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Methodenartikel

Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut

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DOI:

10.3791/54264

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12. September 2016

 ,  ,  ,  , 
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Messung der Phagozytose von Monozyten und Granulozyten und der oxidativen Burst-Aktivität in menschlichen Blutproben vorzustellen.

Zusammenfassung

Der Granulozyten- und Monozyten-Phagozytose- und Oxidative Burst (OB)-Aktivitätsassay kann verwendet werden, um das angeborene Immunsystem zu untersuchen. Dieses Manuskript bietet die notwendige Methodik, um diesen Assay in ein Arsenal der Bewegungsimmunologie aufzunehmen. Der erste Schritt in diesem Assay besteht darin, zwei Aliquots ("H" und "F") von Vollblut (Heparin) herzustellen. Dann wird Dihydroethidium zum H-Aliquot hinzugefügt, und beide Aliquote werden in einem warmen Wasserbad inkubiert, gefolgt von einem kalten Wasserbad. Als nächstes wird Staphylococcus aureus (S. aureus) zum H-Aliquot und Fluorescein-Isothiocyanat-markierter S. aureus zum F-Aliquot (Bakterien:Phagozyten = 8:1) hinzugefügt, und beide Aliquots werden in einem warmen Wasserbad inkubiert, gefolgt von einem kalten Wasserbad. Dann wird jedem Aliquot Trypanblau zugesetzt, um die extrazelluläre Fluoreszenz zu löschen, und die Zellen werden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Als nächstes werden die roten Blutkörperchen lysiert und die weißen Blutkörperchen fixiert. Schließlich werden ein Durchflusszytometer und eine entsprechende Analysesoftware verwendet, um die Phagozytose von Granulozyten und Monozyten sowie die OB-Aktivität zu messen. Dieser Assay wird seit über 20 Jahren verwendet. Nach starker und längerer Anstrengung kommt es bei Sportlern zu einem signifikanten, aber vorübergehenden Anstieg der Phagozytose und einer längeren Abnahme der OB-Aktivität. Die Zunahme der Phagozytose nach dem Training korreliert mit einer Entzündung. Im Gegensatz zu normalgewichtigen Personen ist die Granulozyten- und Monozyten-Phagozytose bei übergewichtigen und adipösen Teilnehmern chronisch erhöht und korreliert moderat mit dem C-reaktiven Protein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser auf Durchflusszytometrie basierende Assay die Phagozytose und OB-Aktivität von Phagozyten misst und als zusätzliches Maß für bewegungs- und adipositasinduzierte Entzündungen verwendet werden kann.

Einleitung

Die Granulozyten und Monozyten Phagozytose / oxidativen Burst (OB) Aktivitätstest ist eine einfache, geradlinige Technik , die häufig verwendet wird , um Informationen über angeborene Immunfunktion nach längerer und intensiver Bewegung zu sammeln. 1-4 Wenn die Antwort des Immunsystems studieren ein Stimulus sind Granulozyten und Monozyten von besonderem Interesse , weil sie eine zentrale Rolle in der Wirtsabwehr und sind die ersten Immunzellen an den Ort der Infektion zu akkumulieren spielen. 5 Neutrophile, eine Art von Granulozyten, sind die ersten Zellen in beschädigten Muskel zu translozieren Gewebe nach intensiver Übung. 6 Phagozytose und OB - Aktivität sind die häufigsten Maßnahmen von Granulozyten und Monozyten - Funktion, 7 und werden als Indikatoren der angeborenen Immunzellfunktion aufgrund ihrer zentralen Rolle in sowohl der Infektion und dem Reparaturprozess bevorzugt.

Der Test in diesem Manuskript utili beschriebenzes eine Grund Durchflusszytometer eine quantitative Bestimmung von Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivität in Vollblut zur Verfügung zu stellen. Die Verwendung von Vollblut in dieser Technik ist vorteilhaft, da es die Assay erlaubt ohne zeitraubende Reinigungsverfahren durchgeführt werden. Dieser Test kann leicht eine Vielzahl von Forschungsdesigns und Labor-Fähigkeiten zur Aufnahme geändert werden. B. Liao et al. Verwendeten eine ähnliche Technik , die Neutrophilen - OB - Aktivität zu zeigen , erhöht wird und neutrophile Phagozytose wird nach einer traumatischen Hirnverletzung verringert. 8 In einem anderen Beispiel, McFarlin et al. Beschrieben eine elegante Abwandlung dieser Technik , die Allophycocyanin verwendet (APC ) -konjugierte CD66b und High-Performance - Tandem - APC-konjugierten CD45 - Markierung mit bildbasierten Durchflusszytometrie Granulozyten hinsichtlich ihrer Phagozytose und OB - Aktivitäten zu klassifizieren. 7,9

Unsere Forschungsgruppe hat verschiedene Anpassungen dieser te verwendetchnique als Indikator für die angeborene Immunfunktion bei Übergewicht, fettleibig, und athletische Bevölkerung seit fast 20 Jahren. 10,11 Der Text wird den Leser bieten mit Schritt- für -Schritt - Anleitungen zur Durchführung dieses Tests und Bereiche hervorheben , dass der Leser anpassen kann die Bedürfnisse ihrer Forschung gerecht zu werden.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Blutsammelverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien durchgeführt von der Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) dargelegt.

1. Assay Vorbereitung

  1. Sammeln, vorzubereiten und zu organisieren, die Materialien für das Verfahren angegeben (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung).
    1. Etikett 12 x 75 mm Rohre.
      1. Label zwei Röhren für jeden Teilnehmer: ein Rohr für die Phagozytose-Test (Label dieser Röhre mit schwarzer Tinte und ein "F" für Fluoresceinisothiocyanat [FITC]) und ein Rohr für die OB-Aktivitätstest (Label dieses Rohr mit roter Tinte und einem " H "für Dihydroethidium [HE]).
        HINWEIS: Die Verwendung von sterilen 12 x 75 mm Röhrchen sollten unbeabsichtigte zelluläre Aktivierung und damit verbundene Erhöhung der Hintergrundrauschen zu minimieren.
      2. Beschriften drei Röhren für die Assay-Kontrollen: ein Rohr für die Phagozytose-Assay (FITC-Kontrolle: mit der Kennzeichnung dieses Rohr mit schwk Tinte und ein "F"), ein Rohr für die OB-Aktivitätstest (HE Kontrolle: mit der Kennzeichnung dieses Rohr mit roter Tinte und einem "H"), und ein Rohr für die Negativkontrolle (Blut nur: dieses Rohr mit grüner Tinte beschriften und "Blut nur").
    2. Stocklösungen mindestens einen Tag vor dem Tag des Assays.
      1. Bereiten Sie die sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Verdünne mit 100 ml 10 - fach PBS mit 900 ml von 18,2 M & Omega; H 2 O. Filter zu sterilisieren mit einem 0,2 um Filter. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      2. Bereiten Sie die sterile PBS-Glucose. Man löst 1,0 g Glucose in 100 ml PBS. Filter zu sterilisieren mit einem 0,2 um Filter. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      3. Bereiten Sie die sterile 0,1 M Citratpuffer. Man löst 1,2 g Zitronensäure und 1,1 g Natriumcitrat in 100 ml von 18,2 M & Omega; H 2 O. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,0. Filter zu sterilisieren mit einem 0,2 um Filter. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      4. Bereiten Sie die HE-Stammlösung. Resuspend 1,0 mg HE in 1,0 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Vorsichtig mischen, aliquoten, und bei -20 ° C bis zur Verwendung.
      5. Bereiten Sie die FITC-markiertem Staphylococcus aureus (S. aureus) Stammlösung (2 x 10 9 Partikel / ml). Resuspendieren von 10 mg FITC-markiertem S. aureus in 1,5 ml (oder entsprechende Menge) von PBS. Teilen Sie sich in drei 500 ul Aliquots und beschallen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung.
      6. Bereiten Sie die unbeschriftete S. aureus - Stammlösung (2 × 10 9 Partikel / ml). Resuspendieren 100 mg unmarkiertem S. aureus in 15 ml (oder entsprechende Menge) von PBS. Teilen Sie sich in dreißig 500 ul Aliquots und beschallen entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung.
    3. Bereiten frische Arbeitslösungen am Tag des Assays.
      1. Bereiten Sie die HE-Arbeitslösung. Übertragung von 10 ulaufgetauten HE Stammlösung zu 990 ul PBS-Glucose. Vor Licht und halten auf Eis bis zum Gebrauch.
      2. Bereiten Sie die FITC-markierten S. aureus - Arbeitslösung (133.333 Partikel / ul). Transfer 70 ul aufgetauten FITC-markiertem S. aureus - Stammlösung zu 980 ul PBS. Vor Licht und halten auf Eis bis zum Gebrauch.
      3. Bereiten Sie die unbeschriftete S. aureus - Arbeitslösung (133.333 Partikel / ul). Transfer 70 ul aufgetaut unmarkierten S. aureus - Stammlösung zu 980 ul PBS. Vor Licht und halten auf Eis bis zum Gebrauch.
      4. Bereiten Sie die Quench-Lösung. In 750 & mgr; l von 0,4% Trypanblau Lösung auf 11,25 ml sterilem 0,1 M Citratpuffer. Halten Sie in einem Eis-Wasserbad bis zur Verwendung.
    4. Haben Sie einen zertifizierten phlebotomist Blut nach der World Health Organization Richtlinien für die Erstellung Blut ziehen.
      1. Zeichnen Sie Blut in ein 4 ml Blutentnahmeröhrchen mit K 2 EDTA. Imvert Blutentnahmeröhrchen nach den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Blutentnahmeröhrchen bei Raumtemperatur auf einem Benchtop-Rocker bis zum Gebrauch. Verwenden Sie dieses Blut für die Blutbild (CBC) mit der weißen Blutzellen (WBC) Differentialanalyse in Schritt 1.2.1 beschrieben.
      2. Zeichnen Sie Blut in ein 4 ml Blutentnahmeröhrchen mit Lithium-Heparin. Invert-Blutsammelröhrchen nach den Anweisungen des Herstellers. Halten Sie Blutentnahmeröhrchen bei RT auf einem Benchtop-Rocker bis zum Gebrauch. Verwenden Sie dieses Blut für die Monozyten- und Granulozyten Phagozytose und OB-Aktivitätstest in Schritt 2 beschrieben.
  2. Bestimmung der Menge der Bakterien (dh S. aureus) , die benötigt wird , um den Test für jede Probe zu vervollständigen.
    1. Verwenden Sie einen Hämatologieanalysator ein CBC mit WBC-Differentialanalyse auf das Blut durchzuführen, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben. Notieren Sie sich die Leukozytenzahl (in Zellen / ml),% Neutrophile und%Monozyt Werte.
    2. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen, die die Neutrophilen und Monozyten zählt für jede Probe zu bestimmen.
      Neutrophilenzahl (in Zellen / ml) =% Neutrophile × WBC (in Zellen / ml)
      Monozytenzahl (in Zellen / ml) =% Monocyten × WBC (in Zellen / ml)
    3. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen die Phagozyten Zählung für jede Probe und die Anzahl von Phagozyten in 100 & mgr; l der Probe vorhanden zu bestimmen.
      Phagozyten Zahl (in Zellen / ml) = Neutrophilenzahl (in Zellen / ml) + Monozytenzahl (in Zellen / ml)
      Anzahl von Phagozyten in 100 & mgr; l = (Phagocyte Zahl (in Zellen / ml)) / 10
    4. Verwenden Sie die folgende Gleichung , um die Anzahl von Bakterien (dh S. aureus) für jede Probe und die Menge an FITC-markiertem S. benötigt , um zu bestimmen aureus oder unmarkiert S. aureus - Arbeitslösung (133.333 Partikel / ml) , die zu jedem Röhrchen gegeben werden sollte.
      HINWEIS: Die Zielbakterien: Phagozyten-Verhältnis 8: 1.
      Anzahl der Bakterien benötigt =Anzahl von Phagozyten in 100 & mgr; l × 8
      Volumen von FITC oder unmarkiert Arbeitslösung (in ul) benötigt = (Anzahl der Bakterien benötigt) / (133.333 Partikel / ul)

2. Führen Sie Assay

  1. Bereiten Vollblut für den Assay.
    1. Für jeden Teilnehmer und Steuerrohr, verwenden eine erweiterte Länge Pipettenspitze 100 ul Vollblut aus der Lithium-Heparin-Blutsammelröhrchen an der Unterseite eines entsprechend markierten 12 x 75 mm Rohr zu übertragen. Ersetzen Kappen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, auf den Seiten der 12 x 75 mm Rohre gelangen Blut zu vermeiden.
    2. Verwenden Sie einen Mikro 10 ul hinzufügen von HE zu den Rohren mit roter Tinte markiert und ein "H", einschließlich der HE Steuerrohr-Arbeitslösung. Ersetzen Kappen und Wirbel kurz.
    3. Inkubieren alle Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Dann übertragen sofort alle Rohre auf einem Eis-Wasserbad für 12 min.
      HINWEIS: Verwenden Sie eine offene Metallgestellund sanft schütteln Sie das Rack alle 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Rohre schnell und angemessen erwärmt oder gekühlt.
  2. In Bakterien (dh S. aureus) auf die Probe und Kontrollröhrchen.
    1. Verwenden Sie einen Mikro die entsprechende Menge hinzuzufügen (berechnet in Schritt 1.2.4) von unmarkierten S. aureus Arbeitslösung auf die mit roter Tinte markierten Röhrchen und einem "H", einschließlich der Steuerrohr HE. Ersetzen Kappen und Wirbel kurz.
    2. Verwenden Sie einen Mikro die entsprechende Menge hinzuzufügen (berechnet in Schritt 1.2.4) von FITC-markierten S. aureus - Arbeitslösung zu den mit schwarzer Tinte markierten Röhrchen und einem "F", einschließlich der FITC Steuerrohr. Ersetzen Kappen und Wirbel kurz.
    3. Vortex das "Blut nur" Steuerrohr, aber nicht beide Arten von Bakterien (dh S. aureus) , um es hinzuzufügen.
    4. Inkubieren alle Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 20 min. Verwenden Sie ein offenes Metallgestell und sanft schütteln Sie das Rack alle 5 minum sicherzustellen, dass die Rohre schnell und adäquat erwärmt. Nach der Inkubationszeit, übertragen sofort alle Rohre zu einem Eis-Wasser-Bad für 1 min.
  3. Waschen Sie die Zellen.
    1. Verwenden Sie einen Repeater-Pipette 100 ul eiskalter Quench-Lösung in alle Röhrchen hinzuzufügen. Ersetzen Kappen, Wirbel kurz, und dann brüten alle Röhrchen auf Eis für 1 min.
    2. Verwenden Sie einen Repeater-Pipette 1 ml eiskaltem PBS in alle Röhrchen hinzuzufügen. Vortex kurz, und dann weitere 2 ml eiskaltem PBS zu allen Röhrchen hinzufügen und Kappen ersetzen. Zentrifuge alle Röhrchen für 5 min bei 4 ° C und 270 xg und aspirieren dann den Überstand.
    3. Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 einmal (insgesamt 2 Wäschen).
  4. Bereiten Sie die Proben für die Durchflusszytometrie.
    1. Verwenden Sie einen Repeater-Pipette 50 ul eiskaltem fötalen Rinderserum zu allen Röhrchen hinzuzufügen. kurz vortexen alle Röhrchen.
    2. Übertragen Sie alle Rohre auf einen geeigneten Karussell und eine automatisierte Zelle lysieren Vorbereitung Workstation mit roten Blut cell (RBC) Lysieren und WBC-Befestigungs Reagenzien, die roten Blutkörperchen und fixieren die WBL zu lysieren, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben.
    3. Nach der automatisierten Zell lyse Vorbereitung Workstation Lauf abgeschlossen hat, wickeln Rohre in Aluminiumfolie und Speicher in einem 4 ° C Kühlschrank stellen, bis die Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt werden kann.

3. Durchflusszytometrie Acquisition

  1. Richten Sie die Durchflusszytometrie-System.
    1. Wärmen Sie die Durchflusszytometrie-System wie in der Bedienungsanleitung des Herstellers gerichtet. Dann überprüfen Sie die Reagenzien und Abfallbehälter Ebenen. Falls erforderlich, füllen Sie die Reagenzienbehälter und / oder den Abfallbehälter entleeren.
    2. Verwenden Sie die "Clean-Panel" -Funktion das System sauber Zyklus laufen. Dann wird die Ausrichtung und Fluidik Überprüfung Fluorospheres laufen, und stellen Sie sicher, dass der Halbsvariationskoeffizient (HPCV) für jeden Detektor innerhalb des vorgegebenen Bereichs in der Qualitätskontrolle beschrieben ist (QC) Protokolle, die von der Herstellung zur Verfügung gestelltr.
  2. Erstellen Assay spezifische Erfassung und Geräteeinstellung Protokolle.
    1. Erstellen Assay spezifische Akquisitionsprotokolle für die Phagozytose und OB Aktivitätstests.
      HINWEIS: Die Anschaffungs Protokolle hier beschrieben sind, können für die Verwendung auf jedem Durchflusszytometer mit einem blauen Laser (488 nm), ein Filter (530/30) für FITC, und ein Filter (575/26) für HE angepasst werden.
      1. Öffnen Sie die Durchflusszytometrie System Erfassungs-Software und erstellen Sie ein "Neues Protokoll".
      2. Wählen Sie die "FL1 Parameter" für die Phagozytose-Assay (FITC) und der "FL2 Parameter" für den OB-Aktivitätstest (HE).
      3. Erstellen Sie die Plots (dh Vorwärtsstreuung [FSC] vs. Seitenstreuung [SSC] Punktdiagramm, FL1 Histogramm, FL2 - Histogramm) für die Erfassung erforderlich.
      4. Erstellen Sie polygonale Regionen für den WBC (weiße Blutkörperchen), Granulozyten und Monozyten - Populationen auf der FSC gegen SSC Plot und erstellen Sie lineare Bereiche auf den FL1 und FL2 Histogramme. Set a & #Count Stop "von 50.000 Ereignisse um den WBC-Tor; 34.
      5. Speichern Sie die Protokolle mit Assay-spezifischen Namen.
    2. Erstellen Assay spezifische Geräteeinstellung Protokolle für die Phagozytose und OB Aktivitätstests.
      1. Drag & Drop die "Test-spezifischen Akquisitionsprotokolle" (definiert in Schritt 3.2.1) von der "Ressource-Explorer" auf die "Acquisition Manager" auf der Durchflusszytometrie System Erfassungssoftware.
        HINWEIS: Die Informationen in dieser Art und Weise hinzugefügt werden immer am Ende des Arbeitsvorrats angezeigt.
      2. Geben Sie den Probeninformationen in den Arbeitsvorrat und den Arbeitsvorrat zu speichern.
      3. Entfernen Sie die Kontrollprobenröhrchen vom 4ºC Kühlschrank und lassen sie für 15 min auf Raumtemperatur äquilibrieren. Dann kurz vortexen jedes Steuerprobenröhrchen.
      4. Verwenden Sie die "Test-spezifischen Akquisitionsprotokolle" definiert in Schritt 3.2.1 die negative Kontrollprobe (dh Blut nur) und die positive Kontrolle zu laufenProben (dh er die Kontrolle, Steuerung FITC) durch die Durchflusszytometrie - System. Überprüfen Sie die Histogramme und stellen Sie die Fotovervielfacherröhre (PMT) Spannungen des FITC und Phycoerythrin (PE) Kanäle nach Bedarf.
      5. Vortex, um die Kontrollproben und übertragen sie an die Durchflusszytometrie System Karussell nach der Reihenfolge auf der Arbeitsliste. Legen Sie dann das Karussell in der Probenkammer und klicken Sie auf die Cytometer Toolbar Schaltfläche "Start" Daten für die Kontrollproben zu erwerben. Speichern Sie die "xxx Einstellung Pro" Einstellung Protokoll.
  3. Erwerben Studie Proben auf der Durchflusszytometrie-System.
    1. Entfernen Sie die Studie Probenröhrchen aus dem 4 ° C Kühlschrank und auf Raumtemperatur 15 Minuten äquilibrieren.
    2. Während die Proben Äquilibrieren, ziehen Sie die vordefinierten studienspezifischen Akquisitionsprotokolle in den Arbeitsvorrat Raum ein Projekt Vorrat machen.
    3. Bestätigen Sie, dass die "Einstellung Protokoll" auf die & verknüpft ist# 34;. Assay-spezifische Einstellung Protokolle "definiert in Schritt 3.2.2 Geben Sie dann die Identifizierungsinformationen (zB Studienname, zeichnen Nummer, Besuch Nummer, Subjekt - ID) für jedes Rohr in der Arbeitsliste.
    4. Nach dem 15-min Äquilibrierungszeitraums, Wirbel Studie Proben und übertragen sie an die Durchflusszytometrie System Karussell nach der Reihenfolge auf der Arbeitsliste. Legen Sie dann das Karussell in der Probenkammer und klicken Sie auf die Cytometer Toolbar Schaltfläche "Start" Daten für die Studie Proben zu erwerben.
    5. Überprüfen Sie die Qualität der Daten, die durch die RBC-Lyse Effizienz Inspektion und den WBC-Zellenuntergruppe Verteilung, Proportionen, absolute Zahlen und Fluoreszenzintensitäten auf dem Berichtstafel jeder Probe.
      HINWEIS: Die Datenqualität akzeptabel angesehen wird, wenn alle diese Kriterien innerhalb ihrer vorgegebenen Grenzen liegen. Wenn alle Kriterien nicht erfüllt sind, sollten Probe weiterverarbeitet werden.
    6. Sauber und schloß die Durchflusszytometrie System herunter. Lagern Sie die DurchflusszytometrieDaten auf zwei verschiedenen Computer-Laufwerke versehentlichen Datenverlust zu verhindern.

4. Datenanalyse

  1. Führen Sie die Phagozytose Analyse.
    1. Konsolidieren Sie alle der Phagozytose (dh F-markiert) Proben- und Kontrolllistenmodus Daten (LMD) Daten - Dateien in einem einzigen Ordner. Öffnen Sie dann die Durchflusszytometrie-Analyse-Software und ziehen Sie die Dateien in den Probenraum.
    2. Stellen Sie den WBC, Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten-Tore.
      1. Doppelklick auf den Dateinamen einen der "FITC Kontrollproben" zu öffnen. Verwenden Sie die Dropdown-Menüs, um den x-Achse "FSC" und "linear" und die y-Achse auf "SSC" und "linear".
      2. Verwenden Sie die "Polygon-Gate-Selektor", um ein Tor der gesamten WBC-Population vorzubereiten.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Zellen an den Rändern des Diagramms aufzunehmen. Beschriften Sie dieses Tor "WBC".
      3. Doppelklicken Sie auf den "neuen WBC-Gate" und verwenden Sie das Drop-Down-Menüs die x-Achse zu "FSC" und "Linear" und die y-Achse auf "SSC" und "Linear" zu setzen.
      4. Verwenden Sie die "Polygon-Gate-Selektor", um den "Granulozyten-Gate" und die Monocyten-Schranke ", und verwenden Sie dann den" Ellipsen Tor Selektor Lymphocyte Tor ", um die zu setzen." "Beschriften Sie jedes Tor entsprechend an. Ziehen Sie die" Gate-Daten (%) "an der Seite, so daß die Zellen leicht betrachtet.
    3. Stellen Sie die "Phagozytose Positive Tor" und das "Phagozytose Negative Tor" für die Granulozyten und Monozyten-Populationen.
      1. Doppelklicken Sie auf die "FITC Kontrollprobe" in Schritt 4.1.2.1 verwendet. Dann klicken Sie auf den "Granulozyten-Gate" und verwenden Sie die Dropdown-Menüs, um die x-Achse zu "FL1" und "Log" zu setzen und die y-Achse auf "SSC" und "Linear".
      2. Verwenden Sie das "Quadrat-Gate-Selektor", um ein "Phagozytose Negative Tor" und eine "Phagozytose Positive Tor ".
        Hinweis: Da der FITC Kontrollproben nicht bakterielle (dh S. aureus) Stimuli erhalten haben, alle Zellen theoretisch Phagozytose negativ sein sollte. Verwenden Ermessen, wenn die Grenzen für diese Bevölkerungsgruppen zu etablieren.
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.1.3.1 und 4.1.3.2 Schritt für die Monocytenpopulation.
    4. In Statistiken für "% der WBC", "Fluoreszenzintensität" und "% Phagozytose positiven Zellen" für die Granulozyten und Monozyten-Populationen.
      1. Klicken Sie auf das "FITC Kontrollprobe", die in Schritt 4.1.2.1. Markieren Sie die "Granulozyten-Tor", und klicken Sie dann auf "Arbeitsplatz" und "Add Statistik". Markieren Sie "Geometrisches Mittel" und "FL1 Log" und klicken Sie auf "Hinzufügen". Dann entschied sich für die "Häufigkeit der Parent" Statistik und klicken Sie auf "Hinzufügen".
        Hinweis: Dies wird die Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel) der gesamten Granulozytenpopulation geben undder Anteil der WBC (Eltern), die Granulozyten sind.
      2. Klicken Sie auf das "FITC Kontrollprobe", die in Schritt 4.1.2.1. Markieren Sie das "Phagozytose Positive Tor" der Granulozyten-Population, und klicken Sie dann auf "Arbeitsplatz" und "Add Statistik". Markieren Sie "Geometrisches Mittel" und "FL1 Log" und klicken Sie auf "Hinzufügen". Dann wählen Sie die "Häufigkeit der Parent" Statistik und klicken Sie auf "Hinzufügen".
        Hinweis: Dies wird die Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel) der Phagozytose positiven Granulozyten und den Prozentsatz der Granulozyten geben (Eltern), die Phagozytose positiv sind.
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.1.4.1 und 4.1.4.2 Schritt für die Monocytenpopulation.
      4. Klicken Sie auf das "FITC Kontrollprobe", die in Schritt 4.1.2.1. Markieren Sie das "Lymphocyte Tor", und klicken Sie dann auf "Arbeitsplatz" und "Add Statistik". Markieren Sie die "Häufigkeit der Parent" Statistik und klicken Sie auf "Hinzufügen".
        HINWEIS: Diesegeben den Prozentsatz der WBC (Eltern), die Lymphozyten sind.
      5. Markieren Sie alle Tore und in der FITC Kontrollprobe verwendet erstellt Statistiken in Schritt 4.1.2.1. Ziehen Sie sie in "All Samples" in der "Gruppe" Panel am oberen Rand des Bildschirms.
        HINWEIS: Dadurch werden diese Einstellungen zu allen Studienproben anzuwenden.
      6. Speichern und Namen Arbeit als WSP-Datei in dem Ordner, der LMD-Ordner enthält.
    5. Passen Sie einzelne Proben Tore.
      1. Klicken Sie auf das "erste Probe" im Datensatz und bestätigen, dass die WBC-Gate die Zellverteilung auf dem Bildschirm entsprechend passt. Wenn es nicht, klicken Sie auf und ziehen Sie die Ränder des Gate einstellen das Tor für diese Probe. Klicken Sie auf den "Pfeil nach rechts" (dh "˃") , um die nächste Probe zu wechseln . Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Proben wurden überprüft.
      2. Klicken Sie auf den "WBC-Tor" für die erste Probe in dem Datensatz und bestätigen, dass die "Granulocyte Tor "," Monozyt Tor "und" Lymphocyte Tor "für jede Probe in geeigneter Weise die Zellverteilung auf dem Bildschirm passen. nach Bedarf anpassen. Klicken Sie auf den" Pfeil nach rechts "(dh" ˃ ") , um die nächste Probe voran .
      3. Wiederholen Sie Schritt 4.1.5.2, bis alle Proben wurden überprüft. Klicken Sie dann auf "Speichern".
    6. Zeigen Sie die Daten in einem elektronischen Tabellenkalkulationsprogramm.
      1. Klicken Sie auf das "Table Editor" Symbol am oberen Rand des Bildschirms. Klicken Sie auf "Bearbeiten", "Schlüsselwörter" und "$ DATE", um das Datum der Probenahme auf dem letzten Tabellen enthalten. Klicken Sie dann auf "Bearbeiten", "Keywords" und "@ SAMPLEID1", um die Sampling-Identifikation auf dem letzten Tabellen enthalten. Wiederholen Sie dies für "@ SAMPLEID2", "@ SAMPLEID3" und "@ SAMPLEID4".
      2. Stellen Sie die "Table Editor" Bildschirm und die "Probe" Bildschirm, so dass sie beide können auf dem Computerbildschirm angezeigt werden. Select jede "Probe" auf dem Musterblatt. Ziehen Sie dann jede Statistik von Interesse für den "Table Editor".
        1. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgelistet unter dem "Granulozyten-Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% WBC als Granulozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        2. Ziehen Sie das "Geometrisches Mittel" Statistik aufgelistet unter dem "Granulozyten-Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "Geometrisches Mittel Fluoreszenz, Granulozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        3. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgelistet unter dem "Granulozyten / Phagozytose Positive Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% Phagozytose Positive Granulozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        4. Ziehen Sie das "Geometrisches Mittel" Statistik aufgelistet unter dem "Granulozyten / Phagozytose Positive Tor" zu the "Table Editor". Geben Sie "Geometrisches Mittel Fluoreszenz, Phagozytose Positive Granulozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        5. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgelistet unter dem "Monozyt Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% WBC als Monozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        6. Ziehen Sie das "Geometrisches Mittel" Statistik aufgelistet unter dem "Monozyt Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "Geometrisches Mittel Fluoreszenz, Monozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        7. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgeführt im Rahmen der "Monozyt / Phagozytose Positive Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% Phagozytose Positive Monozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
        8. Ziehen Sie das "Geometrisches Mittel" Statistik aufgelistet unter dem "Monozyten / Phagocytose Positive Tor "zum" Table Editor ". Geben Sie" Geometrisches Mittel Fluoreszenz, Phagozytose Positive Monozyten "unter der Spalte" Name "des" Table Editor ".
        9. Ziehen Sie den "Freq. Von Parent" Statistik aufgelistet unter dem "Lymphocyte Tor" zum "Table Editor". Geben Sie "% WBC als Lymphozyten" unter der Spalte "Name" des "Table Editor".
      3. Drag & Drop die Parameter sichtbar in der "Table Editor", bis sie in der bevorzugten Reihenfolge angeordnet sind.
      4. Klicken Sie auf "Speichern". Klicken Sie dann auf "Create Table", um die Daten in einem Tabellenformat anzeigen. Klicken Sie auf "Speichern unter" zu speichern und zu benennen Arbeit als .xlsx-Datei.
  2. Wiederholen Sie Schritt 4.1 für die OB - Aktivitätstest (dh H-markiert) Proben und LMD-Dateien steuern.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Verweise auf die Phagozytose mit Verweisen auf OB-Aktivität zu ersetzen.

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Ergebnisse

Längerer und intensive Übung hat profunde Auswirkungen auf die angeborene Immunfunktion, einschließlich der natürlichen Killerzellen-Funktion, Makrophagen-Zytokin-vermittelten Immunantwort auf virale Infektionen und Granulozyten und Monozyten Phagozytose und OB-Aktivität. Mehrere Studien zeigen, dass Granulozyten und Monozyten Phagozytose steigt deutlich nach dem Training, um die Entzündung durch Muskelschäden und metabolischen Anforderungen induziert widerspiegelt. Im Gegensatz dazu Gra...

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Diskussion

Diese Handschrift stellt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung von zwei Indikatoren von Granulocyten und Monocyten-Funktion. Wir haben einige Schritte identifiziert, die für den Erfolg dieses Tests sind entscheidend. Ein solcher Schritt ist das Eisbad Inkubation, die Zugabe von Bakterien unmittelbar vor auftritt. Gründliches Kühlen aller Proben wird die Wirkung der Temperatur auf die Phagozytose und OB-Aktivität minimieren. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Zugabe von Bakterien zu jeder Probe. A 8: ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten sich Zack Shue, Casey John und Lynn Cialdella-Kam für ihre Unterstützung bei der Optimierung dieses Verfahrens zu bestätigen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12 x 75 mm Röhrchen, mit KappeVWR20170-579Sie benötigen 2 Röhrchen pro Probe ("H" und "F") plus 3 Röhrchen pro Charge (für Assay-Kontrollen; "F", "H" und "Nur Blut").
PBS (10x), pH 7,4Life Technologies70011-044
Flaschenverschluss 0,2 & Mikro; m Celluloseacetat-Filter (500 ml Fassungsvermögen)Fisher Scientific09-741-07 
Glukose, PulverLife Technologies15023-021
Zitronensäure (wasserfrei, Zellkultur getestet, Pflanzenzellkultur getestet)Sigma-AldrichC2404-100G
Natriumcitrat dreibasisches DihydratSigma-AldrichS4641-25G
Dihydroethidium (Hydroethidin) (HE)Life TechnologiesD11347
Dimethyl Sulfoxid (DMSO) wasserfreiLife TechnologiesD12345
Staphylococcus aureus ( Holzstamm ohne Protein A) BioPartikel, Fluorescein-Konjugat (FITC)Life TechnologiesS2851
Staphylococcus aureus ( Holzstamm ohne Protein A) BioParticles, unmarkiertLife TechnologiesS-2859
Trypan Blue Solution, 0,4%Life Technologies15250-061
4,0 ml Vacutainer mit 7,2 mg K2EDTA, sprühgetrocknetVWRBD367861Sie benötigen 1 K2EDTA Blutentnahmeröhrchen pro Probe.
4,0 ml Vacutainer mit 68 USP-Einheiten Lithium-Heparin, sprühbeschichtetVWRBD367884Pro Probe benötigen Sie 1 Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen.
SCHAR AC· T 5diff CPBeckman Coulter6605705i.d., Hämatologie-Analysator
COULTER Ac· T 5diff SpülungBeckman Schar8547167
Schar Ac· T 5diff FixBeckman Coulter8547171
COULTER Ac· T 5diff WBC LyseBeckman Coulter8547170
COULTER Ac· T 5diff Hgb LyseBeckman Coulter8547168
COULTER Ac· T 5diff Cal CalibratorBeckman Coulter7547175
COULTER Ac· T 5diff Control PlusBeckman Schar7547198
AcT 5diff VerdünnungsmittelBeckman Schar8547169
200 µ l verlängerte PipettenspitzenVWR37001-526
Isolierte EiswanneVWR89198-980Für Eiswasserbad.
Offenes Röhrchengestell aus MetallVWR60916-702
Fötales RinderserumLife Technologies26140-111
TQ-Prep WorkstationBeckman Coulter6605429i.e., automatisierte Workstation zur Vorbereitung der Zelllyse
ImmunoPrep ReagenziensystemBeckman Coulter7546999i.d., RBC-Lyse/WBC-Fixreagenzsystem
Cytomics FC500 MCL Durchflusszytometrie-System mit CXP-SoftwareBeckman Coulter626553
IsoFlow Swrap FluidBeckman Coulter8547008
COULTER CLENZBeckman Coulter8546929
Flow-Check Fluorosphären Beckman Coulter6605359i.e., Ausrichtung und Fluidik Verifikation von Fluorosphären
FlowJo SoftwareFlowJo FlowJoi.e., Software für die Durchflusszytometrie-Analyse
Excel SoftwareMicrosoftMicrosoft Exceli.e., elektronisches Tabellenkalkulationsprogramm

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Granulozyten PhagozytoseDurchflusszytometrieVollblut AssayStaphylococcus aureusFITC markierte BakterienDihydroethidiumTrypanblau QuenchingBlutzelllyse
Mess Granulozyten und Monozyten Phagozytose und oxidativer Burst-Aktivität im menschlichen Blut
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