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Isolieren von Mesangiogenic Progenitorzellen (MPL) aus menschlichem Knochenmark

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DOI:

10.3791/54225

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15. Juli 2016

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1Department of Clinical and Experimental Medicine, University of Pisa

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein optimiertes, hochreproduzierbares Protokoll zur Isolierung von mesodermalen Vorläuferzellen (MPCs) aus menschlichem Knochenmark (hBM). MPCs wurden mittels Durchflusszytometrie und Nestin-Expression charakterisiert. Sie zeigten die Fähigkeit, exponentiell wachsende MSC-ähnliche Zellkulturen hervorzubringen und gleichzeitig ihr angiogenes Potenzial zu erhalten.

Zusammenfassung

In einer Forschungsstudie, die darauf abzielte, aus menschlichem Knochenmark (hBM) gewonnene mesenchymale Stromazellen (MSCs) für klinische Anwendungen zu isolieren, haben wir eine neuartige Zellpopulation identifiziert, die speziell für das Wachstum in humanem Serummedium ausgewählt wurde. Diese Zellen zeichnen sich durch morphologische, phänotypische und molekulare Merkmale aus, die sich von MSCs unterscheiden, und wir haben sie als mesodermale Vorläuferzellen (MPCs) bezeichnet. MPCs sind rund, mit einer dicken, stark brechenden Kernregion; Sie zeigen eine starke, Trypsin-resistente Haftung auf Kunststoff. Das Versäumnis, die MPCs zu erweitern, zeigte direkt, dass sie langsam zyklisch sind. Dies wird auch durch die Ki-67-Negativität nahegelegt. Auf der anderen Seite führte die Kultivierung von MPCs in Standardmedien, die für die MSC-Expansion ausgelegt sind, zu einer Population exponentiell wachsender MSC-ähnlicher Zellen. Neben der mesenchymalen Differenzierungsfähigkeit behielten MPCs ihr angiogenes Potenzial bei, was ihre Mehrfamilien-Vorläufernatur bestätigt. Hier beschreiben wir ein optimiertes, hochreproduzierbares Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von hBM-MPCs durch Durchflusszytometrie (CD73, CD90, CD31 und CD45), Nestin-Expression und F-Aktin-Organisation. Protokolle zur mesengenen und angiogenen Differenzierung von MPCs werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Hier schlagen wir auch eine passendere Nomenklatur für diese Zellen vor, die in "Mesangiogene Vorläuferzellen" umbenannt wurde.

Einleitung

Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind von relevanten klinischen Wert für ihre Multilinien Differenzierungsfähigkeit und ihre Fähigkeit , die Blutbildung zu unterstützen, zu sezernieren Wachstumsfaktoren / Zytokine sowie eine Rolle in der Immunregulation 1 spielen. In der Definition von MSC-basierte Therapien Zellproduktion und Anwendung haben sich die Aufgabe gestellt umfangreichen klinischen und präklinischen Forschung 2, mit besonderem Augenmerk auf spezifische internationale Regelung für die Sicherheit und Wirksamkeit von zellbasierten Arzneimittel (CBMP) Behandlungen 3. Menschliche MSCs sind ausführlich in Medien kultiviert Ergänzungsmittel und Reagenzien von tierischen Ursprungs, wie fötalem Rinderserum (FBS) und Rinder-Trypsin enthält. Daher neben mit Infektionsrisiken im Zusammenhang mit Zellmanipulation, Patienten auch Prion-Exposition sowie immunologische Risiken im Zusammenhang mit Proteinen, Peptiden oder anderen Biomolekülen tierischen Ursprungs stellen, die nach der Zellernte und TRANS bestehen könntetation 4.

Um das Problem zu umgehen, kultiviert wir dem menschlichen Knochenmark (HBM) abgeleitetes MSCs in tierfreien Medium, ersetzt FBS mit gepoolten menschlichen Typ AB-Serum (PhAbs). Unter diesen Bedingungen neben wachsenden MSCs identifizierten wir eine neuartige Zellpopulation. Diese Zellen wurden morphologisch und phänotypisch unterschiedlich von MSCs und zeigte eine ausgeprägte Genexpressionsprofil sowie charakteristische Anbau / Haftungseigenschaften. Sie behielten beide mesengenic und angiogene Potential und wurden daher mesodermalen Progenitorzellen (MPL) 5 genannt. Anschließend konnten wir selektive und reproduzierbare Kulturbedingungen zu definieren MPCs bei hohen Grad von Reinheit 6 zu erzeugen.

Wir untersuchten weiter die morphologischen und biologischen Eigenschaften von MPL. Die MPL zeigte durch lange Telomere 5 gekennzeichnet Nestin-positiv, langsam im Radsport, Ki-67-negativ, und mit den Chromosomen zu sein. Sie drückten Pluripotency-assoziierten Transkriptionsfaktoren Oct-4 und Nanog statt MSC Master Regler Runx2 und Sox9 7. Phenotypisch, ausgedrückt MPCs Endoglin (CD105) auf einer niedrigeren Ebene als MSCs während mesenchymalen Marker CD73, CD90, CD166 fehlt. MPCs zeigte auch ein charakteristisches Muster von Adhäsionsmolekülen durch konsequente Expression von PECAM (CD31) , dadurch gekennzeichnet, Integrine & alpha; L (CD11a), & alpha; M (CD11b), & agr; X (CD11c) sowie Integrin β2 (CD18) , die podosome artige Strukturen spezifisch aufrecht 8 . Im Standard - MSC Expansion Medien, MPCs prompt in MSCs durch eine Zwischenstufe differenziert mit der Aktivierung von Wnt5 / Calmodulin Zellsignal 9. MPCs behielt auch angiogene Eigenschaften, wie durch ihre Fähigkeit unter Beweis gestellt von Sphäroiden in murine extrazellulären Matrix (ECM) Protein 3D-Kulturen zu sprießen. Die angiogene Potential wurde schnell nach MPC Differenzierung entlang der mesengenic Linie verloren.

Hier präsentieren wir proProtokolle optimiert zu isolieren und zu hochgereinigten MPCs von HBM Blutproben zu charakterisieren. Reproduzierbare Protokolle für MPC mesengenic und angiogene Differenzierung werden ebenfalls beschrieben.

Protokoll

HINWEIS: Nach der schriftlichen Zustimmung HBM Proben wurden während der orthopädischen Chirurgie für Hüftoperation erhalten. Unmittelbar nach dem Oberschenkelhals Osteotomie und vor femoralis eine 20-ml-Spritze, die 500 UI von Heparin Aufreiben, verwendet wurde frisch BM abzusaugen. Das Protokoll ist allgemein anwendbar auf jede BM Quelle betrachtet werden.

1. Isolierung von menschlichem Knochenmark mononukleären Zellen (HBM-MNU)

  1. Verdünnte von 5 bis 10 ml frischem BM bis 50 ml, Aufbringen Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) und durch Invertieren mischen. verteilen Ebenso 25 ml in zwei neue 50 ml konische Röhrchen, 25 ml D-PBS zu jedem Röhrchen und mischen durch Umdrehen.
  2. Ermöglichen die Röhrchen für 10 min bei Raumtemperatur stehen, zur Trennung mineralischer Knochenfragmenten und Fett aus der Lösung.
  3. Entfernen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pasteur-Pipette und Filterzellsuspension durch 70 & mgr; m Filter ohne Störung des Mineralknochenfragment Pellet Floating Fett.
  4. Stellen Sie vier 50-ml-Röhrchen mit 15 ml Medium für diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation (1,077 g / ml). Stellen Sie sicher, dass dieses Medium bei Raumtemperatur ist.
  5. Sanft legen 20 bis 25 ml verdünntem BM oben auf Dichtegradientenmedium. Diese Operation sorgfältig Zellsuspension trickle an den Rohrwänden zu lassen Mischungsschichten zu verhindern.
  6. Durchführung Dichtegradienten Zentrifugation bei 400 xg für 30 min bei Raumtemperatur mit Bremse deaktiviert.
  7. Sammeln Sie die weißlich Ring zwischen den beiden Phasen befindlichen Zellen mit einer sterilen Pasteurpipette und übertragen sie in ein frisches 50-ml-Tube.
  8. Wasche die Zellen mit frischem Kulturmedium: Phenolrot-frei, niedrige Glukose (1000 mg / l) nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% (v / v) gepooltem humanem AB-Typ-Serum (PhAbs), 2 mM L-Glutamin und Antibiotika (DMEM / 10% PhAbs). Zentrifuge bei 400 × g für 5 min.
  9. Überstand entfernen und wieder auszusetzen Pellet in 5-10 ml frischem DMEM / 10% PhAbs.
  10. Fahren Sie mit Zellzahl.Bestimmen Sie die Anzahl der weißen Blutkörperchen durch 1: 1-Verdünnung in Trypanblau. Wenden Sie diese auf die Zählkammer und beobachten unter einem Phasenkontrastmikroskop. Ausschließen klein und perfekt abgerundeten Erythrozyten und blau gefärbten toten Zellen aus der Zellzahl.
    HINWEIS: Es wird dringend für ihre Leistung in MPC Recovery Bildschirm PhAbs Chargen empfohlen. PhAbs aus den USA Quellen haben die besten Ergebnisse, während die meisten Seren unterschiedlicher Herkunft in MPC Kulturen mit höheren Anteilen von MSC-ähnlichen Zellen resultierte gegeben.

2. Isolierung von MPL von HBM-MNU

  1. Set hydrophobe T-75 - Kolben mit 15 ml frischem DMEM / 10% PhAbs und lassen pH und Temperatur durch Vorinkubation in 5% CO 2 für 30 min bei 37 ° C äquilibrieren.
  2. Seed 4 - 6 x 10 7 HBM-MNU pro Kolben und Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 für 48 Stunden.
  3. Absaugen und Medium und nicht haftenden Zellen aus den Kolben zu verwerfen. 15 ml frischem DMEM / 10% PhAbs und Inkubation bei 37 ° Cin 5% CO 2. Pflegen Kulturen für 6 - 8 Tage Mediumwechsel alle 48 Stunden.
    OPTIONAL: MPC Rendite, nicht haftenden Zellen von 2,3 zu erhöhen, erneut plattiert in einem neuen Kulturflasche und gepflegt für die Primärkulturen wie beschrieben werden könnte.
  4. Absaugen und entsorgen Medium aus den Kolben, waschen mit frischem DMEM und 2 ml freier Protease Tier Ablösen Lösung. bei 37 ° C inkubieren 5 bis 15 min (Vermeidung längerer Inkubation).
  5. 10 ml frischem DMEM / 10% PhAbs absaugen Zellsuspension und Zentrifuge bei 400 xg für 5 min
  6. Absaugen und Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren Pellet in 1 bis 2 ml frischem DMEM / 10% PhAbs. Fahren Sie mit Zellzahl, wie in Schritt 1.10 beschrieben.
    HINWEIS: Verwenden Sie Trypsin / EDTA nicht als Reagenz löst. MPCs sind Trypsin resistent. Morphologische Screening der Kulturen, vor der Zellernte, wird dringend empfohlen, um das Vorhandensein von spindelförmigen MSC-ähnlichen Zellen zu bewerten. Im Falle beträchtliche Menge an MSC-ähnlichen Zellen sind detected, erhöhen die Reinheit des Zellprodukt durch selektives die verunreinigten Zellen zu entfernen. Dazu kann Trypsinverdaus vor durchgeführt werden, um MPC Ernte, durch Zugabe von 2 ml Trypsin / EDTA 0,05% für 2 min. Wasch Kulturen zweimal mit 5 ml DMEM / 10% PhAbs, dann gehen die Behandlung wie oben Protease ist.

3. Zell Characterization

  1. Durchflusszytometrie
    1. Einrichten Doppelproben von 10 5 frisch abgelösten Zellen in Waschlösung D-PBS ergänzt mit 0,5% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA) und 0,02% (w / v) Natriumazid. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min.
      ACHTUNG: Natriumazid ist giftig.
    2. Re-suspendieren Pellets in 200 ul Waschlösung und fügen anti-CD90, anti-CD45, anti-CD73 und anti-CD31-Antikörper, konjugiert mit fluoreszierendem Farbstoffen ( "Test"); parallel Isotypkontrollen einrichten ( "CTRL").
      HINWEIS: Die Mengen Antikörper-Färbung sollte durch Titration oder accor bestimmt werdending den Anweisungen des Herstellers.
    3. Inkubieren Proben bei 4 ° C für 30 min.
    4. Zentrifuge bei 400 × g für 5 min. Re-suspendieren Zellen in 500 & mgr; l Waschlösung und erwerben mindestens 5 x 10 4 Ereignissen auf Mehrfarben Durchflusszytometer 7 9 10.
    5. Analysieren Ergebnisse durch Dot-Plots und mit "CTRL" aufgezeichneten Ereignisse Quadranten zu setzen.
      HINWEIS: Um die Kultur als MPC Kultur der Anteil der CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + Zellen zu definieren , sollte mehr als 95% betragen. Für einige spezifische Anwendungen, dh Genexpressionsanalyse hat der Wiederherstellungs cut-off bis 97 erhöht werden - 98%.
  2. Nestin Erkennung und F-Actin-Organisation Analyse
    1. Teller frisch isolierten MPCs auf Kulturkammer Dias (20.000 / cm 2). Erlauben Zellen durch Inkubation über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2 anhaften.
    2. Wash-Zellen in Waschlösung und fix in 4% (w / v) Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 min. Zum Entfernen Fixiermittel Waschlösung hinzufügen, Inkubation für 2 Minuten und gießen.
    3. Wiederholen Waschen zweimal.
    4. Permeabilisieren Zellen in D-PBS, supplementiert mit 0,05% (v / v) Triton X-100 für 15 min bei RT.
    5. Stopp-Reaktion durch Protein freien Signalverstärker (30 min bei RT) oder Standard-Blockierungslösung (D-PBS, ergänzt mit 3% (w / v) BSA).
    6. Entfernen Sie Signalverstärker / Blocking-Lösung.
    7. ADD 7 & mgr; g / ml (w / v) von anti-humanen Nestin primären Antikörper und Inkubieren bei 4 ° C über Nacht in einer befeuchteten Kammer. Parallel dazu verwenden Isotypiekontrolle Antikörper keine spezifischen Fluoreszenzsignale zu bewerten.
    8. Waschen Sie gleitet durch D-PBS Zugabe, lassen für 2 Minuten und gießen. Zweimal wiederholen.
    9. Fügen Sie 2 & mgr; g / ml (w / v) der Fluoreszenzfarbstoff konjugierten sekundären Antikörper und Inkubieren bei 4 ° C für 1 Stunde im Dunkeln.
    10. Wash gleitet wie oben.
    11. In fluoreszierenden Phalloidin (5 UI / ml), lassen bei RT für 30 min im Dunkeln und wasche 3mal in D-PBS.
    12. Entfernen Sie die Kammerwände und montieren Folien in wässrigen Eindeckmittel mit Antifade Reagenz ergänzt und 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) für Kerne Erkennung. Gehen Sie 7 9 10 bis Bildgebung.

4. Mesengenic Differenzierung von MPL

  1. Plate 2 x 10 4 / cm 2 frisch isolierten MPCs in TC-behandelt T75 Kulturflaschen und lassen Zellen anhaften über Nacht in DMEM / 10% PhAbs bei 37 ° C in 5% CO 2.
  2. Ersetzen DMEM / 10% PhAbs mit Standard reduzierten Serummedium, etwa 200 & mgr; l / cm 2, bestimmt für mesenchymale Stromazellen Expansion (MSC-RS - Medium). Zellen wachsen zu Konfluenz (P1-MSCs), typischerweise von 7 bis 10 Tagen von der Induktion. Aktualisieren Medium alle 2 Tage.
  3. Absaugen und entsorgen Medium aus den Kolben, waschen mit frischem MSC-RS-Medium und 2 ml freier Protease Tier Ablösen Lösung. Inkubieren bei 3776; C für 5 bis 15 min (Vermeidung längerer Inkubation).
  4. 10 ml frisch MSC-RS Medium absaugen Zellsuspension und Zentrifuge bei 400 xg für 5 min
  5. Überstand entfernen und wieder auszusetzen Pellet in 1 bis 2 ml frischem MSC-RS Medium. Fahren Sie mit Zellzahl wie in Schritt 1.10
  6. Gehen Sie zur Subkultur sie durch Impfen von 3 bis 5 x 10 3 Zellen / cm 2. Wachsen Zellen bis zur Konfluenz (P2-MSCs).
  7. Ernten Sie die Zellen durch Protease Verdauung von Schritt beschrieben 4.3 4.5 zu Schritt und Charakterisierung gehen Sie wie in Abschnitt 3 beschrieben.
    HINWEIS: Ein bestimmter Prozentsatz von CD73 + CD90 + CD45 neg CD31 neg Zellen weniger als 95% würden nur eine partielle Differenzierung zeigen und eine weitere Kulturpassage erfordern.
  8. Platte P2-MSCs bei 2 x 10 4 / cm 2 in sechs gut TC-behandelten Platten und wachsen in MSC-RS - Medium bis zur Konfluenz.
  9. Mark zwei Brunnen als "No Diff" und aktualisieren Sie MSC-RS Medium.
  10. Mark zwei guts als "Osteo" und ersetzen Medium mit 200 & mgr; l / cm 2 von Standard osteogenen Medium, die speziell für die Differenzierung MSC konzipiert.
  11. Mark zwei Brunnen als "Adipo" und ersetzen Medium mit 200 & mgr; l / cm 2 von Standard adipogenetische Medium, das speziell für die MSC - Differenzierung.
  12. Pflegen Kulturen bei 37 ° C in 5% CO 2 von der gesamten Medien jede 48 Stunden ändern.
    HINWEIS: Es ist sehr kommerziell erhältlichen Standard Differenzierungsmedien für Test Reproduzierbarkeit empfohlen zu verwenden. Nach 2/3 Wochen unter Differenzierungsbedingungen, erscheinen Kalziumablagerungen in den Kulturen osteogenen induziert, während die intrazelluläre Akkumulation Lipidtröpfchen in adipogenetische induzierten Zellen zu erkennen ist.
  13. Absaugen und entsorgen Kulturmedien waschen dann mit D-PBS.
  14. Fix die Kulturen durch Zugabe von 1 ml von 4% (w / v) Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur.
  15. Zum Entfernen Fixiermittel hinzufügen 2 min D-PBS, Inkubation und gießen. Wiederholen Waschenzweimal.
  16. Stain ein "Nein Diff" zusammen mit den beiden "Osteo" Brunnen markiert in Hydroxyapatit spezifische fluoreszierende Lösung und ein "Nein Diff" zusammen mit den beiden "Adipo" Brunnen markiert in 200 nM Nile Red-Lösung. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur 11,12.
  17. Entfernen Sie Lösungen Färbung und waschen in D-PBS zweimal.
  18. Entfernen D-PBS, fügen D-PBS , ergänzt mit 50% (v / v) Glycerin und fahren Sie mit Imaging - 7 9 10.

5. MPC Sphäroid Sprouting Assay

  1. Zur Herstellung von 3D - Sphäroiden, lag 20 ul Tropfen frisch isolierten MPC - Suspension (1,5 x 10 4 Zellen / Tropfen) auf der inneren Oberfläche der Petrischale mit Deckel.
    HINWEIS: Handhabung Tropfen zu ihren Bruch führen könnten, ist es sehr empfehlenswert ist, sie über zu legen.
  2. Verwenden Sie den Deckel vorsichtig eine Petrischale mit D-PBS zu rekapitulieren hängenden Tropfen Verdunstung zu verhindern. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2über Nacht Zellen zu ermöglichen in 3D Sphäroide zu aggregieren.
  3. Legen Sie ein dickes Gel von murinen extrazellulären Matrix (ECM) Proteine ​​durch Zugabe von 300 ul Aliquots von Standard-ECM-Proteine ​​in einem vorgekühlte 24-Well-Kulturplatte, und bei 37 ° C für 30 min.
  4. Vorsichtig die Schalendeckel Petri umkippen und sanft die Sphäroiden mit einer sterilen Pasteur-Pipette abholen.
  5. Lay Sphäroiden auf das ECM - Protein - Gel, fügen 700 ul Aliquots von Standard - VEGF-reiche endothelialen Zellwachstumsmedium und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2.
  6. Nach 24 Stunden und 7 Tage der Kultur, machen Sie Fotos von der 3D-Kulturen bei Vergrösserungs 4X. Auswerten von Sphäroiden sprießen die Anwendung der Bildanalyse-Software durch den radialen Abstand zwischen dem letzten eindringenden Zelle und dem Sphäroid Kante zu messen. Wiederholungsmaßnahmen entlang mindestens 20 verschiedenen Richtungen. Der mittlere Abstand wird als positiv angesehen, wenn 50 & mgr; m oder mehr beträgt.

Ergebnisse

Die selektiven Kulturbedingungen hier beschrieben haben , die Isolierung eines neuartigen haftend und fast monomorphic Zellpopulation als 1,0% des HBM-MNU erlaubt (0,5-2,0 x 10 6 HBM-MNU von 5 bis 10 ml frischem BM Proben) 5,6 . Wir identifizierten diese große (40 - 60 & mgr; m im Durchmesser), gerundet, Ruhe, Ki-67-negativen Zellen als MPL 5. Morphologisch, werden sie durch eine ausgeprägte Spiegelei-Form mit einem dicken Kernbereich durch einen flachen , dünnen Rand zeigt viele Filopodien bei höheren Vergrößerungsleistung (weiße Pfeile in Abbildung 1 A.1) umgeben gekennzeichnet. Polar Dehnung der äußeren Zellgrenze wird häufig beobachtet (schwarze Pfeile in Abbildung 1 A.1). Solche Morphologie ist deutlich verschieden von der typischen spindelförmigen Aussehen mesenchymalen Stromazellen in Standard MSC Kulturen berichtet. Durchfluss-Zytometrie zeigte über 95% der frisch isolierten MPCs CD31 und CD45, während m auszudrückenesenchymal assoziierte Marker CD90 und CD73 13 waren nicht nachweisbar (Abbildung 1 A.2). Wir betrachten dies eingeschränkten Satz von vier Antigene für die MPL als Hinweis. Weitere Unterscheidungsmerkmale der MPCs sind punktierte F-Aktin Verteilung eine Anzahl von podosome artigen Strukturen (rot in Abbildung 1 A.3) und intensive Expression von Nestin (grün in Abbildung 1 A.3) offenbart, das nicht in den Zellen festgestellt wird gefärbt mit Isotypiekontrolle Antikörper (Daten nicht gezeigt).

Die Kultivierung MPCs in Standard - RS - Medium konzipiert für MSC Expansion führt zu einer schnellen Differenzierung in exponentiell wachsenden MSC-ähnlichen Zellen (Abbildung 1 B.1). Nach zwei Passagen Zellen schließlich ihren Phänotyp von CD73 neg CD90 neg CD45 + CD31 + CD73 + zu CD90 + CD45 neg CD31 neg (Abbildung 1 B.2) wechseln. In dem Prozess, MPCs Wieder organize F-Aktin in Stressfasern während nestin Ausdruck zu einigen seltenen Zellen (Abbildung 1 B.3) beschränkt wird. MPC mesengenic Differenzierung in eine bestimmte MSC-ähnlichen Phänotyp erfolgt durch zwei verschiedene Schritte, die von verschiedenen Zell Morphologien enthüllt. Nach einer Woche in MSC RS Medium eine Restpopulation von MPC-ähnlichen Zellen noch nachweisbar innerhalb einer konfluenten Schicht von flachen, polygonalen mehrfach verzweigten Zellen (P1-MSCs in Abbildung 2 A). Ein weiterer Durchgang erforderlich , um eine fast monomorphe Kultur von spindelförmigen MSC-ähnliche Zellen (P2-MSCs in Figur 2 A) zu erhalten. Diese exponentiell wachsende Zellen können leicht unterscheiden zu Osteoblasten oder Adipozyten wenn sie für mindestens 2 Wochen in Selektionsmedien überführt, wodurch deren MSC Art bestätigt. In osteogenen induzierten Kulturen, entweder durch kolorimetrische Alizarin-S - Färbung oder spezifische fluoreszierende Farbstoffe (grün in Abbildung 2 B) erfasst werden , um Ablagerungen Kalzium kann. Nach adipogenetische Induktions Zellenzeigen Lipidtröpfchen Akkumulation als entweder durch kolorimetrische Oil Red oder fluoreszierende Nile Red - Färbung (rot in Abbildung 2 B) ergab.

MPC Typisierung wurde durch Sprossung Angiogenese-Test bestätigt. MPCs zeigte ihre Fähigkeit , von 3D - Sphäroiden nach 24 Stunden VEGF-Stimulus (Abbildung 2 C) (mehr als 50 & mgr; m) murine ECM - Protein - Gel einzudringen. 600 & mgr; m Abstand - Nach einer Woche eindringenden Zellen wurden bei 300 festgestellt. Im Gegensatz dazu wurde Invasion Kapazität nach mesengenic Differenzierung in P2-MSCs verloren (Abbildung 2 D).

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Abbildung 1. Frisch isolierte MPCs haben Besondere Merkmale. Die Anzucht HBM-MNU in DMEM / 10% PhAbs für sieben Tage gibt Anlass zu einer Bevölkerung von Ruhe MPL (A) leicht von MSCs (B) in Bezug auf die Morphologie (A.1, B.1, Maßstabsbalken = 100 & mgr; m), Phänotyp (A.2, B.2), F-Actin-Verteilung (rot in A.3, B.3) und nestin Ausdruck (grün in A.3, B.3, Maßstabsbalken = 20 & mgr; m). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. MPCs Differenzieren in Standard - MSCs und zeigen Sprießen Angiogenesis in vitro. Ersatz von DMEM / PhAbs mit handelsüblichen RS - Medium konzipiert für MSC Expansion löst mesengenic Induktion von MPL. Nach einer Woche in Kultur sind wenige Rest MPL noch nachweisbar (P1-MSCs) , während eine weitere Passage in MSC-RS Medium führt zu einer Population von konfluenten MSC-ähnlichen Zellen (P2-MSCs, ein Maßstabsbalken = 100 & mgr; m). P2-MSCs unterscheiden terminal in Osteozyten oder Adipozyten unter geeigneten Stimuli , wie durch Kalkablagerung (grün in B) und Lipidtröpfchen Ansammlung (Rot in B, Maßstabsbalken = 200 & mgr; m) ergab, respectively. MPCs zeigen konsistente Sprießen von Sphäroiden in murine ECM - Protein - Gel (C) bei einer Differenz mit P2-MSCs (D, Maßstabsbalken = 1,0 mm). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

In den letzten Jahrzehnten wurden MSCs umfassend erforscht und präklinisch auf eine mögliche Anwendung bei der Behandlung verschiedener Knochen-/Gelenk-, immunologischer, neurologischer, kardiovaskulärer, gastrointestinaler und hämatologischer Erkrankungen untersucht14,15. Die einfache und kostengünstige Isolierung multipotenter MSCs aus vielen verschiedenen Geweben sowie das Fehlen einer signifikanten Immunogenität16 tragen dazu bei, dass diese Zellen zu einer der interessantesten Zellpopulationen für zellbasierte Therapien werden. Nichtsdestotrotz stellt die sehr geringe Häufigkeit im Ursprungsgewebe eine große Einschränkung für die Anwendung von MSCs in Kliniken dar und zwingt die Vermehrung dieser Zellen in vitro vor der Infusion oder Transplantation.

Erweiterte MSC-Kulturen haben ein hohes Maß an Heterogenität und Variabilität17-19 gezeigt, was es schwierig macht, einen Konsens über die MSC-Produktions- und Charakterisierungsprotokolle zu erzielen. Darüber hinaus deuteten neuere Untersuchungen auf das Vorhandensein mehrerer in vivo MSC-Vorfahren in einer Vielzahl von Geweben hin, was zur Heterogenität der Kultur beiträgt10,20. Tatsächlich wurde vorgeschlagen, dass bestimmte Kulturbedingungen möglicherweise bestimmte Subpopulationen von MSCs-Vorläuferzellen selektieren oder einfach fördern, die in unterschiedlichen Prozentsätzen in "rohen" und unverarbeiteten Proben wie Knochenmark (hBM-MNCs) oder Fettgewebe (stromale Gefäßfraktion) vorkommen2. Daher stellt die Variabilität der MSC-initiierenden Zellpopulationen zusammen mit der großen Anzahl unterschiedlicher Anreicherungs-/Isolierungs- und Kulturprotokolle ein großes Hindernis für die Definition praktikabler MSC-basierter Therapien dar.

Ein entscheidender Faktor, der die Heterogenität von MSC-Kulturen beeinflusst, ist die Serumsupplementierung21. In unseren Händen führte der Ersatz von FBS durch PhABS in Primärkulturen aus hBM-MNCs, kombiniert mit einer hochdichten Aussaat auf hydrophoben Kunststoffen, zur Isolierung einer neuartigen hochadhärenten Zellpopulation mit unterschiedlichen biologischen Merkmalen, den MPCs5,6. Wir beobachteten, dass die Zugabe kleiner Prozentsätze von PhABS zu FBS-Primärkulturen ebenfalls eine MPC-Isolierung ermöglichte, was auf das Vorhandensein von MPC-induzierenden Wirkstoffen im menschlichen Serum hindeutet6. Derzeit ist das MPC-Isolations-/Charakterisierungsprotokoll eine einzigartige Methode, um nahezu reine MPCs zu erhalten. Das Protokoll wurde sorgfältig angepasst und ist sehr gut reproduzierbar für das Qualitätsscreening von MPC-Präparaten vor weiteren Anwendungen.

MPCs könnten als Quelle für die MSC-Produktion verwendet werden, wodurch die Variabilität begrenzt wird, die durch die Verwendung von unfraktioniertem Ausgangsmaterial entsteht. Die genaue Definition der mehreren Schritte, die die mesengene MPC-Differenzierungcharakterisieren , würde eine synchronisierte mesenchymale Zellexpansion ermöglichen. Nichtsdestotrotz konnte diese neueste Bedingung ausschließlich mit hochreiner MPC-Population realisiert werden, so dass die Charakterisierung der Zellprodukte, die mit dem hier beschriebenen Protokoll gewonnen wurden, von entscheidender Bedeutung ist. Es wurde berichtet, dass diese Isolierungsmethode eine MPC-Rückgewinnung mit einer Reinheit von im Allgemeinen um 95 % ermöglicht. Die Variabilität von Spendern und Patienten könnte jedoch zusammen mit der Variabilität in Bezug auf die verschiedenen Chargen des angewendeten humanen gepoolten Serums dazu führen, dass ein signifikanter Prozentsatz von MSC-ähnlichen Zellen zusammen mit MPCs unter selektiven Bedingungen isoliert wird.

Es ist nicht klar, ob diese "kontaminierenden" MSC-ähnlichen Zellen aus den anderen verschiedenen in vivo Vorläuferzellen, die im Knochenmark beschrieben wurden, stammen könnten22 oder aus unkontrollierter und spontaner MPC-Differenzierung. In jedem Fall macht ein gleichbleibender Anteil von MSC-ähnlichen Zellen in den MPC-Produkten die Möglichkeit zunichte, diese Zellen als homogenes Ausgangsmaterial für die MSC-Expansion einzusetzen. Daher wurde hier eine einfache und kostengünstige Methode vorgeschlagen, die auf der MPC-Resistenz gegen Trypsinaufschluss basiert und die Reinheit der MPC-Produkte erhöht. Ähnliche oder sogar bessere Ergebnisse bei der Aufreinigung von MPC-Kulturen könnten durch fluoreszierende oder magnetische Zellsortierung erzielt werden, die eine CD73- und/oder CD90-Depletion durchführt, aber die Prozesszeit erheblich verlängert und die Kosten erhöht.

Darüber hinaus zeigten MPCs die Expression von Pluripotenz-assoziierten Markern und Nestin, die alle während der mesengenen Differenzierung schnell verloren gingen7. Der Keimungsassay zeigte die Fähigkeit von MPC, in das murine ECM-Proteingel einzudringen. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass MPCs als unreiferer Vorläufer angesehen werden müssen, der sein angiogenes Potenzial beibehält. Nichtsdestotrotz lässt die anfängliche Begeisterung über das mesodermale Differenzierungspotenzial von MPCs tatsächlich nach. Tatsächlich wurde nach mehr als 7 Jahren Studien an MPCs das mesengene und angiogene Potenzial ausführlich beschrieben5-9, aber die Differenzierung zu anderen Zellen mesodermalen Ursprungs fehlt immer noch. Daher schlagen wir hier eine neue und strengere Definition dieser Zellen als "mesangiogene Vorläuferzellen" vor, wobei das Akronym MPCs beibehalten wird.

Wir glauben auch, dass die meisten Kontroversen über das angiogene Potenzial von MSC mit der heterogenen Zusammensetzung erweiterter Kulturen zusammenhängen könnten, die aus Subpopulationen von MPCs und MSCs in variablen Prozentsätzen bestehen23.

Schließlich könnten MPCs auch eine entscheidende Rolle bei der Implementierung von CBMPs spielen, die für die Geweberekonstruktion anwendbar sind, da diese Zellen auch die Neovaskularisation unterstützen könnten. Zukünftige Studien zur Regeneration sollten vielmehr berücksichtigen, dass das neu gebildete Gewebewachstum durch eine gleichzeitige Neo-Angiogenese unterstützt werden sollte. Die Koexistenz von mesengenem und angiogenem Potenzial in MPCs könnte das Regenerationspotenzial neuer Therapieansätze, die diese interessanten Zellen einbeziehen, erheblich verbessern.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Danksagungen

Die Autoren möchten sich besonders Dr. Paolo Parchi, Abteilung für Chirurgische, medizinische und molekulare Pathologie und Critical Care Medicine, Universität von Pisa, für die Bereitstellung von Knochenmarkproben und sein Know-how in der menschlichen Osteo-Vorläufern zu danken

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Matrigel BasalmembranmatrixBD Bioscience (San Jose, CA-USA)354230murine ECM-Proteine
Stammkonzentration: 100% (9 - 12 mg/ml)
Endkonzentration: 100
Dulbecco's Phosphat-Buffered Kochsalzlösung (D-PBS)Sigma (St. Louis, MO, USA)D8537
70 μ m FiltersMiltenyi Biotec (BergischGladbach, Deutschland)130-095-823
Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare (Uppsala, Schweden)17-5442-03Medium für diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation
Gepooltes humanes Serum vom Typ AB (PhABS)LONZA (Walkersville, MD-USA)14-490EEndkonzentration: 10%
Glutamax-IThermoFisher (Waltham,  MA USA)35050-038stabilisiertes L-Glutamin
Stammkonzentration: 100x
Endkonzentration: 2 mM
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma (St. Louis, MO, USA)A8412Stammkonzentration: 7,5%
Endkonzentration: 0,5
NatriumazidSigma (St. Louis, MO, USA)S8032Endkonzentration: 0,02
Penicillin/Streptomycin (Pen-Streptomycin)Gibco ( Grand Island, NY, USA)15070-063Antibiotika
Stammkonzentration: 5.000 IE/ml Penicillin, 5.000 μ g/ml Streptomycin
Endkonzentration: 50 UI/ml Penicillin, 50 μ g/ml Streptomycin
T-75 Kulturflasche für SuspensionskulturenGreiner Bio-one  (Frickenhausen, Deutschland)658 190
T-75 Kulturkolben TC behandeltGreiner Bio-one  (Frickenhausen, Deutschland)658170
TrypLE SelectThermoFisher (Waltham,  MA USA)12563-011Tierfreie Proteasen zum Ablösen von Lösung
Stammkonzentration: 1x
Endkonzentration: 1x
Trypsin/EDTAThermoFisher (Waltham,  MA USA)15400-054Phenolrot frei
Stammkonzentration: 0,5%
Endkonzentration: 0,25%
anti-CD90 APC Antikörper  (CD90)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-095-402Endkonzentration: 1:40
anti-CD45 APC-Vio770 Antikörper (CD45)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-096-609Endkonzentration: 1:40
anti-CD73 PE Antikörper (CD73)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-095-182Endkonzentration: 1:40
anti-CD31 PE Vio-770 Antikörper (CD31)MiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-105-260Endkonzentration: 1:40
Maus IgG1 APC AntikörperMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-098-846Endkonzentration: 1:40
Maus IgG2a APC Vio770 AntikörperMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-096-637Endkonzentration: 1:40
Maus IgG1 PE AntikörperMiltenyiBiotec ( BergischGladbach, Deutschland)130-098-845Endkonzentration: 1:40
Maus IgG1 PE Vio-770 AntikörperMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-098-563Endkonzentration: 1:40
Glucose Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)13-1331-82Phenolrot-freies minimales essentielles Medium
Stammkonzentration: 1.000 mg/L Glukose
Fötales Rinderserum  (FBS)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)10500Stammkonzentration:0,2 mg/ml
Endkonzentration: 2 μ g/ml
Prolong Gold Antifading-Reagenz mit 4',6-Diamidino-2-phenylindolInvitrogen (Waltham, MA,  USA)P-36931Wässriges Eindeckmedium + DAPI
Endkonzentration: 1x
ParaformaldehydSigma (St. Louis, MO, USA)P6148Fixiermittel
Endkonzentration: 4%
LAB-TEK Objektträger mit zwei Wells KammerSigma (St. Louis, MO, USA)C6682
Anti-Nestin-Antikörper [Klon 10C2]Abcam (Cambridge, UK)ab2035Stammkonzentration: 1 mg/ml
Endkonzentration: 7 μmu; g/ml
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermoFisher (Waltham,  MA USA)A34055Stammkonzentration: 200 IE/ml
Endkonzentration: 5 IE/ml
Triton X-100Euroclone (Mailand, Italien)EMR237500Endkonzentration: 0,05%
MesenPRO RS Medium  (MSC-RS mittel)ThermoFisher (Waltham,  MA USA)12746-012
Alexa Fluor 488 Anti-Maus SFX KitThermoFisher (Waltham,  MA USA)A31619Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper + Signalverstärker
Stammkonzentration: 2 mg/ml
Endkonzentration: 2 μ g/ml
Pasteur PipetteKartell Laborbedarf  (Noviglio (MI), ITALIEN )329
StielMACS AdipoDiff  MedienMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-091-679
StemMACS OsteoDiff  MedienMiltenyiBiotec (BergischGladbach, Deutschland)130-091-678
Osteoimage Knochenmineralisation AssayLONZA (Walkersville, MD-USA)PA-1503Hydroxylapatit-spezifische fluoreszierende Färbelösung
50 ml Polystyrol konisches RöhrchenGreiner bio-one (Kremsmü nster
Österreich)		227261
Nile RedThermoFisher (Waltham,  MA USA)N1142Fluoreszierende Färbelösung für Lipide
Stammkonzentration: 100 mM
Endkonzentration: 200 nm
GlycerinSigma (St. Louis, MO, USA)G2289Endkonzentration: 50%
Polistiren-PetrischalenSigma (St. Louis, MO, USA)P5606
24-Well-Platten TC-behandeltGreiner Bio-one GmbH (Frickenhausen, Deutschland)662160
Endotheliales Wachstumsmedium, EGM-2 BulletKit  (EGM-2)LONZA (Walkersville, MD-USA)CC-3162VEGF-reiches Endothelzell-Wachstumsmedium
Leica Qwin Image Analisys SoftwareLeica (Wetzlar, Deutschland)Bildanalyse-Software
%%% Low

Referenzen

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