Methodenartikel

Eine einfache Durchflusszytometrischer Methode Glukoseaufnahme und Glukosetransporter-Expression für Monozytensubpopulationen in Vollblut zu messen

DOI:

10.3791/54255

⸱

12. August 2016

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Monozyten sind integrale Bestandteile des menschlichen angeborenen Immunsystems, die auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen sind, wenn sie aktiviert werden. Wir beschreiben ein durchflusszytometrisches Protokoll zur Messung der Glukosetransporterexpression und der Glukoseaufnahme durch Gesamtmonozyten und Monozyten-Subpopulationen in frischem Vollblut.

Zusammenfassung

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Monozyten sind angeborene Immunzellen, die mit bestimmten chronischen entzündlichen Erkrankungen durch Pathogene und Entzündung aktiviert werden kann. Die Aktivierung von Monozyten induziert Effektorfunktionen und eine damit einhergehende Verlagerung von oxidativem zu glycolytic Stoffwechsel, die durch eine erhöhte Glukosetransporter-Expression begleitet wird. Diese erhöhte Glykolyse-Stoffwechsel ist auch für geübte Immunität von Monozyten, eine Form der angeborenen immunologischen Gedächtnisses beobachtet. Obwohl in vitro - Protokolle Glukosetransporters - Expression und die Glucoseaufnahme durch Monozyten untersucht wurden beschrieben, keines hat durch Mehr parametrischer Durchflusszytometrie in Vollblut untersucht. Wir beschreiben eine Multi-Parameter durchflusszytometrischen Protokoll für die Messung von fluoreszierender Glucoseanalog 2-NBDG Aufnahme in Vollblut durch Total Monozyten und der klassischen (CD14 ++ CD16 -), intermediäre (CD14 ++ CD16 +) und nicht-klassischen ( CD14 + CD16 ++) monocyteSubpopulationen. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Glukosetransporter-Expression und die Glukoseaufnahme für insgesamt Monozyten und Monozytensubpopulationen während Homöostase und entzündliche Erkrankungen zu untersuchen, und kann leicht die Glukoseaufnahme modifiziert werden Subpopulationen für andere Leukozyten und Leukozyten im Blut zu untersuchen.

Einleitung

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Monozyten sind ein wichtiger Bestandteil der menschlichen angeborenen Immunsystems , die 1 bis Stellen der Infektion und Entzündung schnell mobilisiert werden. Aktivierung von Monozyten ist entscheidend für die Begrenzung akuten Schädigung durch Pathogene und auch von zentraler Bedeutung für die Pathogenese von verschiedenen chronischen Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose 2, Krebs 3 und HIV 4,5.

Der Stoffwechsel von ruhenden und aktivierten Monozyten unterscheidet sich dramatisch, mit ruhenden Monozyten oxidativen Stoffwechsel zu nutzen und aktivierten Monozyten unter Verwendung von glykolytischen Metabolismus (dh Vergärung von Glukose zu Laktat) 6. Die Aktivierung von Monozyten induziert die Expression von Glucose - Transporter , die 7 für eine erhöhte Glukoseaufnahme für glykolytischen Stoffwechsel ermöglicht. Monozyt Glukosetransporter 1 (GLUT1) ist ein solcher Transporter nach oben reguliert während der Aktivierung und seine Expression wurde auf die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen in v zu führen gezeigtITRO und im Fettgewebe von fettleibigen Mäusen 8. Die Infektion einer monozytären Zelllinie durch das Kaposi - Sarkom assoziierten Herpes - Virus führt zu zellulären upregulation von GLUT1 9, und wir haben kürzlich gezeigt , dass während der chronischen HIV - Infektion eine erhöhte Anteil an GLUT1-exprimierenden Monozyten vorhanden sind , während der unbehandelten und Kombination antiretrovirale Therapie behandelten Infektion 10. Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass die Glukoseaufnahme und glykolytischen Metabolismus durch Monozyten wichtige Aspekte der vielen Entzündungskrankheiten sind. Somit ist eine einfache Methode, Monozyten GLUT1-Expression und die Glukoseaufnahme während der Homöostase zu messen und entzündliche Erkrankungen ist wahrscheinlich auf ein breites Spektrum von Forschern von Nutzen zu sein.

Menschlichen Monozyten sind heterogene, aus drei verschiedenen Untermengen enthalten ist , die durch differentielle Expression der Zelloberflächenmarker CD14 und CD16 11,12 sucht werden können. Klassische Monozyten exprimieren ein hohes Maß an CD14, aber nicht ausdrücken CD16 (CD14 ++ CD16 -), Express- Zwischen Monozyten ein hohes Maß an CD14 und ein mittleres Niveau von CD16 (CD14 ++ CD16 +) und nicht-klassischen Monozyten ein niedriges Niveau von CD14 und ein hohes Maß an CD16 exprimieren (CD14 + CD16 ++). Monocyten , die CD16 exprimieren , werden CD16 + Monocyten bezeichnet, die CD16 im Vergleich - Monozyten haben eine hohe Expression von inflammatorischen Cytokinen und die Fähigkeit zu effektiver 13,14 Antigene. Etwa 10% der Monozyten exprimieren CD16 während der Homöostase mit höheren Anteilen während der Entzündung beobachtet 15. Monozytensubpopulationen sind mit bestimmten Krankheitszuständen verbunden sind und 16 nützliche biologische Marker der Krankheit und Krankheitsprogression sein könnte.

Unser Ziel war es, ein Verfahren zu identifizieren, die Glukosetransporter-Expression und die Glukoseaufnahme durch menschliche Monozyten und Monozytensubpopulationen in Bedingungen so nahe PHY messen kannphysiologischen Bedingungen wie möglich. Frühere Studien Monozyten Glukosetransporter - Expression gemessen und die Glukoseaufnahme 17,18, obwohl diese Methoden isoliert Monozyten untersucht , die die Proteinexpression im Vergleich zu physiologischen Bedingungen geändert haben , können 19, und keine früheren Studie hat die menschliche Monozytensubpopulationen sucht. Mit Multi-parametrischer Durchflusszytometrie beschreiben wir eine Methode Glukosetransporter-Expression und die Aufnahme des fluoreszierenden Glucose analogen 2-NBDG von insgesamt Monozyten und Monozytensubpopulationen zu untersuchen (basierend auf CD14 und CD16 Expression) innerhalb ganze unmanipulated Blut.

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Protokoll

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HINWEIS: HIV-infizierten und nicht infizierten HIV-Themen aus der Infectious Diseases Einheit am Alfred Hospital in Melbourne, VIC, Australien und von der örtlichen Gemeinde rekrutiert wurden, beziehungsweise. Eine Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern erhalten, und die Forschung wurde von der Alfred Hospital Research und Ethikkommission genehmigt.

1. Glut1 Zelloberflächenerkennung auf Monozyten und Monozytensubpopulationen

  1. Sammeln Sie Blut in Citrat ACD-B Antikoagulans Rohre und beginnen, die Experimente in einem biologischen Sicherheitsschrank innerhalb 1 Stunde der Sammlung.
  2. 100 l Blut in Polypropylenröhrchen. 2 ml 1x Lyselösung (siehe Materialien Table) zu Röhren , während auf Eis, Pipettieren vorsichtig zu mischen. Inkubieren für 15 Minuten auf Eis. Zentrifuge bei 220 × g für 5 min.
  3. Dekantieren und waschen Sie zweimal um ca. 2-4 ml Waschlösung (0,5% BSA in PBS 1x) Zugabe und bei 220 xg für 5 Minuten zentrifugiert wurde.
  4. Verwenden Sie ein Rohrtte sorgfältig so viel von der Waschlösung wie möglich zu entfernen. Die Röhrchen auf Eis und resuspendieren in 100 & mgr; l Waschlösung.
  5. Zur Identifizierung von spezifischen Monozytensubpopulationen Zellen mit dem folgenden Volumen von Antikörpern pro 100 & mgr; l Zellsuspension, hergestellt in Schritt 1.4 Fleck: 5 ul anti-CD3-PE, 5 ul anti-CD14-APC, 5 ul anti-CD16-PECy7, 5 ul Glut1 -FITC oder IgG2b-FITC (Isotyp Steuerrohr).
  6. Auf Eis für 30 min im Dunkeln. Waschen Sie 2 mal mit Waschlösung. Fix mit 200-300 ul 0,5% Formaldehyd in 1x PBS.
  7. Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer erfassen kann 4 Farben innerhalb von 24 Stunden innerhalb der folgenden Anregungs- und Emissionswellenlänge: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660) 10.

2. Glukoseaufnahme von Monozyten

  1. Pipette 90 ul Blut in Schritt 1.1 in Polypropylenröhrchen gesammelt. In 10 ul einer 14,60 uM 2-NBDG Arbeitslösungdie 90 & mgr; l Blut (1,46 mM Endkonzentration) und flick sanft zu mischen. Es ist entscheidend, 2-NBDG Exposition durch Abdecken Rohre mit Aluminiumfolie Licht zu begrenzen.
  2. bei 37 ° C bebrütet 15-30 min im Dunkeln und dann sofort auf Eis legen. 4 ml 1x FACS Röhrchen während auf Eis Lyselösung. Zentrifuge bei 220 × g bei 4 ° C für 5 min.
  3. Wasche einmal durch Zugabe von 4 ml Waschlösung (0,5% BSA in 1x PBS). Zentrifuge bei 220 × g bei 4 ° C für 5 min. Dekantieren und auf Eis.
  4. Stain Zellen mit Antikörpern: 5 & mgr; l anti-CD3-PE, 5 & mgr; l Anti-CD14-APC und 5 & mgr; l Anti-CD16-PECy7. Mischen und auf Eis für 30 Minuten im Dunkeln.
    HINWEIS: In dieser Zeit stellen Sie sicher, das Durchflusszytometer bereit ist für die sofortige Analyse. Erwerben Sie Zellen innerhalb der folgenden Anregungs- und Emissionswellenlänge: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).
  5. In 4 ml eiskaltem Waschpuffer (0,5% BSA in 1x PBS) in Röhrchen.Wasche einmal durch Zentrifugation bei 220 × g bei 4 ° C für 5 min. Dekantieren und 200-300 ul Eis alten PBS hinzuzufügen und so auf Eis im Dunkeln (mit Aluminiumfolie abgedeckt). Analyse auf einem Durchflusszytometer innerhalb von 10 min unter Verwendung von Anregungs- und Emissionswellenlängeneinstellung, wie in Schritt 2.4.

3. Datenerfassung und Auswertung

Hinweis: Die Kenntnis der Durchflusszytometrie und Datenanalyse wird angenommen.

  1. Mit einem Durchflusszytometer der Lage, mindestens 4-Farbanalyse eingestellt Kompensation ungefärbten und individuell gefärbten Proben.
    HINWEIS: Single-Färbung eines FITC-markierten CD4 und CD14 verwendet, kann für GLUT1 und 2-NBDG Kompensation verwendet werden.
  2. Einrichten und beschriften Sie geeignete Fenster, bevor Proben zu erwerben. Zeichnen Sie ein Tor um die Monocytenpopulation und erwerben 100.000 bis 300.000 Ereignissen pro Probe bei mittlerer Geschwindigkeit. 50.000 Ereignisse pro Entschädigung Probe ist ausreichend.
    HINWEIS: Die Entschädigung kann vor durchgeführt werden, zu probierenErwerb oder in Einzelzellanalyse-Software, nach Standardverfahren.
  3. Export und Daten in eine geeignete Position zu speichern. Öffnen Sie Einzelzellanalyse - Software wie FlowJo oder andere Analysesoftware (Supplemental Abbildung 1) und Drag & Drop - Proben wie angegeben (Supplemental Abbildung 2).
  4. Klicken Sie doppelt auf Datei (Supplemental Abbildung 3) zu öffnen. Zeichnen Sie einen Kreis Monozyten Gate basiert auf Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften , wie in 1A und Supplemental Abbildung 4 dargestellt. Doppelklicken Sie auf die Monocytenpopulation. Bitte beachten und einen Rahmen um den CD3 ziehen - Bevölkerung (Supplemental Abbildung 4).
  5. Doppelklicken Sie auf die CD3 - Bevölkerung. Zu beobachten die Monozytensubpopulationen CD14-APC auf der 'x' Achse auswählen und CD16-PECy7 auf der 'Y'- Achse und beschriften entsprechend (Supplemental Abbildung 5).
  6. Wo gibt es keine eindeutigedie Expression von GLUT1 oder 2-NBDG Aufnahme in den spezifischen Monozytensubpopulationen positiven und negativen Populationen messen. Es werden die mittleren Fluoreszenzintensitäten (MFI) von Glut1 und 2-NBDG durch den Isotyp Subtrahieren und kein 2-NBDG Hintergrund (Supplemental Abbildung 6).
  7. Wo definierte Populationen vorhanden sind , verwenden Sie den IgG2b-FITC das Tor zu setzen und bestimmen die prozentualen positiven Zellen (Abbildung 3).
    HINWEIS: Verwenden Sie dieses Verfahren insgesamt CD14 + Monozyten zu analysieren. Da 2-NBDG Aufnahme der Regel durch eine Verschiebung in der Fluoreszenz markiert ist Intensitäten die Daten am besten durch MFI und Histogramme dargestellt.

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Ergebnisse

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Vergütung ist für das individuelle Fluorochrome durchgeführt werden Fluoreszenzstreuung zu verhindern. Monozyten werden zunächst durch Gating basierend auf Vorwärts- und Seitenstreu angereichert. Die Grundstücke präsentiert sind Vertreter auf Vollblut durchgeführt mindestens sechs unabhängigen Experimenten von sechs oder mehr Teilnehmer als zuvor 10 berichtet 1A die anfängliche Gating von Monozyten durch Zellstreuung und den Ausschluss von T - Zellen durch Gat...

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Diskussion

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Das hier beschriebene Protokoll Details, ein einfaches Verfahren Glukosetransporter-Expression und fluoreszierende Glukose analoge Aufnahme durch Monozyten und Monozytensubpopulationen im Vollblut zu untersuchen. Durch die Bewertung 2-NBDG Aufnahme in Vollblut, erlaubt diese Technik für die Bedingungen ähnlich denen in vivo. In einer früheren Studie untersuchten 6-NBDG Aufnahme in Monozyten aus dem Vollblut durch Dichtezentrifugation 17 getrennt. Allerdings hat diese Studie nicht Monozytensubpopulati...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde von der australischen Zentrum für HIV und Hepatitis Virologie Forschung (ACH 2) und ein 2010 Entwicklungsbeihilfe (CNIHR) von der University of Washington Zentrum für AIDS - Forschung (CFAR), ein NIH finanzierte Programm unter Verleihungsnummer AI027757 finanziert , die unterstützt wird durch die folgende NIH Institute und Zentren (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP ist ein Empfänger der CNIHR und ACH 2 Zuschuss. SMC ist ein Empfänger einer National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Hauptforschungsstipendium. Die Autoren danken den Beitrag zu dieser Arbeit der viktorianischen operative Infrastruktur Support-Programm anerkennen vom Burnet Institute erhalten. Wir erkennen die Unterstützung von Geza Paukovic und Eva Orlowski-Oliver von der Amrep Flow Cytometry Core Facility für die Durchflusszytometrie Ausbildung und technische Beratung. Wir danken Angus Morgan für Medien-Coaching und Organisation der Videodreh. Unsere DankbarkeitJesse Masson und Jehad Abdulaziz K. Alzahrani für Labor Unterstützung während der Videoaufnahme. Wir danken den Bemühungen von Dr. David Simar an der School of Medical Sciences, UNSW, Australien, die kritische methodische Beratung angeboten. CSP dankt www.nice-consultants.com für Grafik Konsultationen.

AUTOREN BEITRAG:

CSP konzipierte das Projekt, entworfen und durchgeführten Experimenten, analysiert und interpretiert Daten und schrieb das Manuskript. JJA interpretierten Daten und schrieb das Manuskript. TRB schrieb das Manuskript. JMM interpretierten Daten, machte kritische intellektuelle Anregungen und überprüft das Manuskript. SMC interpretiert Daten, gemacht kritische intellektuelle Anregungen und überprüft das Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
VACUETT Röhrchen 9 ml ACD-B AntikoagulanzienröhrchenGreiner Bio-One GmbH455094
5 ml sterile PolypropylenröhrchenBD Biosciences352063
Albumin aus Rinderserum (BSA)Sigma-AldrichA7906
16%ige FormaldehydlösungElektronenmikroskopie Science15710
BD FACS Lyselösung (10x)BD Biosciences349202BD FACS Lyselösung 1/10 mit deionisiertem Wasser verdünnen, um die Arbeitskonzentration zu erhalten (bis zu 1 Woche bei 4 & Grad; C)
anti-CD3-PEBD Biosciences555340
anti CD14-APCBD Biosciences555399
anti-CD16-PECy7BD Biosciences557744
anti-Glut1-FITCR & D SystemsFAB1418F
IgG2b-FITCR & ; D SystemsIC0041F
2-NBDGLife TechnologiesN13195Suspendieren Sie 5 mg 2-NBDG in 1 ml deionisiertes Wasser, um eine 14,60 mM Stammlösung herzustellen (bis zu 6 Monate bei 4 μm; C). Um die Arbeitskonzentration von 2-NBDG zu erreichen, verdünnen Sie das Material 1/100 mit 1x DPBS. Mit Folie abdecken. (bis zu 1 Woche bei 4 Grad lagern; C)
Dulbecco" s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x)Life technologies14190-144Zur Herstellung einer Waschlösung 0,5 g BSA pro 100 ml DPBS zugeben (bis zu 2 Wochen bei 4 & Grad; C)

Referenzen

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Schlagwörter

Durchflusszytometrie2 NBDG AufnahmeCD14 CD16 GatingHIV Immunmetabolismusfluoreszierendes Glukose AnalogImmunzellmetabolismus

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