufmerksamkeit in der Vergangenheit 13,14 erhalten. Heutzutage sind verschiedene Systeme für radiotelemetric Implantation im Handel erhältlich. Allerdings ist eine Literatur Bildschirm zeigte auch , 29 Publikationen, die die Entwicklung von selbstgemachten radiotelemetric Systeme 15-40 beschreiben. Während hausgemachte Systeme geeignet sind, weniger teuer und mehr Nutzer angepasst, im Handel erhältliche Systeme sind geradlinig, relativ einfach zu installieren und schnell eingerichtet werden können.

Implantierbare EEG hat Radiotelemetrie eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu konkurrierenden Techniken wie körperlichen Zwanges Methoden, getragen in der Jacke Systeme oder Fessel Ansätze. Letztere werden durch Definition zurückzuhalten, dh., Ist das Tier nicht in der Lage sich zu bewegen oder ist sein normales Verhalten beeinträchtigt. Es könnte sogar notwendig sein, das Tier für den Erwerb von Re zu betäubenhaftbar Daten. Moderne angebundenen Systeme sind jedoch wahrscheinlich weniger Halte zu sein, aber dies muss wissenschaftlich validiert werden. Radiotelemetrie auf der anderen Seite erlaubt Tiere ihr volles Repertoire an Verhaltens ohne räumlich - zeitliche Beschränkungen aufweisen , und somit wird angenommen , überlegen sind Ansätze zur Eindämmung und prädiktive der Ergebnisse, die beim Menschen 1,3 erworben werden. Es ist bekannt , für eine ganze Weile , dass die Rückhalteansätze dramatisch grundlegende physiologische Parameter verändern können, z. B. Nahrungsaufnahme, Körperkerntemperatur, Blutdruck und Herzfrequenz und körperliche Aktivität zum Beispiel 3. Tethered - Systeme stellen eine immer noch weit verbreitet klassischen Halte Ansatz 13,14. Die Elektroden, die entweder epidural oder Tief Elektroden werden im allgemeinen mit einem Miniatur-Buchse verbunden, die mit dem Schädel verankert wird. Die Buchse selbst ist für die Befestigung eines Kabels ausgesetzt, die eine relativ freie Bewegung des Tieres gestattet. Although heutzutage tethered Systeme extrem filigrane werden und hochflexibel, eine ihrer wichtigsten Nachteile ist, dass es immer noch halbRückHalte ist. Außerdem könnte es ein Risiko einer Infektion an der Elektrodenimplantationsstelle sein, da die Tiere aus ihrem Körper (Kopf) mit Ursprung alle externen Geräte zu manipulieren neigen. Obwohl drahtlose Radiotelemetrie - Technologie in verschiedenen Arten ist bereits seit Jahrzehnten in den späten 60er Jahren und hat somit existiert beschrieben worden ist , hat es erst vor kurzem eine erschwingliche, zuverlässige geworden, und relativ einfach zu bedien 10,41,42, vor allem in kleinen Labornagern solche wie Mäuse und Ratten. Kleine, implantierbare Miniatur EEG Sender sind jetzt im Handel erhältlich und können in Mäusen von mehr als 20 g (~ 10 Wochen) implantiert werden. So hat die elektro Charakterisierung von transgenen Mausmodellen insbesondere in diesen Tagen ein überwiegender Anwendungsgebiet von implantierbaren EEG Radiotelemetrie werden. Tiergröße ist nicht mehr eine absolute experimentelle schränkungention, während die Lebensdauer der Batterie Sender in der Tat ist. Trotz begrenzter Lebensdauer, sind implantierbare Sender Systeme, die die meisten Nachteile zu minimieren, um potenzielle Aufnahme assoziierten Stress durch Systeme eingeschränkt wird. Nagetiere können ihre komplette Rüstzeug der physiologischen Verhalten einschließlich Ruhe, Bewegungsaktivität (Exploration) und Schlaf (REM, Slow-Wave - Schlaf) 43,44 präsentieren. Wichtig ist , dass implantierbare Radiotelemetrie stark Tierversuche 3 zu reduzieren. Derzeit gibt es eine intensive Diskussion darüber, wie die Zahl der Versuchstiere in der Wissenschaft zu begrenzen und ihr Leiden zu verringern. Offensichtlich Tierversuche und Tiermodellen von menschlichen und tierischen Krankheiten sind von wesentlicher Bedeutung für unser Verständnis der Bottom-Line Pathophysiologie und anschließender Fortschritt in der Therapie. Darüber hinaus sind kritische Tierversuche in der Arzneimittelforschung und Entwicklung. Sie tragen wesentlich zur präklinischen / toxikologischen Untersuchungen in Arzneimittelzulassungso begehen zu Mensch und Tier Pflege. Es ist bemerkenswert, dass derzeit noch keine Alternative zur Verfügung stehen Tierforschung die komplexen pathophysiologischen Mechanismen zu verstehen, die sonst unmöglich wäre, hervorgerufen werden. Zur gleichen Zeit, das 3R, dh., Ersatz, Verringerung und Verfeinerung Strategie in der EU und den USA ermutigt die Erforschung komplementäre und alternative Methoden. Radiotelemetrie ist ein wichtiges Beispiel für eine erfolgreiche 3R-Strategie, wie es die Anzahl der Versuchstiere und ihr Leiden im Vergleich zu anderen Techniken reduzieren.

Hier bieten wir eine detaillierte und zusammenhängende Schritt-für-Schritt-Ansatz eine subkutane Tasche Implantation eines Hochfrequenzsender in beiden Mäusen und Ratten durchzuführen. Diese erste Sequenz wird durch eine Beschreibung der stereotaxische epidural und tiefe intrazerebrale EEG Elektrodenpositionierung gefolgt. Besonderes Augenmerk wird auf die Wohnverhältnisse bezahlt, Anästhesie, peri- und postoperativen SchmerzenManagement und mögliche antiinfektiöse Behandlung. Der Fokus liegt auf der elektronischen 3D-Stereotaxie Ansatz zuverlässig epidurale und tiefe intrazerebrale Strukturen zielen. Wir kommentieren auch auf häufige experimentelle Tücken in EEG Elektrodenimplantation und Strategien zur Verringerung von Traumata und Optimierung der Schmerztherapie während der postoperativen Erholung. Schließlich Beispiele für Oberflächen- und Tiefen EEG-Aufzeichnungen werden vorgestellt.

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Protokoll

Ethikerklärung: Alle Tierversuche erfolgte nach den Richtlinien der lokalen und institutionellen Rates über Animal Care (Universität Bonn, BfArM, LANUV, Deutschland). Darüber hinaus sind alle Tierversuche wurde in Übereinstimmung mit überlegener Gesetzgebung durchgeführt, z. B. der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 24. November 1986 (86/609 / EWG) oder einzelne regionale oder nationale Gesetzgebung. Besondere Anstrengungen unternommen werden, um die Anzahl der Tiere zu minimieren verwendet und ihr Leiden.

1. Versuchstiere

  1. Auswahl von Versuchstieren und Arten
    1. Führen Sie radiotelemetric Studien an Nagern, dh., Mäuse und Ratten, die die Anforderungen an Homologie, Isomorphismus und Vorhersehbarkeit in Bezug auf eine bestimmte Krankheit beim Menschen 7,9,45,46 erfüllen.
      Hinweis: Verschiedene Maus und Rattenstämme verfügbar in grundlegenden physiologischen und pathophysiologischen characterist stark abweichenics 47-49.
    2. Betrachten oder bewerten physiologischen und pathophysiologischen Eigenschaften der Maus / Rattenstämmen vor nachfolgenden elektrophysiologischen Experimenten durchzuführen, zum Beispiel als Reaktion auf anwendbaren Dosierungen von Anästhetika, die Schlafarchitektur und die Krampfanfälligkeit 50,51.
    3. Hinweis geschlechtsspezifische Merkmale in Studiendesign. Der Östrocyclus kann stark beeinflussen zentrale Rhythmik, ihre zirkadianen Abhängigkeit, Schlaf und Anfallsaktivität 52-54. So führen spezifische Analyse der Geschlechter.
      Hinweis: Wenn die finanzielle und experimentelle Kapazitäten begrenzt, Beschränkung auf männliche Mäuse wird empfohlen.
  2. Stall- und Handhabung
    1. Hausmäuse und Ratten in Filter-Top-Käfige oder noch besser in einzeln belüfteten Käfigen.
    2. Übertragen Mäuse aus der Tierhaltung zu ventilierte Schränke in speziellen Laborräumen platziert ausschließlich gewidmet implantierten Tiere und deren anschließende Aufnahme (Abbildung1).
    3. Für Akklimatisierung nach Bodentransport, Ort Tiere für eine Woche in einem belüfteten Schrank unter Standardbedingungen, dh 21 ± 2 ° C Umgebungstemperatur, 50 -. 60% relativer Luftfeuchtigkeit und einer herkömmlichen 12 Stunden Licht / Dunkel - Zyklus.
    4. Vor der chirurgischen Implantation, Hausmäuse in Gruppen von 3 bis 4 in klarem Polycarbonat Käfigen Typ II (26,7 cm x 20,7 cm x 14,0 cm, Fläche 410 cm 2) mit ad libitum Zugang zu Trinkwasser und Standardfutterpellets. Benutzen Sie klare Polycarbonatkäfigen Typ III (42,5 cm x 26,6 cm x 18,5 cm, Fläche 800 cm 2) für Ratten.
    5. Sie trennen nicht / Tiere in diesem Stadium zu isolieren als Isolation später Stress beeinflussen experimentellen Ergebnissen führen kann. Doch nach einer chirurgischen Instrumentierung, Haustieren getrennt, da die Tiere neigen Wunde Stiches / Fäden oder Metallklammern (siehe unten) zu manipulieren.
    6. Vermeiden Sie offenes Wohnbedingungen, wie sie für eine Vielzahl von s ungeeignet beurteilt werdencientific Fragen, z. B., Schlafstudien.
    7. Mit der Maus und Ratte spezielle Ausrüstung, so dass weder Mäuse noch Ratten, die die Anwesenheit von einander wahrnehmen können, da dies für die Tiere eine zusätzliche Belastung darstellt.

2. EEG-System Radiotelemetrie

Hinweis: Das beschriebene Protokoll basiert auf einer handelsüblichen Telemetriesysteme zur Oberflächen verwendet und tiefe intrazerebrale EEG - Aufzeichnungen (Abbildung 2).

  1. Verwenden Sie ein Hochfrequenztelemetrie Implantat geeignet für die Implantation in Mäuse oder Ratten, z. B., ein Ein-Kanal - Sender oder ein Zwei-Kanal - Sender.
    Anmerkung:. Beide Sender sind in der Lage verschiedene Biopotentialen zu messen, dh Elektroenzephalogramm (EEG), Elektrokardiogramm (ECG), Elektromyogramm (EMG), sondern auch der körperlichen Aktivität und der Temperatur. Sie haben einen magnetisch betätigten Ein-Aus-Mechanismus. Die Sender- und Fühlerleitungen werden steril geliefert. Wenn der Senderden Anweisungen des Herstellers für Resterilisation zu folgen wiederverwendet werden.
  2. Für Gamma-Analyse mit hoher Frequenz (bis 500 Hz) zum Beispiel, wählen Sie Sender mit höheren nominalen Abtastrate (f, bis zu 5000 Hz) und Sender die Bandbreite (B, bis zu 500 Hz). Insbesondere die Nyquist-Shannon - Sampling - Grenze betrachten, dh., Können EEG - Daten auf ein absolutes Maximum von f / 2, aber nicht darüber hinaus analysiert werden. Für eine zuverlässige Frequenzanalyse, eine Frequenzbandbreite (B) von f / 10 - f / 5 empfohlen.
    Hinweis: Die wissenschaftliche Frage angegangen werden müssen, die technischen Spezifikationen des Senders entsprechen.

3. Anästhesie und Schmerztherapie

  1. Verwenden Sie Isofluran Inhalationsnarkose.
    1. Legen Sie das Tier in einer "Induktionskammer" gefüllt mit 4 - 5% Isofluran und 0,8-1% Sauerstoff oder Carbogen (5% CO 2 und 95% O 2) L / min. Pflegen Sie die gewünschte Tiefe der Anästhesie mit einem Silizium facemask einen Fluss 1.5 Bereitstellen- 3,0% Isofluran und 0,8-1% Sauerstoff oder Carbogen L / min (Abbildung 3A).
      Hinweis: Die entsprechende Isoflurankonzentration variiert je nach Körpergewicht (Verteilungsvolumen), Alter, Geschlecht und genetische Hintergrund des Tieres. Wenn Gas Anästhesiegeräte nicht zur Verfügung steht, das heißt, "Induktionskammer", Carbogen oder Sauerstoffversorgung, Durchflussmesser, Isofluran Verdampfer, Systemspülung, siehe Abschnitt 3.2. A durch Ansaugsystem zurückgenommen (Spülsystem, 3A) installiert werden soll , Isofluran Exposition des Experimentators zu vermeiden (das Rohr ist in dem Video Dokument zur Demonstration nicht gezeigt).
  2. Beim Einatmen aneesthetics keine Option sind, führen Anästhesie durch injizierbare Anästhetika. Bereiten einer Kombination von esketamine hydrochlorid (rodent Dosierung 100 mg / kg) und Xylazinhydrochlorid (rodent Dosierung 10 mg / kg) in 0,9% NaCl und injizieren das Tier intraperitoneal basierend auf ihrem Körpergewicht.
  3. Beobachten Sie die Tiere carefully für die Tiefe der Anästhesie mit Schwanz und Zuziehen, Fuß Prise und durch die Überwachung der Atemfrequenz (Mäuse 150-220 Atemzüge / min; Ratten 70-115 Atemzüge / min). Überprüfen Sie mögliche Keuchen.
    Hinweis: Verschiedene Maus und Ratte Linien unterschiedliche Empfindlichkeiten auf die Anästhesie aufweisen kann. Das gleiche gilt für die transgenen Mausmodelle.
    Hinweis: Die endotracheale Intubation kein Muss bei Nagetieren ist. In der Tat erhöht, Intubation, das Risiko einer Beschädigung der Trachea.

4. Chirurgische Instrumente - Allgemeines

  1. Wenden Sie zusätzliche Wärme während und nach der Operation mit Rezirkulation warmem Wasser Decken, elektrische Wärmeplatten, Wärmelampen, Zwangswarmlufteinheiten oder Taschenwärmer zu Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten. Pflegen Sie die letztere bei 36,5-38,0 ° C (98,6 bis 100,4 ° F).
    Hinweis: Kleine Nagetiere sind prädisponiert Hypothermie aufgrund ihrer hohen Verhältnis von Körperoberfläche (Maus, 10,5 x (Gewicht in g) 2/3; Ratten, 10,5 x (Gewicht in g) 2/3)zu Körpervolumen.
  2. Vermeiden Sie Hornhaut- Desikkation und decken die Augen mit erdölbasierten künstlichen Tränen Salbe oder Dexpanthenol während des gesamten Implantationsprozess und der frühen Wiederherstellung (Video Dokument zu sehen), bis der Blinzelreflexes vollständig wiederhergestellt ist.
  3. Autoklav chirurgische Instrumente für die Sterilisation (Tabelle der Materialien sehen) oder sie in Desinfektionsmitteln.
    Hinweis: Eine elegante und schnelle Möglichkeit ist die Verwendung eines wärmebasierten chirurgischen Instrument Sterilisator mit Glasperlen.
  4. Haben Sie ein Binokular chirurgische Vergrößerung Mikroskop und eine Kaltlichtquelle über flexible oder selbsttragende für intensive Beleuchtung zur Verfügung, bewegliche Lichtleiter.
  5. Tragen Sie einen sauberen Laborkittel, eine Gesichtsmaske, eine Kopfabdeckung und sterile Handschuhe.
    Hinweis: Optimale Verbrauchsmaterialien und Instrumente von Labor zu Labor unterschiedlich sein können und müssen laborspezifischen und institutionellen Anforderungen erfüllen.

5. Chirurgie - Transmitter Placement

  1. Entfernen Sie den Körper hair von der Kopfhaut aus voll anästhesiert Mäuse / Ratten einen Rasierer. Reinigen Sie die rasierte Fläche ein Desinfektionsmittel, zum Beispiel 70% Ethanol und eine Jod - basierte Gestrüpp. Vermeiden Sie Hautreizungen oder Entzündungen durch übermäßige Exposition. Legen Sie das Tier in Bauchlage auf einer Heizdecke auf Körpertemperatur während der Anästhesie aufrechtzuerhalten.
  2. Unter Verwendung eines Skalpells, stellen einen Mittellinienschnitt auf der Kopfhaut von der Stirn (so dass das Bregma craniometric Grenzstein wird sichtbar) an den Hals (so dass die Trapezmuskel wird sichtbar). Ausgehend von der Nacken- Inzisionsstelle und unter Verwendung einer chirurgischen Schere, öffnen Sie eine subkutane Tasche entlang der seitlichen Flanke des Tieres durch stumpfe Präparation.
  3. Injizieren von 1 ml 0,9% NaCl in der subkutanen Tasche. Stellen Sie den Sender mit den Fühlerleitungen orientiert kranial in der subkutanen Tasche an der Flanke nahe der ventralen Bauchregion. Wenn der Sender eine Nahtlasche hat, befestigen Sie den Sender an der dorsalen / seitliche Haut mit einem oder mehreren stiChes (Over-and-über Nähte).
    Beachten Sie, dass die Fixierung des Senders kein Muss ist. Besonderes Augenmerk Kontaminierung der Operationsstelle und Sender Implantat verhindert wird. Drapiert sollte richtig steril verwendet werden, zu isolieren, von nicht sterilen Bereichen.
  4. Für die postoperative Versorgung und Schmerztherapie, siehe Abschnitt 8.

6. Stereotaktische Oberflächenelektrode Implantierung

  1. Legen Sie das Tier auf dem Stereotaxierahmen unter Narkose und positionieren Sie vorsichtig den Kopf mit Hilfe der Stäbe und der Nase Klammer , so dass die Bregma und Lambda craniometrics Sehenswürdigkeiten des Schädels auf dem gleichen Niveau sind (3B). Schäden am Innenohr nicht Ohr Bars verwenden. Decken Sie Ohr Bars mit Wattebällchen, wenn nötig. Diese Vorsichtsmaßnahmen ermöglicht enge Fixierung des Kopfes innerhalb des Stereotaxierahmen.
  2. Reinigen Sie das Periost mit Baumwollspitzen ohne die Schläfen- und Hinterhaupts Muskeln zu beschädigen. Pre-Behandlung die oberflächliche dünne Schichtder Schädel mit 0,3% H 2 O 2 für die Maus Schädel und 3% H 2 O 2 für die Ratte Schädel. Dieses Verfahren macht deutlich cranial Naht und craniometrics Orientierungspunkte wie Bregma und Lambda (4B, C).
  3. Verwenden Sie eine spezielle, voll ausgestattete Stereotaxierahmen Setup für Mäuse und Ratten einschließlich Stereotaxierahmen mit Ohr Bars und Nasenklammer Größe angepasste für Mäuse und Ratten. Stellen Sie sicher, dass das Stereotaxierahmen eine Gasnarkosemaske mit Verbindungen zum Isofluran Verdampfer und dem Isofluran-Scavenger-Modul enthält.
    Hinweis: Eine computerisierte 3D stereotaktischen Einrichtung mit einer spezifischen Maus- und Rattenhirn-Koordinaten Software einschließlich einer Benutzerschnittstelle für die Navigation und 3D-Atlas, eine axiale, koronale und sagittale Ansichten empfohlen.
  4. Montieren Sie einen Präzisionsbohrer auf dem vertikalen Arm des Stereotaxierahmen. Verwenden Sie einen montierten Bleistift oder Kugelschreiber auf dem vertikalen Arm eine winzige Markierung an den Koordinaten der Wahl auf der Oberseite des Schädels zu verlassen, wennkein EDV-Stereotaxie-System zur Verfügung steht.
  5. Die Bohrlöcher unter sorgfältig in Betracht, dass Mäuse und Ratten stark in der neurokraniale Knochendicke unterscheiden. Darüber hinaus ist zu beachten , dass die Dicke der murinen Schädelknochen hängt stark von der Lokalisation, zum Beispiel bei Mäusen, os frontale: Mittellinie Schnitt: 320-390 & mgr; m, seitliche Abschnitt: 300-430 & mgr; m; os parietale: Mittellinie Schnitt: 210 - 250 & mgr; m, Seitenschnitt: 200 - 210 um; os occipitale: Mittellinie Schnitt: 600-730 & mgr; m, seitliche Abschnitt: 380-420 & mgr; m).
  6. Die Bohrlöcher druckfrei bei maximaler Geschwindigkeit.
    Hinweis: Dies vermeidet eine stärk applanation des Schädels, der in einem plötzlichen Durchbruch des Bohrkopfes und möglichen Schäden in erster Linie im kortikalen Bereich führen kann. Für Kraniotomie, ein neurochirurgisches Präzisionsmotor Bohrsystem High-Speed ​​ist sehr zu empfehlen.
  7. Drill Bohrlöcher an den Koordinaten der Wahl mit typischen Bohrkopf Durchmesservon von 0,3 bis 0,5 mm.
    Hinweis: Der Durchmesser der Löcher kann in Abhängigkeit von dem Elektrodendurchmesser kleiner sein. Als allgemeine Regel ist der Durchmesser der kleineren, desto weniger Schaden erzeugt.
  8. Biegen Sie die Spitze der Messleiter "Sender, die als epidurale Elektrode dient und legen Sie es direkt an der Dura mater in das Loch an den Koordinaten der Wahl. Alternativ können Sie kortikale Schrauben und befestigen Sie sie mechanisch mit den Fühlerleitungen des Senders (4A).
  9. . Für Aufnahmen von der Oberfläche, zum Beispiel der Maus motorischen Cortex M1 / M2, positionieren Sie die Elektrode, zB bei: Schädel 1 mm, seitlich 1,5 mm (linke Hemisphäre). Legen Sie die epidurale Referenzelektrode auf der Kleinhirnrinde: Bregma -6 mm, seitlich von Bregma 1 mm (linke Hemisphäre) oder Bregmas -6 mm, seitlich von Bregma 1 mm (rechte Hemisphäre) (4D).
    Hinweis: Das Cerebellum als Referenz dient, wie es ein elektroenzephalographisch silent Region. Stereotaxic Koordinaten können aus Standard stereotaxische Atlanten für Mäuse und Ratten abgeleitet werden.
  10. Fix Elektroden mit Glasionomer Dentalzement (auf Wasserbasis), die extrem hart ist und gibt eine starke Haftung an der darunter liegenden neurocranium.
    Hinweis: Wenn Glasionomer-Zahnzement verwendet wird, sind keine Befestigungsschrauben erforderlich, um die Elektroden zu befestigen.
  11. Lassen Sie den Zement für 5 Minuten trocknen lassen. Schließen Sie die Kopfhaut mit Over-and-über Nähte mit nicht resorbierbaren 5-0 / 6-0 Nahtmaterial. Alternativ können Hautkleber verwendet werden. die Qualität der EEG-Aufzeichnungen auf der Elektrodenimplantationsstelle auf Basis genau zu überwachen. Hinweis: Die Verknöcherung aus den Bohrungen kann vorkommen, dass die Fähigkeit, die Elektroden mit der Zeit zu erheben hat. Dies kann aufgrund von EMG und EKG-Kontamination in reduzierter EEG Qualität zur Folge und kann somit die optimale Aufnahmedauer zu begrenzen.
  12. Für die postoperative Versorgung und Schmerztherapie, siehe Abschnitt 8.
  13. Validate EEG Elektrodenposition post mortem.
    1. Für Euthanasiezu platzieren, um das Tier (e) in einer Inkubationskabine und einführen 100% Kohlendioxid. Verwenden, um eine Füllrate von 10% - 30% des Kammervolumens pro Minute mit Kohlendioxid zur vorhandenen Luft in die Inkubationskammer gegeben. Dies ist angemessen, schnelle Bewusstlosigkeit mit minimalem Leiden für die Tiere zu erreichen.
      Hinweis: Vermeiden Sie plötzliche Exposition wahrnehmungsfähiger Tiere gegen Kohlendioxid-Konzentrationen> 70%, da dies belastender sein gezeigt worden ist.
    2. Beachten Sie jede Maus / Ratte aus Mangel an Atmung und verblasste Augenfarbe. Pflegen CO 2 -Strom für mindestens 1 min nach Atemstillstand. Erwartete Zeit bis zur Bewusstlosigkeit ist in der Regel innerhalb von 2 bis 3 min.
    3. Wenn beide Zeichen beobachtet werden, entfernen Sie die Nagetiere aus dem Käfig; andernfalls sie weiterhin zu CO 2 auszusetzen. Wenn Bewusstlosigkeit innerhalb von 2 bis 3 min nicht aufgetreten ist, überprüfen Sie die Füllrate Kammer.
    4. Um die korrekte Platzierung der Elektroden zu überprüfen, ausrotten Gehirn post mortem, z. B. folgende CO 2 Euthanasie und fixieren sie in 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) über Nacht. Alternativ führen Herzperfusion der Tiere eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung unter Verwendung von (PBS; pH 7,4), gefolgt von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung in PBS gelöst.
    5. Postfix Gehirne für 2 - 4 Stunden in 4% PFA bei RT, gefolgt von Kryoprotektion in 30% Saccharose in PBS und speichern Gehirnen bei 4 ° C bis zur weiteren Verarbeitung.
    6. Mit Hilfe von Proben-Matrix für Kryostat Schnitte, gefrieren Gehirne auf einen Block und schneiden stereotaktische 60 um koronalen Scheiben unter Verwendung eines Kryostats. Berg Scheiben auf Glasobjektträger, der Luft trocknen lassen, und Fleck mit Nissl blau mit Standardtechniken der Stichkanal und ehemalige Elektrodenposition zu visualisieren.
      Anmerkung: Dieser Ansatz zeigt auch, ob die Oberflächenelektroden zu tief zufällig platziert wurden durch eine kleinere Auftreffen auf der Oberseite des Kortex zu verlassen.

7. Stereotaktische Tief Intrazerebrale EEG-Elektrode ImplantatIon

  1. die Kopfhaut und Schädel des Tieres vor der Behandlung wie in den Abschnitten 6.1 - 6.2. Wählen Sie die Art der tiefen Elektroden sorgfältig, wobei unter Berücksichtigung seiner Materialeigenschaften, z. B. Durchmesser und Impedanz und mögliche Verbindung zu den Fühlerleitungen des Senders.
    Anmerkung: Parylen beschichteter Stahl und Wolfram-Elektroden üblicherweise verwendet werden. Die Elektrodeneigenschaften haben die einzelnen experimentellen Bedürfnisse anzupassen. Wenn die Elektroden nicht steril geliefert werden, sollten sie in 70% Ethanol vor der Verwendung inkubiert werden. Da die Elektroden für diese experimentellen Zweck wird ein Wärmebasierte Sterilisation beschichtet sind nicht anwendbar.
  2. Die Bohrungen an den Koordinaten der Wahl, wie in Kapitel 6 mit der stereotaktischen Systems beschrieben. Um die Maus-CA1-Region zum Beispiel Ziel, die als intensiv untersucht Gehirnbereich dient, legen Sie die Differentialelektrode an den folgenden Koordinaten mit Bezug auf Bregma: Schwanz- 2 mm, seitlich 1,5 mm (rechte Hemisphäre)und dorsoventrale (Tiefe) 2 mm. Legen Sie eine epidurale Referenzelektrode auf der Hirnrinde, z. B. Bregmas -6 mm, seitlich von Bregma 1 mm (links oder rechts Hemisphäre) (4D, E).
    Hinweis: Die Kleinhirns Elektrode dient eine Pseudoreferenzelektrode auf dem stillen Bereich des Kleinhirns. Stereotaktische Koordinaten können aus Standard stereotaxische Atlanten für Mäuse und Ratten abgeleitet werden.
  3. Kürzen Sie die Tiefenelektroden auf die erforderliche Länge je nachdem, wie tief in das Gehirn wird sie eingesetzt werden. Schließen Sie den extracranial Teil der Elektrode auf die Edelstahl-Helix des Senders führen durch Biegen beide Abschnitte zu einem Winkel von 90 ° dazwischen.
  4. Clip die tiefe Elektrode an die Sensorleitung des Senders mechanisch. Nicht löten, wann immer möglich, da dies erhebliche Rauschen im EEG-Aufzeichnung auslösen können. Setzen Sie die Edelstahl-Helix des Senders führen durch einen kurzen Abschnitt der Außenisolierung aus Silikon an der Spitze Entfernen vondie Sendeleitung ein steriles Skalpell verwendet.
  5. Rewire die Führung des Senders an der tiefen Hirnelektrode. Achten Sie darauf , eine geeignete und stabile Verbindung der beiden Komponenten (4F). Bringen Sie die implantierte Elektrode (die mechanisch mit der Sendeleitung verbunden ist) mit dem vertikalen Arm der stereotaktischen Gerät.
  6. Befestigen Sie die Elektrode mit Glasionomer Dentalzement (Wasserbasis), die extrem hart ist und gibt eine starke Haftung an der darunter liegenden neurocranium. Lassen Sie den Zement für 5 Minuten trocknen lassen. Schließen Sie die Kopfhaut mit Over-and-über Nähte mit nicht resorbierbaren 5-0 / 6-0 Nahtmaterial. Alternativ können Hautkleber verwendet werden.
  7. die Qualität der EEG-Aufzeichnungen auf der Basis der Elektrodenimplantation Seite genau zu überwachen.
    Hinweis: Die Verknöcherung aus den Bohrungen kann vorkommen, dass die Fähigkeit, die Elektroden mit der Zeit zu erheben hat. Dies kann aufgrund von EMG und EKG-Kontamination in reduzierter EEG Qualität zur Folge und kann somit die optimale rec begrenzenording Dauer. Dies ist von besonderer Bedeutung für die tiefe Platzierung der Elektroden.
  8. Für die postoperative Versorgung und Schmerztherapie, siehe Abschnitt 8.
  9. Validate EEG Elektrodenplatzierung post mortem, wie in Abschnitt 6.13 beschrieben.

8. postoperative Pflege und postoperative Schmerztherapie

  1. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat.
  2. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt.
  3. Für die postoperative Schmerzmanagement, wählen Sie ein Medikament aus einer der folgenden Gruppen: Betäubungsmittel Opioide Opioid - Agonisten / Antagonisten, alpha 2 -Agonisten, Lokalanästhesie und nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAID) 55-60 Bitte beachten Sie, dass aufgrund. die Schwere der Operation a 3 Tage Schmerzbehandlung ist empfehlenswert.
    1. Wenn Buprenorphin verwendet, führen Sie die folgende Dosis: Maus: 0,05- 0,1 mg / kg, ip, sc, jede 6 bis 12 h; Ratte: 0,01 bis 0,05 mg / kg, ip, sc, alle 8 bis 12 Stunden.
    2. Wenn Butorphanol verwenden, verwalten Sie die folgende Dosis: Maus: 1.0 - 5.0 mg / kg, sc, alle 4 h; Ratte: 2,0 bis 2,5 mg / kg, sc, alle 4 Stunden.
    3. Wenn Tramadol verwenden, führen Sie die folgende Dosis: Maus, Ratte: 10 - 30 mg / kg, ip
    4. Wenn Flunixin verwenden, führen Sie die folgende Dosis: Maus: 2,5 mg / kg, sc, alle 12 h; Ratte: 1,1 mg / kg, sc, alle 12 Stunden.
    5. Wenn Ketoprofen verwenden, verwalten Sie die folgende Dosis: Maus: 5 mg / kg, sc, alle 12 bis 24 h; Ratte: 5 mg / kg, sc, alle 12 bis 24 Stunden.
    6. Wenn Metamizol verwenden, verwalten die folgende Dosis: Maus, Ratte: 100 mg / kg, ip, alle 8 Stunden.
    7. Wenn Meloxicam verwenden, verwalten die folgende Dosis: Maus, Ratte: 1 mg / kg sc, alle 24 Stunden.
    8. Wenn carprofen verwenden, verwalten Sie die folgende Dosis: Maus: 5-10 mg / kg, sc, alle 12 bis 24 h; Ratte: 2,5 bis 5,0 mg / kg, sc, alle 12 bis 24 Stunden.
    9. Bei der Verwendung von acetaminophen, führen Sie die folgende Dosis: Maus: 300 mg / kg, po, alle 4 h; Ratte: 100 - 300 mg / kg, alle 4 Stunden.
    10. Bei der Verwendung von Lidocain (als Zusatz Analgetikum), führen Sie die folgende Dosis: Maus, Ratte: 1 - 4 mg / kg sc
  4. Bei der Verwendung von Carprofen (Nagetier Dosierung von 5 bis 10 mg / kg sc, in 0,9% NaCl) für lang anhaltende postoperative Schmerzmanagement, führen Sie die erste Injektion von 10 bis 15 Minuten vor dem Ende des chirurgischen Instrumenten und wiederholen Sie für zwei aufeinanderfolgende Tage einmal täglich.
  5. Postoperativ füttern angefeuchteten Pellets um Nahrungsaufnahme zu erleichtern. Beachten Sie sorgfältig Essen (~ 15 g / 100 g / d; ~ 5 g / 24 h) und Wasser (~ 15 ml / 100 g / d; ~ 5 ml / 24 h) Verbrauch.
  6. Überwachen Tiere eng für die Rückkehr ihrer normalen Haltungen und Verhaltensweisen.
    Hinweis: Die systemische Verabreichung von Antibiotika wie Enrofloxacin oder Trimethoprim-Sulfonamide wird oft empfohlen, aber nicht ein absolutes Muss, es sei denn entzündliche Anzeichen einer Meningitis oder Enzephalitis bei the-Stellen von Implantationen werden erkannt.
  7. Geben Mäuse mindestens 10 bis 14 zusätzliche Tage vollständig zu erholen, bevor EEG-Aufzeichnungen für die weitere Analyse zu starten.
    Hinweis: Spezielle experimentelle Aufgaben können längere Erholungsphasen erfordern.
  8. postoperative Erholung nach der Implantation durch die Auswertung postoperative Entwicklung des Körpergewichts Follow-up. 5 nach der Operation durch eine leichte, aber stetige Gewichtszunahme während einer 10 gefolgt - - 14 Tage Erholungszeit eine maximale Reduktion des Körpergewichts ist in der Regel rund um Tag 4 beobachtet.

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Ergebnisse

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele von Oberfläche und Tiefe, intrazerebrale EEG-Aufzeichnungen erhalten. Zunächst ist festzustellen , dass Basis Aufnahmen unter physiologischen Bedingungen obligatorisch sind vor der nachfolgenden Aufnahmen folgenden zB pharmakologische Behandlung. Eine solche Basis Aufnahmen wertvolle Informationen über funktionale Interdependenz von Gehirn Rhythmik mit unterschiedlichen Verhaltenszustände oder Schlaf / zirkadianen Rhythmik bereitstellen. Hier zei...

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Diskussion

Implantierbare EEG Radiotelemetrie ist von zentraler Bedeutung , da sie eine nicht beschränkende Technik ermöglicht Versuchstiere ist ihr volles Repertoire an Verhaltens 1,3 auszuführen. Dies ist von besonderem Interesse, wie die telemetrisch Ansatz nicht nur spontane EEG-Aufzeichnungen ermöglicht, sondern auch Aufnahmen unter kognitiven Aufgaben und circadian analytische Setups, wie T-Labyrinth, radial Labyrinth, Wasserlabyrinth, Schlafentzug Aufgaben oder wenn ein EEG-Aufzeichnung ist erforderlich oder hilf...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Christina Ginkel (Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen, DZNE), Dr. Michaela Möhring (DZNE) und Dr. Robert Stark (DZNE) für ihre Unterstützung in der Tierzucht und Tiergesundheit. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt vom Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (BfArM) Bonn, Deutschland.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Carprofen (Rimadyl VET - InjektionA2:D43slö PfizerPZN 011020820 ml
Binokulares Mikroskop mit chirurgischer Vergrößerung Zeiss Stemi 20000000001003877, 435540000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Bulldog serrefineF.S.T.18051-2828 mm
Cages (Macrolon)Techniplast1264C, 1290D
KaltlichtquelleSchott KL2500 LCD9.705  202bestellt bei Th.Geyer
Wattestäbchen-Applikatoren (steril)Carl Roth EH12.1
Dexpanthenole (Bepanthen Wund- und Heilsalbe)BayerPZN: 1578818
Tücher (steril)HartmannPZN 0366787
70% EthanolCarl Roth 9065.5
0,3%/3%ige Wasserstoffperoxid-LösungSigma9532130%ige Stammlösung 
Handschuhe (steril)Unigloves1570
Dentalglas Ionomer ZementKentDental /NORDENTA957 321
2%ige GlutaraldehydlösungSigmaG6257
Graefe Pinzettengekrümmt, gezahntF.S.T.11052-10
Halsey Micro Nadelhalter-WolframkarbidF.S.T.12500-1212,5 cm
Sterilisator für chirurgische Instrumente auf WärmebasisF.S.T.18000-50
HeizkissenAEG HK5510520010bestellt bei myToolStore
Hochgeschwindigkeits-DentalbohrerAdeorSI-1708
Irisschere extra dünn F.S.T.14058-099 cm
Betäubungsmittelsystem zur Inhalation (Isofluran)Harvard Apparatus GmbH34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230
IsofluranBaxter 250 mlPZN 6497131
KetaminPfizerPZN 07506004
Laktated Ringer" s Lösung (steril)BraunL7502
Lexar-Baby Schere-gerade, 10 cmF.S.T.14078-1010 cm
Nissl FärbelösungArmin BaackBAA31712159
Nicht resorbierbares Nahtmaterial 5-0/6-0 (steril)SABANA (Sabafil)N-63123-45
Covidien (Sofsilk)S1172, S1173
Halsey NadelhalterF.S.T.12001-1313
cm Pads (steril)ReWa Krankenhausbedarf2003/01
0,9% Kochsalzlösung (NaCl, steril)BraunPZN:8609255
Skalpellklingen mit Griff (steril)propraxis2029/10
Standardmuster PinzettenF.S.T.11000-12, 11000-1412 cm und 14,5 cm Länge
Stahl- und Wolframelektroden parylenbeschichtetFHC Inc., USA)UEWLGESEANND
Stereotaktischer RahmenNeurostar51730Mbestellt bei Stoelting
(Stereo Drive-New Motorized Stereotaxic)
Tapes (steril)BSN medical GmbH & Co. KG626225
TA10ETA-F20 DSI270-0042-001XHochfrequenz-Sender 3,9 g, 
3,9 g, 1,9 ml, Eingangsspannungsbereich &plusMN; 2,5 mV,
Kanalbandbreite (B) 1 - 200 Hz, 
Nennabtastrate (f) 1.000 Hz (f = 5B)
Betriebstemperaturbereich 34 - 41 ° C
garantierte Batterielebensdauer 4 Monate
TL11M2-F20EET DSI270-0124-001XHochfrequenz-Sender 
3,9 g, 1,9 ml, Eingangsspannungsbereich &plusMN; 1,25 mV,
Kanalbandbreite (B) 1 - 50 Hz, 
Nennabtastrate (f) 250 Hz (f = 5B)
Betriebstemperaturbereich 34 - 41 ° C
garantierte Batterielebensdauer 1,5 Monate
Gewebezange - 1x2 Zähne 12 cmF.S.T.11021-1212cm Länge
Wolframkarbid-IrisschereF.S.T.14558-1111,5 cm
Vibroslicer 5000 MZElektronenmikroskopieSciences 5000-005
Xylazin (Rompun)BayerPZN: 1320422

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