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Methodenartikel

Menschliche Primär Trophoblast Zellkulturmodell die schützende Wirkung von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Störung zu studieren

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DOI:

10.3791/54228

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30. Juli 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1INRS-Institut Armand-Frappier

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript präsentiert ein einzigartiges in vitro Modell von immungereinigten humanen villösen Zytotrophoblastzellen, die unter Hypoxie/Reoxygenierung kultiviert wurden. Dieses Modell ist geeignet, um die schützende Wirkung vielversprechender Behandlungen wie Melatonin auf Schwangerschaftskomplikationen zu untersuchen, die mit erhöhtem oxidativem Stress und veränderter Plazentafunktion verbunden sind.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie zottenartige Zytotrophoblastzellen durch aufeinanderfolgende enzymatische Verdauung aus Plazenta isoliert werden, gefolgt von Dichtezentrifugation, Mediengradientenisolierung und immunomagnetischer Reinigung. Wie in vivo beobachtet, differenzieren sich mononukleierte vilöse Zytotrophoblastzellen in Primärkulturen nach 72 Stunden zu mehrkernigen Synzytiotrophoblastenzellen. Im Vergleich zur Normoxie (8 % O2) leiden vilöse Zytotrophoblastenzellen, die sich einer Hypoxie/Reoxygenierung (0,5 % / 8 % O2) unterziehen, einem erhöhten oxidativen Stress und einer intrinsischen Apoptose, ähnlich der, die in vivo bei Schwangerschaftskomplikationen wie Präeklampsie, Frühgeburt und intrauteriner Wachstumseinschränkung beobachtet wird. In diesem Zusammenhang stellen primäre zottenartige Trophoblasten, die unter Hypoxie-/Reoxygenierungsbedingungen kultiviert wurden, ein einzigartiges experimentelles System dar, um die Mechanismen und Signalwege, die in der menschlichen Plazenta verändert sind, besser zu verstehen und die Suche nach wirksamen Medikamenten zum Schutz vor bestimmten Schwangerschaftsstörungen zu erleichtern. Menschliche Zotten-Trophoblasten produzieren Melatonin und exprimieren seine synthetisierenden Enzyme und Rezeptoren. Melatonin wurde aufgrund seiner schützenden antioxidativen Wirkung zur Behandlung von Präeklampsie und intrauteriner Wachstumseinschränkung vorgeschlagen. In dem in dieser Arbeit beschriebenen primären villösen Zytotrophoblastenzellmodell hat Melatonin keine Wirkung auf Trophoblastzellen im normoxischen Zustand, stellt jedoch das Redoxgleichgewicht von Synzytiotrophoblastzellen wieder her, die durch Hypoxie/Reoxygenierung gestört sind. Daher sind humane zottöse Trophoblastzellen in Primärkultur ein hervorragender Ansatz, um die Mechanismen hinter der schützenden Wirkung von Melatonin auf die Plazentafunktion während Hypoxie/Reoxygenierung zu untersuchen.

Einleitung

Während der Schwangerschaft, die Plazenta Cytotrophoblastenzellen, die einkernigen Stammzellen sind, rasch vermehren und in entweder Villi oder extravillösen Cytotrophoblastenzellen unterscheiden. Extravillösen Cytotrophoblasten eindringen und die Spiralarterien der Uteruswand umbauen. Villöse Zytotrophoblasten, andererseits weiter zu vermehren, differenzieren und Sicherung kernige Synzytiotrophoblasten (Synzytium) 1 zu bilden. Die Aufrechterhaltung der Villi trophoblast Homöostase ist von wesentlicher Bedeutung für die fetale Wohlbefinden und gesunde Schwangerschaft. In der Tat erlauben villous Trophoblasten Mutter und Fötus Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen und produzieren wesentliche Hormone für die Schwangerschaft. Darüber hinaus ist die Synzytiotrophoblasten die einzige Zelltyp in direktem Kontakt mit dem mütterlichen Blutkreislauf und stellt eine wesentliche physikalische und immunologische Barriere. Daher ist die Synzytiotrophoblasten muss Apoptose und Ersatz für homeostatic Wartung zu unterziehen und zu Avoid Plazenta Pathologien 2-5.

Die Technik entwickelt von Kliman et al. 6 1986 primären villous Cytotrophoblasten aus menschlichen Plazenten zu isolieren , führte zu einer Revolution in der Plazenta Forschung durch die Untersuchung der molekularen Mechanismen ermöglicht in villous trophoblast Differenzierung beteiligt. Diese klassische Technik, basierend auf sequentiellen enzymatischen Aufschluss mit Trypsin und DNase, gefolgt von der Isolierung in Dichtezentrifugation Medien (kolloidalen Silicapartikel durch Polyvinylpyrrolidon beschichtet oder Percoll) wird nun als Goldstandard zur Isolierung von Villi Cytotrophoblastenzellen erkannt. Die Technik kann durch eine magnetische Immun optimiert werden, ein Verfahren, das villöse Zytotrophoblasten aus nicht-trophoblastischen Zellen basierend auf der differentiellen Expression spezifischer Antigene auf den Oberflächen dieser Zellen trennt. Wir wählten das Human-Leukozyten-Antigen-ABC (HLA-ABC) wegen des Fehlens seiner Expression auf der Zell trophoblastic membrane 7,8.

Die Plazenta ist ein Organ, das dramatische Veränderungen in der Sauerstoffspiegel während der Schwangerschaft erfährt. Im ersten Trimester ist die Sauerstoffanreicherungsverhältnis physiologisch sehr gering (2% O 2) , jedoch erhöht sich auf milde Ebenen der Oxygenierung (8% O 2) in der zweiten und dritten Trimester. Tuuli et al. 9 beschrieben , dass die In - vitro - Vermehrung des Trophoblasten Umgebung innerhalb des Plazentazotten ist eine Herausforderung und Variationen der Sauerstoffversorgung Ebenen sogar zu phänotypischen Veränderungen führen kann. Es ist daher, 8% Sauerstoff zu ergreifen vorgeschlagen als Normoxie die Sauerstoffspannung in Plazentazotten während des dritten Trimesters der Schwangerschaft 8,9 zu imitieren. Chen et al. 10 untersucht umfassend mehrere Variablen Sauerstoffspannung in Trophoblasten - Zellkultur verwandt und zeigen die Bedeutung Sauerstoff - Niveaus in einer perizellulären Umgebung zu bestimmen. Die Konzentrationen von Sauerstoff in den Zotten tendenziell zunehmenaufgrund Vaskulogenese. Der Blutfluss in Plazentazotten steigt ständig und das Niveau von Wasserstoffperoxid (eine häufig vorkommende reaktive Sauerstoffspezies) ist ein wichtiges Signal , das Vaskulogenese 11,12 steuert. In Schwangerschaftskomplikationen, erzeugt ein Mangel an Vaskulogenese Hypoxie, und noch wichtiger, intermittierende Variationen der Oxygenierung (sogenannte Hypoxie / Reoxygenierung). Diese Bedingungen führen zu einer abnormen Erhöhung des oxidativen Stress, der Plazenta und fetale Lebensfähigkeit 13,14 kompromittiert. Die Veränderungen , die Trophoblasten - Zellen in vivo während Episoden von Hypoxie / Reoxygenierung laufen kann in vitro nachgeahmt werden , wie folgt: villöse Zytotrophoblasten unter normoxischen Bedingungen (8% O 2) gehalten werden , bis sie in Synzytiotrophoblasten unterscheiden. Sie werden dann in hypoxischen Bedingungen (0,5% O 2) für 4 Stunden, gefolgt von einer weiteren 18 h Normoxie (Reoxygenierung) unterzogen. Mit dieser Hypoxie / Reoxygenierung Ansatz, Trophoblasten exhibit dereguliert Redoxzustand und erhöhte Spiegel von intrinsischen Apoptose 8, wie in bestimmten Komplikationen während der Schwangerschaft beobachtet. Daher ist dies ein in vitro - Modell nützliche neue präventive und therapeutische Ansätze zu bewerten Schwangerschaftskomplikationen mit plazentalem Hypoxie / Reoxygenierung verbunden zu bekämpfen.

Plazentalen Zellen produzieren Melatonin, das mehrere wichtige Funktionen, wie beispielsweise eine Fähigkeit , 15 oxidativem Stress und Plazentadysfunktion zu vermeiden. Hier präsentieren wir die experimentellen Ansatz und Zellmodelle verwendet , um die schützende Wirkung von Melatonin in der Plazenta Trophoblastzellen auf molekularer, zellulärer und funktionaler Ebene 8 zu demonstrieren.

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Protokoll

Plazenten wurden am CHUM-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Kanada, mit informierte Zustimmung des Patienten und Genehmigung der Ethikkommissionen (CHUM-St-Luc Hospital und INRS-Institut Armand-Frappier unmittelbar nach dem spontanen vaginalen Entbindungen von einer unkomplizierten Schwangerschaften erhalten, Laval, QC, Kanada).

1. Isolierung und Reinigung von Villöse Zytotrophoblastzellen

  1. Lösungen und Medien
    1. Bereiten Sie Transportmedien durch Ergänzung Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium Hoch Glucose (DMEM-HG) mit 1% vol / vol Antibiotikum (10.000 Einheiten / ml Penicillin G, 100 mg / ml Streptomycinsulfat) und lagern bei 4 ° C.
    2. Bereiten primären Kulturmedien durch DMEM-HG mit 10% vol / vol fötalem Rinderserum (FBS), 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) Fügung von 1% vol / vol Antibiotikum (10.000 Einheiten / ml Penicillin G, 100 mg / ml Streptomycinsulfat) und lagern bei 4 ° C. Warme Medium auf 37 ° C bevorbenutzen.
    3. Herstellung von 4 l Salzlösung (0,9% Gewicht / Volumen Natriumchlorid).
    4. Prepare Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) durch Zugabe von 25 mM HEPES modifizierte HBSS auf 1x (pH 7,4).
    5. Bereiten frisch, vier Flaschen Verdauungslösung mit modifiziertem HBSS (hergestellt in 1.1.4), Magnesiumsulfat (MgSO 4), Calciumchlorid (CaCl 2), Trypsin, Deoxyribonuclease IV (DNase IV) und 1% vol / vol Antibiotikum ( 10.000 Einheiten / ml Penicillin G, 100 mg / ml Streptomycinsulfat) , wie in Tabelle 1 gezeigt.
    6. Bereiten Dichte Zentrifugationsmedien Gradienten
      1. Bereiten Sie Dichtezentrifugation Medienlösung durch Dichtezentrifugation Medien mit 10% vol / vol HBSS 10x Ergänzung.
      2. Vorbereitung 14 Teströhrchen mit Dichtezentrifugation Medienlösung und modifizierte HBSS, wie in Tabelle 2 beschrieben.
      3. Mischen Sie jede Dichte-Lösung (Schritt 1.1.6.2) kräftig, bevor sein Inhalt auf den Gradienten hinzufügen. Sanftfügen die Dichte Lösungen auf eine 50 ml Glaszentrifugenröhrchen mit einer peristaltischen Pumpe (1 ml / min), mit der höchsten Konzentration (70%) beginnt. Vermeiden Tröpfchen durch die Lösungen gegen die Rohrwand Entwässern der richtigen Trennung jeder Schicht des Gradienten aufrechtzuerhalten.
        1. In Abwesenheit einer Schlauchpumpe, gelten die Schichten sehr vorsichtig mit Pasteur-Pipetten.
    7. Bereiten letzte Laufpuffer durch den Laufpuffer ergänzt (siehe Tabelle der Materialien) mit 2% vol / vol Antibiotika / Antimykotika (10.000 Einheiten / ml Penicillin G, 100 mg / ml Streptomycinsulfat). Lagerung bei 4 ° C.
  2. Villöse Cytotrophoblast Isolation
    Hinweis: Verwenden Sie sterile chirurgische Geräte, Gläser, Pipetten, Kolben, usw.
    1. Am Tag der Villi Cytotrophoblast Isolation, in einem 37 ° C Wasserbad °, erwärmen Sie die Aufschlüsse Lösungen (aus Schritt 1.1.5) und 70 ml FBS. Hinweis: Verwenden Sie 50 ml FBS die Aufschlüsse zu unterbrechen und dierestlichen 20 ml für den Gefrierschritt (1.2.22), die auf Eis gestellt werden können einmal aufgetaut.
    2. Nach der Auslieferung bringen die Plazenta an das Labor in eiskaltem Transportmedium (aus Schritt 1.1.1) so schnell wie möglich (weniger als 1 h).
    3. Discard Transportmedium und Plazentablut in flüssiger Mülltonne. Wiegen Sie die Plazenta und tauchen in kaltem Salzlösung.
    4. Messen und analysieren die folgenden Funktionen: Nabelschnur Länge; Nabelschnur Lokalisierung; Plazenta-Länge, Breite, Form (oval, discoid); Membran Farbe; cotyledon Struktur Pathologien. Hinweis: Die Daten werden im Ergebnisteil dargestellt.
    5. Schneiden Sie die Nabelschnur neben seiner Plazenta - Insertion (dh an seiner Basis mit einem zusätzlichen 1 cm Radius Kreis um das Kabel). Eintauchen in 300 ml histologischen Gewebefixierungslösung (Formalin 10%) für eine spätere histologische Analyse.
    6. Schneiden Sie die gesamte Plazenta in Würfel von 5 x 5 x 5 cm. Gründlich waschen (4-mal x ~ 1 min) in Salz Solution (0,9%) Blutzellen, bis Salzlösung ist klar, zu entfernen. Entsorgen Spülflüssigkeit.
    7. In einem Uhrglas, entfernen Plazentamembranen und zerkleinern Gewebe Blutgefäße und Verkalkungen zu entfernen. Halten Sie die Blutgefäße fest mit einer Zange und entfernen Gewebe den Rücken Metzenbaum Schere.
      1. Legen Sie gehackten Plazenta in einem Büchner-Trichter. Spülen Sie mit etwa 100 ml Salzpuffer. Weiter zerkleinern, bis 30 - 35 g zerkleinerte Gewebe erhalten wird (Verwendung Kunststoff Wiegeschiffchen und Skala). Falls erforderlich, Hackfleisch, den Rest der Plazenta zu drei zusätzliche 30 zu erhalten, bis - 35 g Zubereitungen. Während dieser Zeit setzen zerkleinerte Gewebe in einem Wägeschiffchen auf Eis.
        Hinweis: Dieser Schritt etwa 45 Minuten bis 1 Stunde dauern.
    8. In den 30 - 35 g gehackten Plazentagewebe zu einem Trypsinisierung Kolben. Transfer 150 ml der vorbereiteten Aufschlußlösung 1 (Tabelle 1) mit dem Kolben trypsinisiert und gut mischen.
    9. Setzen Sie den Trypsinisierung Kolben inWasserbad für 30 Minuten bei einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 50 Zyklen / min ein Schütteln und manuell die Trypsinisierung Kolben für homogene Verdauung alle 5 min mischen.
    10. Am Ende der ersten Verdauung, entfernen Sie die Trypsinisierung Kolben aus dem Wasserbad und kippen (45 °) für 1 min das Plazentagewebe zu sedimentieren. Mit einer 10 ml sterilen Pipette entfernen und ca. 80 ml Überstand verwerfen. Vermeiden Sie das Gewebe abgesaugt.
    11. Transfer 100 ml Aufschlußlösung 2 (Tabelle 1) mit dem Kolben Trypsinisierung; gut mischen und wiederholen Sie Schritt 1.2.9.
    12. Am Ende des zweiten Verdauung, entfernen Sie die Trypsinisierung Kolben aus dem Wasserbad und kippen es 45 ° für 1 min. Mit einem 10 ml sterilen Pipette entfernen 80 ml Überstand und Transfer sanft in ein Zentrifugenröhrchen mit einem Zellsieb (100 & mgr; m mesh). Übertragen des filtrierten Überstand in ein Becherglas mit 2 ml FBS Voll jedesmal, wenn das Zentrifugenrohr ist.
    13. Führen Sie die dritte Verdauung wie für die beschriebenezweite Verdauung (1.2.11 und 1.2.12) unter Verwendung von 75 ml Aufschlusslösung 3. Parallel dazu führen Sie die Schritte 1.2.15 bis 1.2.16.1 für die Verdauung 2.
    14. Führen Sie die vierte Verdauung genau wie die dritte Verdau der Aufschlußlösung 4 (75 ml) verwendet, aber eine maximale Menge an Überstand zu sammeln. Führen Sie die Schritte 1.2.15 bis 1.2.16.1 parallel zur Verdauung 3 und schließlich für die Verdauung 4.
    15. Aliquot der Überstand (von Verdauungen 2, 3 und 4) in 13,5 ml Teile, jedes Teil in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Mit einem 22,8 cm langen Glaspasteurpipette, sehr sanft und langsam ab 1,5 ml FBS am unteren Ende jeder Röhre, um eine separate Schicht zu schaffen. Nicht FBS und Überstand mischen. Zentrifugieren Sie die Rohre ohne Bremse für 20 min bei 1250 × g bei Raumtemperatur.
      Anmerkung: Nach der Zentrifugation 4 Schichten in dem Rohr sichtbar sind, wie in Figur 1 gezeigt , um die Trennung von Trypsin und Trophoblastzellen exzessive zelluläre Verdauung vermeidet..
    16. Mit einer Vakuumpumpe, aspiraß und der Überstand (Verdauungslösung) und FBS Schichten, einschließlich der weißliche Film zwischen den beiden Schichten zu verwerfen. Resuspendieren des Pellets (die Trophoblasten und roten Blutzellschichten) mit 1 ml warmem Zellkulturmedium (Schritt 1.1.2; ohne FBS und kein HEPES).
      1. Sammeln Sie resuspendierten Zellen aus allen Rohren und kombinieren sie in 1 Tube. Lassen Sie das Rohr bis zum Ende aller Aufschlüsse bei Raumtemperatur stehen. Hinweis: Nachdem alle Aufschlüsse, die übliche Ausbeute beträgt 3 Röhrchen von resuspendierten Zellen (einer pro Verdauung).
    17. Machen Sie das Volumen auf 15 ml mit warmem Zellkulturmedium nach oben. Zentrifuge bei 1.250 xg für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuumpumpe. Vermeiden Sie das Pellet abgesaugt.
    18. resuspendieren vorsichtig das Pellet aus den drei Röhrchen mit 1 ml warmem Zellkulturmedium erhalten. Pool ihren Inhalt in 1 Tube. Zur Erzielung 8 ml, füllen Sie das Volumen mit warmem Zellkulturmedium.
    19. Sehr sanft die Zellsuspension auf eine Trennung grad Schichtfänger mit einer Pasteur-Pipette. Zentrifuge ohne Bremsen für 30 min bei 507 xg bei Raumtemperatur.
    20. Nach dem Zentrifugieren die verschiedenen Schichten von Zellen in der Steigung mit Hintergrundbeleuchtung zu identifizieren. Suchen Sie die Schichten, die Trophoblasten und verunreinigende Zellen zwischen 40 - 50% der Dichtezentrifugation Medium. Mit einer Vakuumpumpe, entfernen Sie den oberen Schichten (> 50%).
    21. Sammeln Sie in den Schichten von Interesse mit einer Pasteur-Pipette befindlichen Zellen und sie auf einen 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Machen Sie das Volumen auf 50 ml mit Zellkulturmedium nach oben. Zentrifuge für 10 min bei 1250 xg bei Raumtemperatur.
    22. Unter sterilen Bedingungen, der Überstand verworfen, das Pellet mit 20 ml FBS resuspendieren und die Anzahl der Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers zählen. Auf dem Eis, fügen 2,22 ml sterilem Dimethylsulfoxid (DMSO) und durch Umklappen vorsichtig mischen. Aliquot 1,5 ml Zellsuspension in Kryoröhrchen, einfrieren über Nacht bei -80 ° C und in einen flüssigen Stickstofftank.
  3. Trophoblast Reinigung
    1. Installieren Sie die Spül- und Laufpuffer und eine neue Filtersäule auf dem Instrument magnetische Reinigung nach den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie die "saubere Programm" zu reinigen negativ 1 positiv 1 und positive 2-Anschlüsse, und dann stellen die 50-ml-Röhrchen unter den Ports gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Tauen Sie die Zellen, die in einem 37 ° C Wasserbad in Schritt 1.2.22 schnell eingefroren. Transfer-Zellen in ein 50 ml-Röhrchen und resuspendieren Zellen vorsichtig mit 20 ml kaltem Puffer-Lösung. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 Minuten bei 450 × g und 4 ° C.
    3. Überstand verwerfen. Wiederholen Sie den Waschschritt mit kaltem Puffer. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers Lebensfähigkeit zu bestimmen. Wiederholen der Zentrifugation (5 min, 450 × g bei 4 ° C). Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. 1 ml kaltem Puffer, der 1% vol / vol von Maus anti-HLA-ABC - Antikörpern. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min, mixing sanft alle 5 Minuten.
    4. In 6 ml kaltem Puffer. Zentrifuge für 5 Minuten bei 450 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen und wiederholen Sie diesen Schritt. Die Zellen in 1 ml kaltem Puffer , enthaltend 10% Vol / Vol Anti-Maus - Sekundär - Antikörper-gekoppelten Magnetkügelchen. bei 4 ° C inkubieren 15 min sanft alle 5 min gemischt wird.
    5. In 6 ml kaltem Puffer. Zentrifuge für 5 Minuten bei 450 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen und resuspendieren in 5 ml kaltem Puffer.
    6. Trennen Sie die Trophoblastzellen das magnetische Reinigungsinstrument. Sammeln Zellen am negativen Anschluss und fügen Sie 20 ml kaltem Puffer.
      Hinweis: Trophoblastzellen enthalten nicht die komplexe HLA-ABC und werden somit von anderen Zelltypen getrennt und in Richtung der negativen 1 Port.
    7. Zentrifuge für 5 Minuten bei 450 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen und die Zellen vorsichtig in 20 ml warmen Primärkulturmedium resuspendieren. Zählen Sie die Zellen usinga Hämozytometer Lebensfähigkeit zu bestimmen.
    8. Platte die Zellen bei den folgenden Dichten: 0,15 x 10 6 Zellen / Well in 96-Well - Platten, 1,6 x 10 6 Zellen / Well in 24-Well - Platten und 4,5 x 10 6 Zellen / Well in 6-Well - Platten. Inkubiere Platten bei 37 ° C und 5% CO 2.
    9. Bestätigen Sie die Reinheit der Trophoblastzellen mittels Durchflusszytometrie 16,17 und / oder 18 Immunzytochemie.
      Anmerkung: Die Reinheit der immungereinigten Zellen wurde bestimmt unter Verwendung von FITC-konjugierten monoklonalen Antikörper gegen Cytokeratin-7 und Vimentin 17-19. Dieses Protokoll ist gut detailliert in Lanoix et al., 2008 7.
    10. Nach mindestens 4 Stunden, spülen Sie die Zellen zweimal mit warmem Kulturmedium ungebunden Zellen zu entfernen und dann die Platten auf die Normoxie Kammer übertragen, die von 8% O 2 (siehe Abbildung 2 und Abschnitt 2) zusammengesetzt ist.

2. In - vitro - induction von Normoxie und Hypoxie / Reoxygenierung

  1. Inkubatorkammer Betrieb (2A für Set-up zu sehen).
    1. In einer Laminarströmungsabzug, legen Sie eine Petrischale mit sterilem Wasser am Boden der Inkubatorkammer Trockenheit zu vermeiden; legen Sie dann die zuvor hergestellte Zellkulturplatten oder Kolben (Schritt 1.3.10) auf den höheren Regalen der Kammer.
    2. Außerhalb der Haube, befestigen die Kammer (Einlassöffnung) mit dem Gasschlauch (2A: 5a, b und c) , um das Rohr von Gas (8% O 2 oder 0,5% O 2) zu erreichen (2A , 7). Öffnen beider Einlass- und Auslassöffnungen der Kammer. In diesem Moment wird der Gasregler (2A , 4) geschlossen bleiben sollte.
    3. Sie vorsichtig das Ventil Gasregler öffnen (Abbildung 2A: 4). Flush für 4 min mit einem Luftstrom von 25 l / min, um vollständig die Luft innerhalb der Kammer zu ersetzen.
    4. Nachdem die Kammer gespült, schließen Sie den Gasregler dann den Einlass und den outlet Häfen der Kammer.
    5. Ziehen Sie den Durchflussmesser Ablaufschlauch (2A: 5c) von der Einlassöffnung der Kammer und legen Sie die Kammer in einer Zellkultur - Inkubator bei 37 ° C.
    6. Ersetzen Sie die Luft derzeit in den Platten, Flaschen und in dem Kulturmedium gelöst, indem die Kammer Befüllung mit Gas 1 Stunde nach dem Schritt 2.1.3.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1 für die anderen Gaszusammensetzungen zu 2.1.6 (beispielsweise 2% O 2 für die ersten Trimesters Trophoblasten Kultur 9).
  2. Bestätigen Sie den Sauerstoffanteil (2B-C)
    1. Um die Konzentration von Sauerstoff in dem Zellkulturmedium bestätigen (ohne Zellen) innerhalb der Kammer, verwenden, um eine Sauerstoffelektrode an ein Sauerstoffadapter verbunden. Schließen Sie die Sauerstoffelektrode mit einem Voltmeter.
    2. Erstellen einer Eichkurve in der gleichen Lösung (dh Zellkulturmedium) durch die Lösung zu Gasen mit bekannten Sauerstoffgehalt ausgesetzt wird (beispielsweise 0% , und21% Sauerstoff). Nachdem die Messwerte für jede Konzentration stabilisiert sind, einzuführen, um die Elektrode in das Medium in der Kammer.
      Hinweis: Nehmen Sie alle Messung in der gleichen Tiefe um 10 Bias in der Sauerstoffkonzentration zu vermeiden.
  3. Die Induktion von Normoxie und Hypoxie / Reoxygenierung in Trophoblasten.
    1. primäre Trophoblastzellen zu den entsprechenden Zellkulturflaschen, Platten oder Petrischalen nach dem Hinzufügen führen Behandlungen wie nötig.
    2. Parallel im Inneren der Kammer, belichten Zellen auf die gewünschte Gasmischung eine bestimmte Bedingung zu reproduzieren alle 24 h (Figur 3).

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Ergebnisse

Isolation und Immunoreinigung von Villi Cytotrophoblastenzellen aus einer normalen Begriff Plazenta durch vaginale Entbindung erhalten ergab 1 x 10 8 lebensfähige Zellen. Die Plazenta wog 350 g, betrug 19 cm im Durchmesser, 4 cm hoch mit scheibenförmigen Form und transparent Membranen. Keine cotyledon Malformation nachgewiesen. Die Nabelschnur hatte paracentralis Lokalisation und eine Länge von 56 cm. Die Reinheit wurde mittels Flow-Cytometrie untersucht unter Verwendung von V...

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Diskussion

Bei Säugetieren ist die Entwicklung des Fötus direkt abhängig von ausreichend Plazentafunktion. Die Entwicklungs Ursprünge von Gesundheitsstörungen werden auf der Hypothese aus , dass die Ursache von Krankheiten im späteren Leben manifestieren können zu frühe Entwicklung zurückverfolgt werden und dass die Plazenta hat eine mechanistische Rolle in der fötalen Programmierung 30-32. Die Plazenta ist der Schlüsselmediator der fetalen Wachstum und Entwicklung: es Nährstofftransfer regelt, schützt vor schädlichen E...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Unterstützt durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Nr. 262011-2009) für CV und March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research Grant (#12-FY12-179) für CV und JTS; durch Stipendien an LSF vom Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) und der Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, an HC vom Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, an AAHT von den Canadian Institutes of Health Research (CIHR) und FRQ-Santé sowie an JBP von NSERC; im Rahmen eines EMAS-Stipendiums des Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) und des Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gebogene Metzenbaum SchereShandon9212chirurgisches Gerät (Zellisolierung) (2 Einheiten)
Splitterzange Fein 41/2 inFisherbrand13-812-42chirurgisches Gerät (Zellisolierung) (2 Einheiten)
Schere 4,5 Str DissektionFisherbrand08-940chirurgisches Gerät (Zellisolierung) (2 Einheiten)
Mullschwamm 10 cm x 10 cmCardinal Health
Längliche Auflaufform aus GlasPyrex1105397Gläser (2,8 L)
Trichter BuchnerCoorstek Inc10-356EGlaswaren (114 mm Durchmesser)
Uhrenglas pyrex9985100EMDGlaswaren
Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lhistologische Gewebefixierlösung
Trypsinisierkolben Wheaton355395Glaswaren (1 Stück)
Einweg-KulturröhrchenKimble73750-13100Glaswaren
Borosilikatglas Pasteurpipette (22,8 cm)FisherbrandK63B1367820CGlaswaren
250 ml GlasbecherFisherbrandKFS14005250Glaswaren
Glasflaschen mit VerschlussFisherbrandKFS14395250Glaswaren (8 Einheiten)
50 ml Corex Tube Corning8422-A(1 Einheit)15
ml Polystyrol-ZentrifugenröhrchenCorning430791
50 ml Polystyrol-ZentrifugenröhrchenCorning430829
10 ml Serologische PipetteCorning11415038
Zellsieb 100 μ m NylonCorning431752
Absorbant LinerScienceware1199918
500  ml Flaschen Oberer FilterCorningPore: 0,22  &Mikro; m / Medium und HBSS-Vorbereitung
2 ml Criogenic VialsCorning430488
Gefrierbehälter, Nalgene Mr.Frosty Sigma-AldrichC1562-1EA
Peristaltische PumpePharmacia Fine ChemicalsP3 Modell
SchüttelwasserbadFisherModell 127
VakuumpumpeABM4EKFS6CX-4
NatriumchloridFisherbrandEC231-598-3Kochsalzlösung 0,9%
Hank' s Gepufferte Salzlösung (Hbss)Sigma-AldrichH2387Menge: 9,25 (ein Fläschchen) für 1 L Aufschlusslösung
Hydroxypiperazinethansulfonsäure (Hepes)Life Technologies15630-08025 ml (1 M) für 1 l Aufschlusslösung
Trypsin Typ ISigma-AldrichT80039.888 U
Desoxyribonuklease Typ IVRoche10-104-159-001402.000 U
CalciumchloridSigma-AldrichC4901100 mM
MagnesiumsulfatBaker2500-01800 mM
Dulbecco' s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)Life Technologies10564-045
Penicillin/Streptomycin-Sulfat-HycloneSV30010
fötales RinderserumCorning35-010-CV
PercollSigma-AldrichP1644Dichte-Zentrifugationsmediengradient. Volumen: 36 ml
IsopropanolAcros42383-001050 ml
DimethylsulfoxidSigma-Aldrich472301
Automacs Magnetabscheider Miltenyi BiotecModell 003
Automacs  Spalten Miltenyi Biotec130-021-101
Automacs Laufpuffer Miltenyi Biotec130-091-221http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Automacs Spüllösung Miltenyi Biotec130-091-222http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
Anti-Human-Hla Abc Purified Clone W6/32Affymetrix eBioscience14-9983-82Anti-Maus-Antikörper
Anti-Maus-Igg-MikrokügelchenMiltenyi Biotec130048401
Multi-Well-Platte -  6 Well mit DeckelCorning3335Cell Bind surface
Multiple Well Plate -  24 Well mit DeckelCorning3337Cell Bind surface
Multiple Well Plate -  96 Well mit DeckelCorning3300Cell Bind Oberfläche
Modular Incubator Chamber Billups-RothenbergMIC-101Ein Zweierset ist erforderlich für die gleichzeitige Erzeugung von Normoxie- und Hypoxie-/Reoxygenierungsbedingungen
SingleFlow Meter Billups-RothenbergSFM3001
50 mm Inline-FilterWhatman6721-5010PTFE, Poren: 1,0 & Mikro; m
GasreglerPro StarPRS301233Ein Zweierset ist erforderlich, um gleichzeitig Normoxie- und Hypoxie-/Reoxygenierungsbedingungen zu erzeugen
Gasschlauch Klasse Vi Klar 5/16 Parker100-050701023 Stück mit ~ 0,5 m
17 mm verstellbare GasschlauchschelleTiewrapsTHCSS-16
Normoxia Gasflasche  PraxairNI CDOXR1U-KGröße K (3rd Zusammensetzung des Trimesters: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2)
Normoxia-Gasflasche PraxairNI CDOXR1U-KGröße K (3rd Zusammensetzung des Trimesters: 5 % CO2, 0,5 % O2, Bal. N2)
Sauerstoff-Mikroelektrode Mi-730Mikroelektroden INC84477
Sauerstoff-Adapter-MikroelektrodenINC3572
ROS-Detektionsreagenz: CM-H2DCFDA InvitrogenC-400
β-hCG ELISA-Kit DRG internationalEIA-4115
Anti-Vimentin gereinigter AntikörpereBioscience14-9897Wirt:
Maus Anti-Cytokeratin 7 (FITC) Antikörper Abcamab119697Host: Maus
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Mousse IgG H& L AntikörperLife TechnologiesA-11029
361020733

Referenzen

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