Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Extraktion und Fraktionierung von Transkripten aus pflanzlichem Gewebe auf der Grundlage der Anzahl der gebundenen Ribosomen. Es ermöglicht eine globale Abschätzung der Translationsaktivität und die Bestimmung des Translationsstatus spezifischer mRNAs.

Abstract

Die Übersetzung von mRNA in Protein ist ein grundlegender und stark regulierter biologischer Prozess. Das Polysomen-Profiling gilt als Goldstandard für die Analyse der translationalen Regulation. Die hier beschriebene Methode ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Fraktionierung von Polysomen aus verschiedenen Pflanzengeweben. Ein Saccharose-Gradient wird ohne die Notwendigkeit eines Gradientenherstellers hergestellt, indem jede Schicht nacheinander eingefroren wird. Zytosolische Extrakte werden dann in einem Puffer hergestellt, der Cycloheximid und Chloramphenicol enthält, um die zytosolischen und chloroplastischen Ribosomen an mRNA zu immobilisieren, und werden auf den Saccharosegradienten geladen. Nach der Zentrifugation werden sechs Fraktionen direkt von unten nach oben im Gradienten gesammelt, ohne das Ultrazentrifugationsröhrchen zu durchstechen. Während der Entnahme wird die Absorption bei 260 nm kontinuierlich gelesen, um ein Polysomenprofil zu erzeugen, das eine Momentaufnahme der globalen Translationsaktivität liefert. Die Fraktionen werden dann gepoolt, um drei verschiedene mRNA-Populationen herzustellen: die Polysomen, mRNAs, die an mehrere Ribosomen gebunden sind; die Monosomen, mRNAs, die an ein Ribosom gebunden sind; und mRNAs, die nicht an Ribosomen gebunden sind. Anschließend werden mRNAs extrahiert. Dieses Protokoll wurde für verschiedene Pflanzen und Gewebe validiert, darunter Arabidopsis thaliana-Sämlinge und adulte Pflanzen, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum und Oryza sativa-Blätter.

Introduction

Die Proteinsynthese ist ein wesentlicher und energetisch kostspieliger Prozess in allen ¹ - Zellen. Zuallererst Zellen müssen Energie in der Herstellung der Translationsmaschinerie, die Ribosomen investieren. Zum Beispiel erzeugt eine teilungsaktiven Hefezelle so viel wie 2000 Ribosomen pro Minute. Eine solche Produktion erfordert bis 60% der Gesamttranskriptionsaktivität und bis zu 90% der Gesamt Spleißen Aktivität der Zelle ^2. Zusätzlich wird Energie für die Synthese von Aminosäuren, Aminoacyl-tRNA und Peptidbindungen erforderlich. In Pflanzen, das Hinzufügen einer Aminosäure einer Peptidkette Kosten 4,5-5,9 Moleküle ATP ^3. Daher is....

Protocol

1. Herstellung von 20 bis 50% (w / v) Saccharosegradienten

Anmerkung: Die Gradienten sind aus 4 Schichten von Saccharose (50%, 35% und 2 Schichten aus 20%) in 13,2 ml Ultrazentrifugenröhrchen. Unserer Erfahrung nach in zwei getrennten Schichten, die die 20% Saccharose Gießen verbessert die Qualität der Polysoms Zubereitungen.

1. Bereiten Sie die Stammlösungen. Stellen Sie sicher, dass alle Lösungen RNAse und DNAse frei.
   1. Bereiten 10X Salzlösung: 400 mM Tris-HCl pH 8,4, 200 mM KCl und 100 mM MgCl _2.
   2. Bereiten Sie 2 M Saccharose-Lösung: Für 200 ml, lösen sich 137 g Saccharose in 1X Salzlösung.
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Results

In der Literatur sind Polysomen Profile oft aus der leichten Fraktion in die Schwerfraktion als Ergebnis der Art und Weise gezeigt sind, die Gradienten gesammelt, also von oben nach unten. Da in dem beschriebenen Protokoll hier die Gradienten von unten nach oben gesammelt werden, mit der schweren Fraktion (die Polysomen) und gehen die Profile zeigen wir auf die leichte Fraktion (freie Ribosomen - Untereinheiten und RNAs) (2A) beginnen. Wir sammeln dann jeden Gradienten i.......

Discussion

Das Protokoll, das wir hier vorstellen, ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Generierung von Polysomenprofilen und zur Isolierung von mRNAs, die mit Polysomen, einzelnen Ribosomen oder frei von Ribosomen assoziiert sind. In der Literatur wird eine breite Palette unterschiedlicher Polysomenfraktionierungsmethoden beschrieben. Die hier beschriebene Methode wurde so optimiert, dass nur die notwendigen Verbindungen erhalten bleiben, und wurde für pflanzliches Material angepasst. Insbesondere reduzierten wir die M.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultrazentrifugenröhrchen, dünnwandig, Polyallomer - 13,2 ml	Beckman Coulter	331372
Ultrazentrifugenröhrchen, dünnwandig, Polyallomer - 38,5 ml	Beckman Coulter	326823
Glaskapillarröhrchen	Drummond Scientific	1-000-1000
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	Optima Serie
Ultrazentrifuge Rotor SW41	Beckman Coulter	331362
Ultrazentrifuge Rotor SW32	Beckman Coulter	369650
Schlauchpumpe	Any
Tygon R3607 Polyvinylchlorid Schlauch	Fisher Scientific	070534-22	Schlauch aus Polyvinylchlorid, 2,29 mm;
Fraktionssammler Modell 2110	Bio-Rad	731-8120
UV-Küvette	Hellma	170.700-QS	Quarz-Durchflussküvette
UV-Spektralphotometer	Varian	Cary50	Alle 0.0125 sec Alle
Chemikalien	Alle		Nur für Molekularbiologie
Murashige und Skoog Basalsalzmischung (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
Rnasefreies Wasser	Jegliche
Petrischalen	Fisher Scientific	10083251
Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol, verzweigt (Nonidet P40)	Euromedex	UN3500
Lineares Acrylamid (Acrylträger)	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA-Fällungsträger
OriginPro 8	OriginLab		Analysesoftware