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Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

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DOI:

10.3791/54244

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30. Juni 2016

 , 
1Experimental Atherosclerosis Section, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Zu Beginn der Experimente werden frische oder gefrorene Monozyten 1 Woche lang in Kolben mit M-CSF kultiviert, um ihre Differenzierung zu Makrophagen zu induzieren. Dann können die Makrophagen geerntet und in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden. Die Verwendung einer definierten Anzahl von Makrophagen anstelle einer definierten Anzahl von Monozyten zur Initiierung von Makrophagenkulturen für Experimente führt zu Makrophagenkulturen, in denen die gewünschte Zelldichte konsistenter erreicht werden kann. Die Verwendung von kryokonservierten Monozyten reduziert die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von Spendern und führt zu homogeneren Makrophagenkulturen.

Einleitung

Die Untersuchung von kultivierten Makrophagen ist ein nützliches Modell, um die Funktion dieser Zellen bei Entzündungen zu verstehen, wie sie in atherosklerotischen Plaques auftreten. Wenn der Forschungsschwerpunkt auf menschlichen Krankheiten liegt, an denen Makrophagen beteiligt sind, ist es sinnvoll, primäre menschliche Makrophagen anstelle von nicht-menschlichen Makrophagen zu untersuchen, um Speziesunterschiede zu vermeiden. Außerdem können die Auswirkungen der Zelltransformation vermieden werden, indem primäre Makrophagen anstelle von Makrophagen-Zelllinien verwendet werden. Zu diesem Zweck dienen Makrophagen, differenziert von Monozyten, die aus menschlichem Blut isoliert wurden, als Mittel zur Gewinnung primärer humaner Makrophagen.

Gewebemakrophagen können entweder in Geweben ansässig sein oder von Monozyten abgeleitet sein, die in das Gewebe wandern und sich zu Makrophagen differenzieren 1. Es wurden zwei Typen von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen definiert, die sich nicht nur in der Morphologie, sondern auch in der Genexpression und der Zellfunktion unterscheiden 2. Diese beiden Typen werden aus Monozyten gewonnen, die in Gegenwart von M-CSF + fötalem Rinderserum (FBS) in Makrophagen differenziert werden, und Monozyten, die in Gegenwart von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) + FBS 2-6 zu Makrophagen differenziert werden. Nach unserer Erfahrung (unveröffentlichte Beobachtung) erzeugt die Verwendung von Humanserum anstelle von FBS den GM-CSF-Typ, unabhängig davon, ob M-CSF oder GM-CSF im Differenzierungsmedium enthalten ist. Makrophagen vom M-CSF-Typ neigen dazu, länglicher zu sein als Makrophagen vom GM-CSF-Typ, die in ihrer Morphologie Spiegeleiern ähneln. Die Forscher sollten sich darüber im Klaren sein, dass humane M-CSF- und GM-CSF-Monozyten-abgeleitete Makrophagen nicht mit sogenannten M1- und M2-Maus-Knochenmark-Makrophagen identisch sind 6.

Während der Forschung mit humanen Monozyten-abgeleiteten M-CSF-differenzierten Makrophagen hatten wir Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der Verfügbarkeit von Monozyten, um Experimente zu initiieren, und Variation in den erhaltenen Zelldichten von Makrophagen während der Differenzierung von Monozyten in Makrophagen. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir das folgende Protokoll entwickelt, bei dem Monozyten eingefroren werden, bis sie für die Verwendung benötigt werden, und Monozyten in großen Mengen in Makrophagen differenziert werden, die dann aus Kulturflaschen entnommen und mit der gewünschten Zelldichte plattiert werden können, um von Experiment zu Experiment einheitlichere Kulturen zu erhalten.

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Protokoll

Leukapherese wurde unter einem menschlichen Subjekt Forschungsprotokoll, das von einem National Institutes of Health Institutional Review Board genehmigt durchgeführt.

1. Isolierung und Kryokonservierung von Monozyten

  1. Erhalten einkernigen Zellen durch Leukapherese von menschlichen Spendern und bereichern Monozyten durch kontinuierliche Gegenstrom - Zentrifugation Auswaschung von einkernigen Zellen als 7,8 in den Referenzen beschrieben. Erhalten ca. 100 x 10 6 aufgeschlämmt Zellen (etwa 80 bis 90% Monozyten) in Elutriation Puffer vom Hersteller angegeben. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
  2. Zentrifuge Monozyten in einem 15 ml Polypropylen-Röhrchen bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie den Überstand und die Zellen vorsichtig in FBS resuspendieren von Dimethylsulfoxid , gefolgt in einer Endkonzentration von 90% FBS / 10% Dimethylsulfoxid zu erreichen , und 50 x 10 6 Zellen / ml.
  4. In jeder ml der Zellsuspension to eine individuelle Cryovial.
  5. Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einer Zelle Gefrierbehälter und in einen -80 ° C Gefrierschrank für 24 h vor Kryoröhrchen Vorratsbehälter für die Langzeitlagerung zu einem flüssigen Stickstoff übertragen.

2. Differenzierung von Monozyten in Makrophagen

  1. Auftauen ein Kryoröhrchen von Zellen durch zu einem 37 ° C Wasserbad schnell übertragen und dann sofort zu entfernen, wenn die Zellsuspension etwa 70% aufgetaut ist.
  2. Unmittelbar nach dem vollständigen Auftauen bei Raumtemperatur, übertragen Sie die 1 ml Kryoröhrchen Inhalt in 50 ml 37 ° C erwärmt Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 2 mM L-Glutamin, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml Interleukin-10 (IL-10) und 10% FBS (komplettes Medium).
  3. Transfer 25 ml Monozyten - Suspension in jeweils zwei 75 cm 2 Plastikzellkulturflaschen.
  4. Inkubieren Kulturen in einem 37 ° C Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2/95% Luft für 48 Stunden.
  5. Spülen Sie die cultures 3 mal mit 10 ml RPMI 1640-Medium (vorgewärmt auf 37 ° C), sanft das Kulturmedium Entfernen jeglicher lose anhaftenden Zellen zu vermeiden Verdrängen.
  6. Nach dem Spülen, fügen Sie frisches komplettes Medium, Mediumwechsel alle 2 Tage bis Monozyten differenzieren und ausreichend zu konfluieren vermehren. Dies erfordert etwa eine Woche der Kultur.

3. Ernte Makrophagen Experimente zu initiieren

  1. Spülen differenzierten Makrophagen in Kolben 3 mal mit 10 ml vorgewärmten 37 ° C Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ohne Ca 2+ und Mg 2+ , bevor die Zugabe von 10 ml vorgewärmten 37 ° C 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung.
  2. Danach wird der Kolben in der Zellkultur-Inkubator 10 - 15 min zu diesem Zeitpunkt etwa 90% der Makrophagen abzurunden und abgelöst. Überprüfen dies durch mikroskopische Untersuchung des Kolbens.
  3. 10 ml RMPI 1640-Medium mit 10% FBS zu sTop Trypsinierung.
  4. Übertragen Sie die Makrophagen-Zellsuspension aus dem Kolben in ein 50 ml Polypropylenröhrchen, Zentrifuge 300 xg für 5 min, und den Überstand verwerfen.
  5. resuspendieren Sie vorsichtig die Makrophagen in 1 ml Vollmedium.
  6. Mischen 10 ul Makrophagenzellsuspension mit 10 ul Trypanblau-Lösung und bestimmen Makrophagenzellzahl und Lebensfähigkeit (typischerweise> 95%) unter Verwendung eines Hämozytometers.
  7. Auf der Grundlage der Zellzahl ( in der Regel etwa 15 - 18 x 10 5 Makrophagen), fügen Sie zusätzliche Komplettmedium die gewünschte Seedingzelldichte zu erreichen. Anmerkung: 1 x 10 5 Makrophagen in 1,5 ml Medium pro Well einer 12-Well - Platte wird eine nahezu konfluenten Kultur herzustellen.
  8. Folgende Aussäen über Nacht inkubieren Makrophagen in einem 37 ° C Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2/95% Luft Zellanheftung zu ermöglichen. Dann beginnen die gewünschten Experimente.

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Ergebnisse

Die Lebensfähigkeit von frischen oder kryokonserviert Monozyten war größer als 95% , wie mit bestimmt Trypanblau 9 Färbung. Abbildung 1 und Abbildung 2 vergleichen bei niedrigeren und höheren Vergrößerungen bzw. der Fortschritt der frischen und kryokonservierten (dh gefroren) Monozytendifferenzierung in Makrophagen. Beachten Sie, dass die frisch im Vergleich mit kryokonservierten Monozyten eine Subpopulation der Diffe...

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Diskussion

definiert Makrophagen-Typen generieren können von den Forschern erhalten einige der widersprüchlichen Ergebnisse verdeutlichen, wenn Makrophagen Biologie zu studieren. Die Verwendung von verschiedenen Kulturbedingungen und Differenzierungsfaktoren Makrophagen primären humanen erzeugen eine Tatsache zu sehr unterschiedlichen Makrophagen-Typen führen kann, die nicht durch den Forscher schätzen. Zum Beispiel werden manchmal Makrophagen aus humanen Monozyten erzeugt allein kein Serum, menschlichem Serum unter Verwendung von...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Abteilung für Transfusionsmedizin, Klinisches Zentrum, National Institutes of Health, stellte elutriierte Monozyten zur Verfügung. Diese Arbeit wurde vom Intramural Research Program, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cellbind 12-Well-KulturplatteCorning3336
CELLSTAR, T-75 Flasche, mit Gewebekultur behandeltGreiner Bio-One North America658157
RPMI 1640 KulturmediumCellgro Mediatech15-040-CMerwärmt auf 37 > C
L-GlutaminCellgro Mediatech25-005-CI
Fötales RinderserumGibco16000-036
M-CSFPeproTech300-25
GM-CSFPeproTech300-03
IL-10 PeproTech200-10
DMSOSigmaD2650
Kryophiläum  Thermo Scientific 
DPBS ohne Ca2+ und Mg2+ Corning Cellgro21-031-CV
0,25 % Trypsin-EDTA Gibco25200-056
50 ml konisches Polypropylen-RöhrchenFalcon352070
Trypan BlueLonza17-942E
Neubauer-verbessertes Helllicht-HämozytometerPaul Marienfeld GmbH & Co. KG610031http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html
CoolCell LX Zelleinfrieren BehälterBioCisionBCS-405andere Gefrierbehälter sollten ebenfalls für diesen Schritt geeignet sein
Flüssigstickstoff-Lagersystem, CryoPlus 1Thermo Scientific 7400Jeder Flüssigstickstofftank sollte ausreichend sein
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Referenzen

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