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Methodenartikel

Repetitive transkranielle Magnetstimulation auf die Einseitige Hemisphäre von Rattenhirn

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DOI:

10.3791/54217

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22. Oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation Medicine, Chungnam National University Hospital, Daejeon, 2Department of Biomedical Engineering, Seoul National University College of Medicine, 3Institute of Medical and Biological Engineering, Medical Research Center, Seoul National University, 4Department of Biomedical Engineering, Seoul National University Hospital, 5Department of Nuclear Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Gangwon Do Rehabilitation Hospital, 7Department of Rehabilitation Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben die repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS) auf die einseitige Hemisphäre des Rattengehirns angewendet, indem wir eine 25-mm-Spirale 8 1 cm lateral zum Scheitel auf der biaurikulären Linie platziert und die Spule um 45° gewinkelt haben. Für rTMS wurde für mehr als 20 min eine hauseigene Wasserkühlung eingesetzt.

Zusammenfassung

Frühere Nagetiermodelle der repetitiven transkraniellen Magnetstimulation (rTMS) verwendeten die Ganzhirnstimulation anstelle der einseitigen hemisphärischen rTMS, was sich von den Protokollen unterscheidet, die für menschliche Probanden verwendet werden. Wir berichten über eine erfolgreiche Anwendung von rTMS auf die einseitige Hemisphäre des Rattengehirns. Das rTMS wurde mit einem niederfrequenten (1 Hz), hochfrequenten (20 Hz) oder Scheinstimulationsprotokoll an eine Seite des Gehirns abgegeben, wobei eine kleine 25-mm-Spule mit 8 mm verwendet wurde. Wir platzierten die Mitte der Spule 1 cm lateral zum Scheitelpunkt auf der biaurikulären Linie und winkelten die Spule um 45° zum Boden, um einen möglichen direkten Effekt von rTMS auf den kontralateralen Kortex zu minimieren. Außerdem haben wir eine hauseigene Wasserkühlung verwendet, um eine repetitive Magnetstimulation für mehr als 20 Minuten zu ermöglichen, selbst bei einer Stimulationsfrequenz von 20 Hz. Die Zunahme der Transkriptionen von unmittelbaren frühen Genen (Arc, Junb und Egr2) war nach rTMS größer als nach Scheinstimulation. Nach 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit 20-minütiger 1-Hz-rTMS war die bdnf-mRNA-Expression im stimulierten Kortex signifikant höher als auf der kontralateralen Seite. Das hier vorgestellte Modell wird die molekularen Mechanismen der rTMS aufklären, indem es die Analyse des interhemisphärischen Unterschieds in seiner Wirkung ermöglicht.

Einleitung

Repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS), ein Werkzeug für die nicht-invasive Hirnstimulation und Neuromodulation, wurde bei der Behandlung von verschiedenen Bedingungen, wie die zentrale Schmerz 1,2, Depression 3, Migräne 4 und sogar Schlaganfall 5-7 angewendet. Schnell ändernden elektrischen Stroms durch die Spulen auf dem Kopf eines elektrischen Feldes auf der Hirnrinde und einer resultierenden neuronale Aktivierung induziert. Die Erregbarkeit der Großhirnrinde durch rTMS moduliert werden, die für mehr als 30 min dauern kann nach der Stimulation beendet.

Vorgeschlagene Mechanismen der rTMS Nachwirkung sind Langzeit - Potenzierung / depressionsähnlichen Effekt 8, vorübergehende Verschiebung der Ionenbilanz 9 und metabolischen Veränderungen 10. Darüber hinaus al Di Lazzaro et. legen nahe, dass eine intermittierende Theta-Burst-Stimulation der exzitatorischen synaptischen Eingaben beeinflußt Neuronen Trakt pyramidal, sowohl in der stimuliertenund der kontralateralen Hemisphäre 11.

Wesentliche Einschränkungen haben jedoch behindert Forscher aus der Umrechnung auf Bank Beweise zu klinischen Situationen. Zuerst in früheren Tierstudien wurde rTMS für Whole-Brain - Stimulation 12 verwendet. Whole-Hirnstimulation ist ziemlich verschieden von den Protokollen in Humanstudien verwendeten 9. Das andere Problem ist mit der Stimulationsdauer zusammen. Dies ist zumindest teilweise der Tatsache zuzuschreiben, dass ein wirksames Kühlsystem für kleine Spulen in der Vergangenheit nicht verfügbar war.

In den letzten Jahren haben Samen Artikel veröffentlicht worden Möglichkeiten zur Überwindung dieser Schwierigkeiten in der rTMS Experiment auf der Kleintierhirn hindeutet. Durch diesen Tiermodellen wurde gezeigt , dass die Rattenhirn auch ähnlich kortikalen Erregbarkeit Veränderungen wie in humanen in Reaktion auf niederfrequente rTMS 13 zeigt. Noch wichtiger ist, sind zellulären und molekularen Mechanismen der rTMS bei zunehmendng untersuchten Tiermodellen von rTMS verwenden. Ein Beispiel dafür ist , dass eine unterschiedliche Art von hemmenden Interneuron ist bekannt , am empfindlichsten auf intermittierenden Theta - Burst Stimulation 14 zu sein. Nagetier-Modelle von rTMS somit bieten neue Möglichkeiten für die Erkundung vielgesuchte Fragen über die molekularen Grundlagen der rTMS-induzierte Veränderungen. Wenn kleine Tiermodelle von rTMS können in mehr Laboratorien verwendet werden, kann es erheblich beschleunigen und die Forschung in diesem Bereich zu stärken.

Wir beschreiben nun , wie rTMS zur einseitigen Hemisphäre Rattenhirns anzuwenden, eine Erweiterung der früheren Arbeit 15. Stimulation induzierten Änderungen wurden ausgewertet durch Mikro Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und mRNA unter Verwendung von Mikroarrays rTMS-induzierte Veränderungen in der stimulierten Großhirnrinde zu studieren.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden die Tiere überprüft und genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee von Seoul National University Hospital mit.

1. Experimenteller Aufbau

  1. Tiervorbereitung
    1. Lassen Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten 1 Woche an ihre neue Umgebung anzupassen, bevor das Experiment beginnt.
      Hinweis: Obwohl 8 Wochen alten Ratten in der vorliegenden Studie verwendet wurden, kann ein Entwicklungs- oder erwachsenen Gehirn nach den Forschungshypothesen gewählt werden.
  2. Inhalationsanästhesie für Induktion
    1. Einleitung und Aufrechterhaltung einer Narkose mit 5% und 2% Isofluran , gelöst in 40% / 60% und 25% / 75% Sauerstoff / Stickstoff über eine Kammer und Nasenkonus, respectively. Passen Anästhesie Tiefe auf das Niveau der Abschaffung des Pedals Rückzugsreflex bis Fuß Prise richtige anesthetization zu bestätigen.
      HINWEIS: aufgeweckt Tiere verwenden, können eine bessere Wahl in der translationalen Begriffe sein, aber es gibt Schwierigkeiten bei der rTMS und t zu beschränkenhey sind anfällig für übermäßige Belastung.
    2. Überwachung der Körpertemperatur mit einer rektalen Sonde und halten sie bei 37 ° C durch eine homeothermic Decke verwendet wird. Überwachung der Narkosetiefe mit Pedalrückzugsreflex, Temperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz.
  3. Die Umschaltung auf die intravenöse Anästhesie für die Wartung
    1. Bereiten Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer. Katheterisieren eine seitliche Schwanzvene mit 24-Gauge - Katheter für den Übergang zur IV Anästhesie (1A). Last Propofol intravenös (1 mg / [kg · min] über 10 min unter Verwendung von 10 mg / ml Emulsion) an die Tiere. Unterbrechen Sie Isofluran 5 min nach der Propofol-Laden beginnen.
    2. Aufrechterhaltung Propofolsedierung mit einer Infusionsrate von 500 bis 700 & mgr; g / (kg · min) während des gesamten Experiments, wie es in einer früheren Studie 16. Nachtrag Sauerstoff bei 0,8 l / min über einen Nasenkegel.
      HINWEIS: mit Propofol ist es, mögliche Unterdrückung der kortikalen Erregbarkeit durch die inhal zu reduzierenation Mittel 17-19. Jedoch ist Anästhesie in rTMS Experimenten nicht obligatorisch, und awoken Tiere können ebenfalls verwendet werden. Anesthesia Methoden sollten unter Berücksichtigung der Forschungshypothesen entschieden werden.
    3. Verwenden Veterinär Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
    4. Bewerben Magnetstimulation (siehe Abschnitt 2 ) 10 Minuten nach der vollständigen Umstellung auf iv Anästhesie.
  4. Wiederherstellungsbedingungen
    1. Überwachen der Vital während Erholungsphase. Nicht das Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Wenn ein Tier-Operation unterzogen, nicht zurück an die Gesellschaft anderer Tiere, bis sie vollständig erholt.
      HINWEIS: Wenn eine Operation für ein Krankheitsmodell durchgeführt wird, postoperative Schmerzbehandlung notwendig ist. Allerdings ist der Schmerzbehandlung für dieses rTMS Experiment benötigt.

2. Repetitive transkranielle Magnetstimulation

  1. Stimulator und Spule
    1. Tragen Sie die Stimulation durch eine sich wiederholende Stimulator , die zweiphasige Impulse über eine 25 mm Figur-8 - Spule liefert. Die Mitte der Spule 0,5 cm auf den Scheitelpunkt auf der Linie biauricular lateral und Angulate die Spule 45 ° zum Boden.
      HINWEIS: Die maximale magnetische Feldstärke der Spule ist 4,0 T. Die Magnetspule fest an einem Einbau-Halter montiert ist.
  2. Motor Schwelle
    1. Bestimmung der Motorschwelle (MT) an dem Hot Spot, mit dem Zentrum der Spule positioniert 0,5 cm zu dem Scheitelpunkt auf der Linie biauricular seitlich und mit der Oberfläche flach auf die Calvaria. Dies ist die gleiche Methodik in einer früheren Studie verwendet 20.
      HINWEIS: Definieren MT wie die Intensität Mindest Stimulus evoziert 5 oder mehr tastbar Kontraktionen auf der Gegen forepaw von 10 aufeinander folgenden Stimuli. Überprüfen Sie, ob die Stimulation kontralateralen Muskelkontraktion in erster Linie, um sicherzustellen, einseitige Stimulation verursacht.
  3. Die Anwendung von rTMS
    1. Bewerben rTMS 10 min nach der Stabilisierung der tiefen Narkose. Legen Sie die Mitte der Spule an der Ziel rTMS Ort, von den zerebralen Kortex ausgewählt je nach Forschungsfragen. Dann kippen Sie die Spule direkten Kontakt zwischen dem Spulenzentrum und der Oberfläche des Schädels an der Stimulationsstelle zu gewährleisten.
      HINWEIS: Zum Beispiel angulate die Spule 45 ° zum Boden eine potentielle direkte Wirkung von rTMS auf der kontralateralen Kortex (1B und 1C) zu minimieren.
    2. Durch die die Tiere zu einer Sitzung von 20 min rTMS der einseitigen Hemisphäre. Mit der Software-Konsole liefern rTMS mit einer Niederfrequenz (1 Hz), Hochfrequenz (20 Hz), oder Schein-Stimulationsprotokoll und stellen Sie die Stimulationsintensität bei 100-110% der MT.
    3. Führen 1 Hz Stimulation ohne Rest. Mit der Software-Konsole Eingang "1200" Aufnahmen für "20" min). Für 20 Hz-Stimulation führen 2 sec der Stimulation um 28 gefolgtsec Ruhe. Mit der Software-Konsole Eingang "1600" Aufnahmen für "20" min.
    4. Für Scheinstimulation, kippen Sie die Spule senkrecht (90 ° -Drehung) an die Schädelkalotte und legen Sie die Spulenkante 2 cm von Kopfoberfläche (Abbildung 1D). Befestigen Sie den Spulenhalter fest mit dem Hauptgerät; es besteht keine Notwendigkeit, die Spule mit der Hand während des Experiments zu halten.
      HINWEIS: Um für akustische und andere unspezifische Effekte, verschiedene Schein Protokolle kompensieren sollten für verschiedene Stimulationsprotokolle verwendet werden. So kann beispielsweise 1-Hz-Schein-Stimulation für 1-Hz rTMS Experimente verwendet werden.
  4. Die Kühlung der Spule
    1. Verwenden Sie System eine Wasserkühlung repetitiven Magnetstimulation für mehr als 20 Minuten bei 1- und 20-Hz Stimulationsfrequenzen (Abbildung 2) zu ermöglichen. Umlaufen eiskaltes Wasser über die gesamte Länge der Spule während des Experiments umgebenden Überhitzen zu verhindern, auch wenn die Temperatur der Spule oder Stimulator nicht überwacht wird.
      HINWEIS: Im Handel erhältliche gekühlt Ratte Spulen auch verwendet werden können.
    2. Wenn möglich, zu überwachen, indem Sie die Heizung Messer der rTMS Maschine der Spulentemperatur. HINWEIS: Es gibt keine negativen Folgen auf die rTMS Stimulation verbunden waren. Es gibt jedoch eine potentielle Brandgefahr, wenn Metall Ohr-Identifikationsetiketten in der Nähe der anregenden Spule verwendet werden.

3. Micro Positron-Emissions-Tomographie

  1. Tiervorbereitung
    1. Führen Inhalationsanästhesie für die Induktion und iv Anästhesie für die Wartung (siehe Schritt 1.2.1 und 1.3.1). Anwenden 1-Hz rTMS an ein Tier für 10 min bei einer Stimulationsintensität von 100-110% der MT.
    2. Fünf Minuten nach der Stimulation rTMS Beendigung injizieren 1 mCi von 2- [F-18] fluoro-Desoxyglucose (18 FDG) , gelöst in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung intravenös durch eine Schwanzvenenkatheter. Lassen Sie 30 Minuten für 18 FDG - Aufnahme. HINWEIS: Legen Sie die Ratte unter Narkose während der gesamten Mikro-PET Experiment.
  2. Die Bildanalyse
    1. Verwenden Sie einen PET-Scanner für Bildgebung des Gehirns, die Einseitigkeit der Stimulation zu bekräftigen. Rekonstruieren von Bildern mit einem 3-D iterative Algorithmus. Um die Veränderungen im Stoffwechsel von rTMS induziert beurteilen zu können , identifizieren Bereiche von Interesse (ROIs) in den Bildern der Quergehirnabschnitte 21.
  3. Euthanasie
    1. Mikro-PET-Bildgebung, euthanize die Ratten in einer Kammer mit Kohlendioxid vorgefüllt, während die Ratten in tiefer Narkose nach der Durchführung.

4. mRNA Microarray

  1. Euthanasie
    1. Einleitung und Aufrechterhaltung einer Narkose mit 5% und 2% Isofluran , gelöst in 40% / 60% und 25% / 75% Sauerstoff / Stickstoff über eine Kammer und Nasenkonus, respectively. Anesthetize tief auf das Niveau vor dem Pedal Rückzugsreflex bis Fuß Prise Abschaffung enthauptet.
    2. Enthaupten die Ratten für Euthanasie 5 min nach 1 Sitzung von 1-Hz rTMS.
  2. Gewebeernte
    1. Legen Sie Materialien und chirurgische Instrumente in der Reihenfolge der Verwendung, einschließlich gefaltete Papiertücher, einen Knochen Rongeur, Mikroscheren, größere chirurgische Scheren, einem microforcep, ein Nr 10 oder 11 Skalpellklinge, einem Deckel versehenen 10-cm Petrischale aus Glas mit Eis gefüllt und 1,5-ml-Röhrchen. Bereiten Sie einen Plastikbeutel für die Entsorgung von Karkasse.
    2. Machen Sie eine Mittellinie Hautschnitt im Schädel anterioposteriorly. Unverblümt sezieren das weiche Gewebe und die umliegenden Muskeln mit chirurgischen Scheren, und entfernen Sie den Schädelknochen Stück einen Knochen Rongeur verwenden. Schnell die frische Gehirn sezieren vorsichtig aus dem Schädel. Dann legen Sie es auf Eis durch die microforceps und Mikroscheren verwenden. Spülen Sie das Hirngewebe in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung.
    3. Übertragen Sie das Gehirn auf Trockeneis sofort und anschließend lagern bei -80 ° C in einem Rohr bis zur weiteren Verarbeitung.
    4. Tauen Sie das Hirngewebe vor der Ernte.
    5. Legen Sie das Gehirn dorsalen Seite nach oben, und ernten das Hirngewebe aus dem stHirnrinde (rund um die Hot-Spot im primären motorischen Kortex) auf Eis imulated durch die microforceps und Mikroscheren verwenden. Legen Sie das gewonnene Gewebe in der 1,5-ml-Tube.
  3. RNA-Präparation
    1. Extrahieren Sie Gesamt - RNA aus Gewebehomogenisate mit Lysereagenz 22. Prozess mit DNase Verdauung und Clean-up-Verfahren. Quantifizierung der RNA-Proben und Aliquots und lagern Sie sie bei -80 ° C bis zur Verwendung.
    2. Für die Qualitätskontrolle, RNA Reinheit und Integrität zu bewerten durch Gelelektrophorese Denaturierung bei einem OD-Verhältnis von 260: 280, und analysieren sie auf einem im Handel erhältlichen Analysator.
  4. Labeling und Reinigung
    1. Amplifizieren und die Gesamt-RNA zu reinigen, indem eine kommerziell erhältliche RNA Amplification Kit unter Verwendung von biotinylierten cRNA zu ergeben. Kurz gesagt, revers transkribieren 550 ng Gesamt-RNA in cDNA durch eine T7-Oligo (dT) -Primer verwendet wird. Synthetisieren und in vitro transkribieren den zweiten Strang der cDNA und beschriften Sie es dann mit Biotin-NTP.
    2. Nach purifizierung, quantifizieren cDNA durch Verwendung eines Spektrophotometers.
  5. Die Hybridisierung und Datenexport 23
    1. Verwenden Sie den Ausdruck BeadChip für die mRNA-Expressionsanalyse. Hybridisierung der markierten 750-ng cDNA Proben jeder Ratte-12-Expression bead array für 16 bis 18 Stunden bei 58 ° C. Führen Sie die Erkennung von Array-Signal durch Streptavidin-Cy3 verwendet wird.
    2. Scan-Arrays mit einem konfokalen Scanner. Führen Sie Array-Daten-Export Verarbeitung und Analyse durch einen im Handel erhältlichen Software.

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Ergebnisse

Fünfzehn 8 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden für eine separate Interraterreliabilität Analyse von MT Bestimmung verwendet. Mit Palpation von Muskelzuckungen, waren die MTs erhältlich in allen Ratten und gemessen als 33,00 ± 4,21% der maximalen Stimulator Ausgang (% MSO) und 33,93 ± 0,88% MSO, die jeweils von zwei unabhängigen Forschern. Bland-Altman-Bias war -0,93, und die 95% Grenzen der Vereinbarung waren -9,13 bis 7,26%.

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Diskussion

Das primäre Ziel dieser Studie war es, ein Tiermodell der einseitigen rTMS einzuführen. Obwohl einseitige Stimulation eines der grundlegenden Merkmale des menschlichen rTMS Forschung ist, haben viele Studien nicht in kleinen Tieren angenommen. Jedoch Rotenberg et al. 15 aufgezeichnet kontralateralen MEPs mit Stimulation von 100% MT eine Figur-8 - Spule mit einem Außenlappens Durchmesser von 20 mm, während die Stimulation mit 112,5% und 133,3% MT erzeugt ipsilateral sowie kontralateralen MEPs ve...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den von der koreanischen Regierung finanzierten Korea Research Foundation Grant unterstützt (KRF-2008-313-E00458). Die Autoren danken Jin-Joo Lee für die technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Homöotherme Decke mit einer rektalen SondeHarvard-Gerät507222F
Isofluran (Foran sol.)Choongwae
Propofol (Provive Inj. 1% 20 ml)Claris Lifesciences
Repetitiver magnetischer Stimulator (Magstim Rapid2)Magstim Company Ltd
25 mm SpuleMagstim Company Ltd1165-00
PET-CTGE Healthcare
QIAzol LysereagenzQiagen(US-Patent Nr. 5,346,994)
RNeasy Lipid Tissue Mini KitQiagen74804
RNeasy Mini Spin SäulenQiagen(Mat Nr. 1011708)
Agilent 2100 BioanalysatorAgilent Technologies
Ambion Illumina RNA-AmplifikationskitAmbion
Nanodrop SpektralphotometerNanoDropND-1000
Illumina RatRef-12 Ausdruck BeadChipIllumina, Inc.
Amersham Fluorolink Streptavidin-Cy3GE Gesundheitswesen Biowissenschaften

Referenzen

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Unilaterale rTMSStimulation des RattengehirnsAchtspuleWasserkühlungssystemBestimmung der motorischen SchwelleImmediate Early GenesBDNF-ExpressionGlukosestoffwechselinterhemisphärische Unterschiede
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