Wir haben Zellen aus der Bindehaut des inneren Augenlidrandes von menschlichen Probanden gesammelt, gefärbt und abgebildet. Durch die Charakterisierung der Zellmorphologie und der Stoffwechselaktivität kann diese Methode unser Verständnis des trockenen Auges und der Rolle, die die Reibung zwischen den Augenoberflächen bei der Wahrnehmung von Augenbeschwerden spielen kann, verbessern.
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Methodenartikel
Impressionszytologie des Deckels Wiper Bereich
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es existieren nur wenige Berichte über die zelluläre Anatomie des Lidwischerbereichs (LW) des inneren Augenlids und nur ein Bericht verwendet zytologische Methoden. In dieser Arbeit wird die Optimierung eines Verfahrens zur Entnahme, Färbung und Bildgebung von Zellen aus der LW-Region mittels Impressionszytologie (IC) beschrieben. Die Zellen werden von der Innenfläche des oberen Augenlids menschlicher Probanden unter Verwendung hydrophiler Polytetrafluorethylen (PTFE)-Membranen entnommen und mit zytologischen Farbstoffen gefärbt, um das Vorhandensein von Becherzellen, Muzinen, Zellkernen und verschiedenen Graden der Prä- und Para-Keratinisierung nachzuweisen. Immunzytochemische Farbstoffe zeigen durch den Einsatz eines konfokalen Rasterlasermikroskops Zellesterase-Aktivität und beeinträchtigte Zellmembranen. Für jede Probe werden bis zu 100 mikroskopische Digitalbilder aufgenommen und zu einem hochauflösenden, großflächigen Bild der gesamten IC-Spanne zusammengefügt. Wir zeigen eine höhere Sensitivität von IC als bisher berichtet, die für die Identifizierung zellulärer Morphologien und metabolischer Aktivität im LW-Bereich geeignet ist. Unseres Wissens ist dies das erste Mal, dass diese Auswahl an Fluoreszenzfarbstoffen zur Abbildung von LW IC-Membranen verwendet wurde. Dieses Protokoll wird in zukünftigen Studien wirksam sein, um undokumentierte Details des LW-Bereichs aufzudecken, wie z. B. die Beurteilung zellulärer Besonderheiten von Kontaktlinsenträgern oder Patienten mit trockenem Auge oder Lidwischer-Epitheliopathie.
Einleitung
Der menschliche Oberlid führt rund 10.000 blinkt täglich 1, mit nur 1 - 2 mm schmaler konjunktivaler Region die Augapfels zu widersetzen . Aufgrund seiner Wischbewegung während des Blink, dieser Teil der Lidrand hat den "Deckel Wischer" Bereich 2 bezeichnet worden. Es wird angenommen, dass die Reibung in diesem Bereich während der gewöhnlichen Blinzeln erhöht wird, aufgrund der Deckel über der Kugel Abwischen. Dies kann eine wichtige Rolle in der Augen Komfort spielen. Kontaktlinsenträger insbesondere Erfahrung Augenbeschwerden und dies ist einer der Hauptgründe für Aufhören Linse 3 tragen. Wenn eine Kontaktlinse auf dem Auge platziert ist, ist der Reibungskoeffizient zwischen dem Linsenmaterial und der Augenoberfläche sich gezeigt , 4 zu ändern. Es gibt Hinweise darauf , dass Trockenheit Symptome auf diese veränderte Reibung 2,5,6 zusammenhängen könnte.
Dieser Verein kann auch in klinisch beobachtbaren Phänomenen reflektiert werden, insbesondere Deckel wipro Epitheliopathie (LWE), auch oberen Lidrand - Färbung (ULMS) 6 genannt. LWE ist ein frühes Zeichen der Augenreizung und ein potentieller Prädiktor für trockene Augenkrankheit. Es wird beobachtet, und durch die Vitalfärbung der oberen und unteren Deckelrandbereichen gemessen. Während dieses Grading - System 2 und ihrer klinischen Gültigkeit (dh Korrelation mit subjektiven Symptomen) noch immer umstritten sind, bleibt Augenbeschwerden ein Rätsel für Kliniker und Wissenschaftler gleichermaßen und, was am wichtigsten ist , eine Unannehmlichkeit für den Patienten.
Bis heute ist wenig über klinisch relevanten Veränderungen in der (Teil-) Zelluläre Anatomie und Physiologie des Bereichs Deckel Wischer bekannt 7 und lediglich ein Bericht macht Gebrauch von zytologischen Methoden 8. Impression Zytologie (IC) ist seit mehr als 40 Jahren beschäftigt Zellen aus der epithelialen Oberfläche des Bulbus oder Tarsalbindehaut durch Anwendung einer 9,10 Membran zu sammeln. Nach dem Entfernen erfahren die anhaftenden Zellen cytological Färbung und mikroskopische Bildgebung. Aufgrund der anatomischen und zellulären Unterschiede im Deckel Wischbereich erfordert diese Technik Optimierung.
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Protokoll
Ethik-Anweisung: Vor der Zellen aus menschlichen Patienten zu sammeln, informierte Zustimmung und Ethik Genehmigung eingeholt werden muss.
1. Bereiten Sie Stain
HINWEIS: Bereiten Sie Fleck am Tag des Experiments.
- Werden 5 ul Ethidium (oder 4 & mgr; M) und 5 & mgr; l Calcein AM (oder 4 & mgr; M) zu 2,5 ml Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) in 15 ml Zentrifugenröhrchen; mischen. Wickeln Sie in Aluminiumfolie vor Licht und lagern bei RT bis zur Verwendung zu schützen.
2. Sammeln Zellen
- Entfernen Zellkultureinsätze aus ihrer Verpackung und Beschriftung für jede Augenlid abgetastet werden. Mark Orientierung der Zellsammlung auf der Seite der Membran Kunststoffhalter mit Permanentmarker. Conduct Spaltlampe Inspektion bei mäßiger Vergrößerung (etwa 20fach) eine angemessene Gesundheits der Region zu bestätigen IC zu unterziehen.
- Einen Tropfen Lokalanästhetikum (0,5% Proparacainhydrochlorid) im unteren Bindehautsack von each Auge und weisen Teilnehmer Augen zu halten für eine Minute geschlossen.
- Evert oberen Deckel Auge und halten Sie ihn durch die Wimpern; Kontakt mit dem Deckel Wischbereich zu vermeiden.
Optional: die Hilfe eines sekundären Ermittler kann diesen Schritt auszuführen, erforderlich. - Anwenden Membran senkrecht auf dem Mittelteil des Deckels Wischbereich mit minimalem Druck.
- Halten Membran anstelle 3 - 5 sec. Beachten Sie die Membran durchscheinend im Kontaktbereich. An diesem Punkt, entfernen Sie die Membran und ermöglichen dem Teilnehmer Deckel zu "kippen" zurück an ihren Platz.
- Unverzüglich einem Tropfen PBS auf die Probe anzuwenden, um es zu verhindern das Austrocknen. Membran schaltet lässig und sollte nicht drehen opaque jederzeit, da dies Trocknen angibt. Haben die Sekundär Ermittler gehen sofort mit der Bearbeitung der Proben (Abschnitt 3).
- Führen Prüfung endgültig Auge Integrität der Bindehaut zu gewährleisten. Dispense Augen Schmierstoffe und anweisen Teilnehmerreiben sich die Augen zu vermeiden, bis betäubende Wirkung nachlässt (ca. 15 min.).
3. Probenverarbeitung
- Mit Mikro-Schere, schneiden Sie die Membran in die Hälfte (die eine Hälfte für jede der Downstream-Analysen), die senkrecht durch die Mitte der Zellsammlung. Schneiden Sie entlang der äußeren Rand einer Membran Hälfte aus dem Kunststoffhalter zu trennen; vermeiden Wechselwirkung mit den gesammelten Zellen auf der Membran, auch sichergestellt wird, dass die Membran nicht auf sich selbst falten wird.
- Sichern Sie die Membran Pinzette vor dem vollständigen Lösen von dem Halter verwenden. Platz Membran in markierte 2 ml Zentrifugenröhrchen mit 500 ul 95% (v / v) Ethanol und lassen Sie für mindestens 20 Minuten bis maximal 2 Stunden zu beheben, bevor die Verarbeitung (Abschnitt 4.2).
- Unmittelbar separate zweite Hälfte der Membran (wie in Abschnitt 3.2 beschrieben) und prompt mit Abschnitt 4.1 fortfahren.
4. Probenfärbungs
- Immunocytochemical Anfärben
- Vorsichtig Membran in 35 mm Glasboden Kulturschale mit Sammlung Seite nach unten; gewährleisten Membran ist flach.
- Je 20 ul immunzytochemischer Zusammensetzung Fleck versammelt in Abschnitt 1 auf der Membran. Wenn Probe Locken, verwenden Sie Einweg-Pipettenspitzen vorsichtig die Membran flach an den Kanten nach unten drücken. Vermeiden Sie den Kontakt mit der Zellsammelgebieten.
- Sanft decken die Membran mit Deckglas. Vermeiden Sie unnötige Bewegung der Probe. Deckel Schüssel mit Deckel und Dichtung mit Labor-Film an den Rändern. Nicht Transparenz der Schale (oben und unten) und die Sichtbarkeit der Probe behindern. Beschriften mit Labor-Marker.
- Unmittelbar gehen mit Bildgebung (Abschnitt 5.1), dann wieder auf Abschnitt 4.2 mit zytologische Färbung der anderen Hälfte der Membran fortzusetzen.
- Die zytologische Färbung
- Allmählich Membran Hydrat langsam 500 ul destilliertem Wasser zu dem Rohr Zugabe used zur Fixierung in Abschnitt 3.4. Absaugen Inhalt mehrmals in Pipettenspitze zu mischen, dann Inhalt zu entfernen.
- In 500 ul destilliertem Wasser. stehen lassen für ein paar Sekunden, dann entfernen. In 500 ul alcianblau und lassen für 3 min. Entfernen Fleck und führen Sie 3 aufeinanderfolgende 500 & mgr; l destilliertes Wasser spült oder bis die Flüssigkeit spült klar.
- In 500 ul Hematoxylin # 1 Fleck und lassen für 3 min. Entfernen Fleck und führen in drei aufeinander folgenden 500 & mgr; l destilliertes Wasser Spülungen oder bis die Flüssigkeit spült klar. Entwässern (Rückseite der Abschnitt 4.2.1) durch die klare Flüssigkeit abgesaugt.
- In 500 ul Papanicolaou OG-6 Fleck und lassen für 3 min. Entfernen Fleck und führen Sie einen 500 & mgr; l 95% (v / v) Ethanol spülen.
- In 500 ul Papanicolaou EA-65 Fleck und lassen für 3 min. Entfernen stain und führen 3 aufeinanderfolgende 500 & mgr; l 95% (v / v) Ethanol Spülungen.
- Fully dehydratisieren drei aufeinanderfolgende 500 & mgr; l 100% Ethanol Spülungen verwendet. Mit TWEezers, entfernen Probe aus der Lösung; vermeiden Sie das Berühren Zellsammelgebiete.
- Legen Membran auf Glasobjektträger; diese Zelle Sammelleitung sicherzustellen, ist entweder parallel oder senkrecht Rand zur leichteren Ausrichtung während der Bildgebung zu gleiten.
- Einen Tropfen von 100% Ethanol und Deckel mit Glas rutschen. Unmittelbar gehen mit Bildgebung (Abschnitt 5.2).
5. Beispiel Imaging
- Imaging Fluorescent Immunzytochemische Stains
- Verwenden eines konfokalen Laserscanning - Mikroskops (CLSM) 11 oder Fluoreszenzmikroskop 12, mit einer digitalen Farbkamera ausgestattet ist , mit einem Computer verbunden Software eine Bildaufnahme ausgeführt wird . Aufgrund der Proben innerhalb Kulturschalen enthalten ist, kann ein umgekehrtes Mikroskop erforderlich sein.
- Set up Mikroskop 11,12 nach Absorptions- und Emissionsspektren von Ethidium Homodimer-1 (528/617 nm Ex / Em maxima in Gegenwart von DNA) und Calcein AM (494/517 nm Ex / Em maxima).
- Wählen Sie die kleinste Vergrößerung des Mikroskops (zB 2.5X Objektiv) und aktivieren Sie den Digital - Imaging - System; beachten Sie die auf dem Computermonitor angezeigt Probe.
- Überprüfen Sie Probe für zelluläre Funktionen von Interesse.
- Wählen Sie die gewünschte Mikroskopvergrößerung und Bilder aufzunehmen, Imaging-Software.
- Speichern von Dateien in entweder nativ Mikroskop - Dateiformat oder ein unkomprimiertes Dateiformat (zB * .raw, * .tif).
- Imaging zytologische Stains
- Mit einem Standard-Laborhellfeldmikroskop ohne Filter, mit einer digitalen Farbkamera ausgestattet ist, mit einem Computer verbunden Software eine Bildaufnahme ausgeführt wird.
- Platz und Schloss Glasträger (aus Schritt 4.2.8) auf Mikroskoptisch. Rehydrieren Probe mit 100% Ethanol je nach Bedarf über den gesamten Abbildungsverfahren.
- Wählen Sie die kleinste Vergrößerung des Mikroskops (zB 2.5X Objektiv) und aktivieren the Digital-Imaging-System; beachten Sie die auf dem Computermonitor angezeigt Probe.
- Stellen Sie sicher, Zellsammlung ist entweder mit X oder Y-Achse des Mikroskoptisch Steuerung ausgerichtet. Stellen Sie, wenn nötig, durch das Deckglas zu entfernen und durch Drehen der Probe mit einer Pipettenspitze oder mit einer Pinzette.
- Unter Verwendung der Imaging-Software, Capture-Bild (er) der gesamten Probe mit dem niedrigsten Mikroskopvergrößerung.
- Wechseln Sie zu moderaten Mikroskopvergrößerung (zB 10 - 20fach - Objektiv) und justieren Mikroskop Lichtquelle und Software Abbildungsparameter (Belichtung, Kontrast, Weißabgleich, etc.), und deaktivieren Sie die automatische Software Metering. Speichern Sie diese Einstellungen für die zukünftige Verwendung.
- Bestimmen Sie Anfangs- und Endpunkte von Scan (zB oben links und unten rechts Ecken der Zellsammlung).
- Unter Verwendung der Imaging-Software, Capture-Bild (er) der gesamten Zelle Sammelbereich innerhalb der Anfangs- und Endpunkte. Stellen Sie sicher, 20% von Seite zu Seite und von oben nach unten überlappen between alle benachbarten Bildern.
- Speichern von Dateien mit dem nativen Mikroskop - Dateiformat oder ein unkomprimiertes Dateiformat (zB * .raw, * .tif).
- Generieren endgültige Panoramabild mit automatisierten Stitching - Software der Wahl (zB Adobe Photoshop Elements). Verwenden Sie Referenzbilder im Schritt genommen 5.2.5), um die Genauigkeit der automatischen Heften im endgültigen Bild zu bestätigen.
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Ergebnisse
Die Zellkulturmembran über den Kunststoffhalter aufgespannt ist ein praktisches Werkzeug für Handheld-Sammlung von Epithelzellen aus dem Deckel Wischer Konjunktiven. Dieses Verfahren eliminiert die Notwendigkeit für zusätzliche sterilisierten Instrumente typischerweise verwendet zur Vorbereitung und IC Membranen verarbeiten. 1 ist die IC des Deckels Wischbereich stellt einen Zellkultureinsatz verwendet wird . Wir optimiert zwei verschiedenen Färbungsprotokolle, die sich ...
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Diskussion
Impressionszytologie wird typischerweise auf der bulbären Bindehaut durchgeführt, gemischte Celluloseestermembranen. Proben werden aus Schüttgut Blätter zugeschnitten, sterilisiert, aufgetragen und von der Oberfläche entfernt konjunktivale mit einer Pinzette. Unter Verwendung der gleichen Membranmaterial, ein kolbengesteuertes wurde IC - Vorrichtung vor kurzem entwickelt , um die Oberflächengeometrie der bulbären Bindehaut zu entsprechen, und aufrechtzuerhalten konsistente Druck zwischen Anwendungen 13. Diese...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine relevanten Förderungen oder Konflikte offenzulegen.
Danksagungen
Wir möchten unserem Kollegen Dr. Jalaiah Varikooty danken, der Einblicke und Fachwissen zum Thema des Deckelwischers zur Verfügung gestellt hat, die diese Forschung sehr unterstützt haben.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue, 1 % in 3 % Essigsäure | Sigma | B8438-250ML | |
| Hämatoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou-Färbung, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou-Färbung, modifiziertes EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Lebend-/Totlebensfähigkeits-/Zytotoxizitätskit | Life Technologies | L-3224 | enthält die Farbstoffe Ethidium-Homodimer-1 und Calcein AM |
| Alcain (0,5 % Proparacainhydrochlorid) | Alcon | ||
| Millicell Zellkultureinsatz, 12 mm, hydrophiles PTFE, 0,4 &Mikro; m | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glasbodenschalen | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referenzen
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