Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Messung der Phagozytose von Monozyten und Granulozyten und der oxidativen Burst-Aktivität in menschlichen Blutproben vorzustellen.
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Methodenartikel
Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Granulozyten- und Monozyten-Phagozytose- und Oxidative Burst (OB)-Aktivitätsassay kann verwendet werden, um das angeborene Immunsystem zu untersuchen. Dieses Manuskript bietet die notwendige Methodik, um diesen Assay in ein Arsenal der Bewegungsimmunologie aufzunehmen. Der erste Schritt in diesem Assay besteht darin, zwei Aliquots ("H" und "F") von Vollblut (Heparin) herzustellen. Dann wird Dihydroethidium zum H-Aliquot hinzugefügt, und beide Aliquote werden in einem warmen Wasserbad inkubiert, gefolgt von einem kalten Wasserbad. Als nächstes wird Staphylococcus aureus (S. aureus) zum H-Aliquot und Fluorescein-Isothiocyanat-markierter S. aureus zum F-Aliquot (Bakterien:Phagozyten = 8:1) hinzugefügt, und beide Aliquots werden in einem warmen Wasserbad inkubiert, gefolgt von einem kalten Wasserbad. Dann wird jedem Aliquot Trypanblau zugesetzt, um die extrazelluläre Fluoreszenz zu löschen, und die Zellen werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Als nächstes werden die roten Blutkörperchen lysiert und die weißen Blutkörperchen fixiert. Schließlich werden ein Durchflusszytometer und eine entsprechende Analysesoftware verwendet, um die Phagozytose von Granulozyten und Monozyten sowie die OB-Aktivität zu messen. Dieser Assay wird seit über 20 Jahren verwendet. Nach starker und längerer Anstrengung kommt es bei Sportlern zu einem signifikanten, aber vorübergehenden Anstieg der Phagozytose und einer längeren Abnahme der OB-Aktivität. Die Zunahme der Phagozytose nach dem Training korreliert mit einer Entzündung. Im Gegensatz zu normalgewichtigen Personen ist die Granulozyten- und Monozyten-Phagozytose bei übergewichtigen und adipösen Teilnehmern chronisch erhöht und korreliert moderat mit dem C-reaktiven Protein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser auf Durchflusszytometrie basierende Assay die Phagozytose und OB-Aktivität von Phagozyten misst und als zusätzliches Maß für bewegungs- und adipositasinduzierte Entzündungen verwendet werden kann.
Einleitung
Die Granulozyten und Monozyten Phagozytose / oxidativen Burst (OB) Aktivitätstest ist eine einfache, geradlinige Technik , die häufig verwendet wird , um Informationen über angeborene Immunfunktion nach längerer und intensiver Bewegung zu sammeln. 1-4 Wenn die Antwort des Immunsystems studieren ein Stimulus sind Granulozyten und Monozyten von besonderem Interesse , weil sie eine zentrale Rolle in der Wirtsabwehr und sind die ersten Immunzellen an den Ort der Infektion zu akkumulieren spielen. 5 Neutrophile, eine Art von Granulozyten, sind die ersten Zellen in beschädigten Muskel zu translozieren Gewebe nach intensiver Übung. 6
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Protokoll
HINWEIS: Alle Blutsammelverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt von der Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) dargelegt.
1. Assay Vorbereitung
- Sammeln, vorzubereiten und zu organisieren, die Materialien für das Verfahren angegeben (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung).
- Etikett 12 x 75 mm Rohre.
- Label zwei Röhren für jeden Teilnehmer: ein Rohr für die Phagozytose-Test (Label dieser Röhre mit schwarzer Tinte und ein "F" für Fluoresceinisothiocyanat [FITC]) und ein Rohr für die OB-Aktivitätstest (Label dieses Rohr mit roter Tinte und einem....
- Etikett 12 x 75 mm Rohre.
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Ergebnisse
Längerer und intensive Übung hat profunde Auswirkungen auf die angeborene Immunfunktion, einschließlich der natürlichen Killerzellen-Funktion, Makrophagen-Zytokin-vermittelten Immunantwort auf virale Infektionen und Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivität. Mehrere Studien zeigen, dass Granulozyten und Monozyten Phagozytose steigt deutlich nach dem Training, um die Entzündung durch Muskelschäden und metabolischen Anforderungen induziert widerspiegelt. Im Gegensatz dazu Gra.......
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Diskussion
Diese Handschrift stellt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung von zwei Indikatoren von Granulocyten und Monocyten-Funktion. Wir haben einige Schritte identifiziert, die für den Erfolg dieses Tests sind entscheidend. Ein solcher Schritt ist das Eisbad Inkubation, die Zugabe von Bakterien unmittelbar vor auftritt. Gründliches Kühlen aller Proben wird die Wirkung der Temperatur auf die Phagozytose und OB-Aktivität minimieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Zugabe von Bakterien zu jeder Probe. A 8: .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich Zack Shue, Casey John und Lynn Cialdella-Kam für ihre Unterstützung bei der Optimierung dieses Verfahrens zu bestätigen.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 12 x 75 mm Röhrchen, mit Kappe | VWR | 20170-579 | Sie benötigen 2 Röhrchen pro Probe ("H" und "F") plus 3 Röhrchen pro Charge (für Assay-Kontrollen; "F", "H" und "Nur Blut"). |
| PBS (10x), pH 7,4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Flaschenverschluss 0,2 & Mikro; m Celluloseacetat-Filter (500 ml Fassungsvermögen) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glukose, Pulver | Life Technologies | 15023-021 | |
| Zitronensäure (wasserfrei, Zellkultur getestet, Pflanzenzellkultur getestet) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Natriumcitrat dreibasisches Dihydrat | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidin) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl Sulfoxid (DMSO) wasserfrei | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus ( Holzstamm ohne Protein A) BioPartikel, Fluorescein-Konjugat (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus ( Holzstamm ohne Protein A) BioParticles, unmarkiert | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4,0 ml Vacutainer mit 7,2 mg K2EDTA, sprühgetrocknet | VWR | BD367861 | Sie benötigen 1 K2EDTA Blutentnahmeröhrchen pro Probe. |
| 4,0 ml Vacutainer mit 68 USP-Einheiten Lithium-Heparin, sprühbeschichtet | VWR | BD367884 | Pro Probe benötigen Sie 1 Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen. |
| SCHAR AC· T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.d., Hämatologie-Analysator |
| COULTER Ac· T 5diff Spülung | Beckman Schar | 8547167 | |
| Schar Ac· T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac· T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac· T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac· T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac· T 5diff Control Plus | Beckman Schar | 7547198 | |
| AcT 5diff Verdünnungsmittel | Beckman Schar | 8547169 | |
| 200 µ l verlängerte Pipettenspitzen | VWR | 37001-526 | |
| Isolierte Eiswanne | VWR | 89198-980 | Für Eiswasserbad. |
| Offenes Röhrchengestell aus Metall | VWR | 60916-702 | |
| Fötales Rinderserum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automatisierte Workstation zur Vorbereitung der Zelllyse |
| ImmunoPrep Reagenziensystem | Beckman Coulter | 7546999 | i.d., RBC-Lyse/WBC-Fixreagenzsystem |
| Cytomics FC500 MCL Durchflusszytometrie-System mit CXP-Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Swrap Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorosphären | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., Ausrichtung und Fluidik Verifikation von Fluorosphären |
| FlowJo Software | FlowJo FlowJo | i.e., Software für die Durchflusszytometrie-Analyse | |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., elektronisches Tabellenkalkulationsprogramm |
Referenzen
- Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
- Knab, A. M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
