Hier präsentieren wir ein robustes, schnelles und skalierbares Protokoll zur Differenzierung von Kardiomyozyten für humane pluripotente Stammzellen (hPSCs). Kardiomyozyten, die mit dieser groß angelegten Methode gewonnen werden, können eine ausreichende Zellzahl für ihren effektiven Einsatz bei der Modellierung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen beim Menschen, beim Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und möglicherweise in klinischen Anwendungen liefern.
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Methodenartikel
Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Maximierung der Nutzen der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) für Forschung, Krankheitsmodelle, pharmazeutische und klinische Anwendungen erfordert robuste Verfahren für die großtechnische Produktion von funktionellen Zelltypen, einschließlich Kardiomyozyten. Hier zeigen wir, dass die zeitliche Manipulation von WNT, TGF-β und SHH-Signalwege führt zu einer hocheffizienten cardiomyocyte Differenzierung von Einzelzell-passagierten HPSC Linien in sowohl statische Suspension und gerührten Suspension Bioreaktorsysteme. Bei Anwendung dieser Strategie führte zu ~ 100% schlagen Sphäroiden, konsequent mit> 80% kardiales Troponin T-positiven Zellen nach 15 Tagen der Kultur, validiert in mehreren HPSC Linien. Wir berichten auch auf eine Variante dieses Protokolls für die Verwendung mit Zelllinien derzeit nicht Passagierung Einzelzell angepasst, deren Erfolg in 42 HPSC Linien überprüft wurde. erzeugt Kardiomyozyten mit Hilfe dieser Protokolle ausdrücken linienspezifischen Markern und Show erwartet electrophysiologische Funktionalitäten. Unser Protokoll stellt eine einfache, effiziente und robuste Plattform für die großtechnische Produktion von humanen Kardiomyozyten.
Einleitung
Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierte pluripotenter Stammzellen (hiPSCs), haben die Fähigkeit der Selbsterneuerung und die Fähigkeit , in Zellen der drei embryonalen Keimschichten 1,2 zu differenzieren. Aufgrund dieser Eigenschaften bieten hPSCs eine wertvolle und unbegrenzte Quelle für die Erzeugung und skalierbare Produktion von krankheitsrelevanten Zelltypen für die menschliche Krankheit Modellierung 3-5, für Hochdurchsatz - Wirkstoff - Screening und Toxizitätsassays 6,7 und potenziell für klinische Anwendungen 8 . Die Erzeugung von Kardiomyozy....
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Protokoll
1. Herstellung von Kulturmedien, Beschichtung von Zellkulturplatten und Wartung von Undifferenzierte hPSCs
- Nährmedienzubereitung
Hinweis: Sterilisieren Medien eine 0,22 um Filtrationsvorrichtung und lagern bei 4 ° C lichtgeschützt mit bis zu 4 Wochen. Reagenz Namen, Lieferanten und Katalognummern sind in der Material Tabelle aufgeführt.- Für Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Medium vereinen 445 ml DMEM, 50 ml Fetal Bovine Serum (FBS) und 5 ml Zellkulturmedium (zB Glutamax).
- Für hESC Medium, kombinieren 390 ml Knockout-DMEM (KO-DMEM), 100 ml Knockout Serumersatz (KO-SR), 5 ....
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Ergebnisse
Um eine einfache Methode für die groß angelegte Differenzierung von Kardiomyozyten aus hPSCs zu etablieren, haben wir ein Protokoll , in dem Zellen zunächst mit einem WNT / β-Catenin - Aktivator (CHIR99021) 16 und anschließend mit Inhibitoren der WNT behandelt wurden / β- Catenin und transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) Bahnen (IWP2 16 und SB431542 17, jeweils) und schließlich ein Aktivator des sonic hedgehog (SHH) -Weg (purmorphamine) 17
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Diskussion
Kardiomyozyten aus hPSCs abgeleitet sind eine äußerst attraktive Quelle für den Einsatz in der menschlichen Krankheit Modellierung, Wirkstoff-Screening / Toxizitätstests und vielleicht in der Zukunft, regenerative Therapien. Eine der Haupthürden, um diese Zellen jedoch verwendet wird, ist die Fähigkeit, genug hochwertigem Material für ihre wirksame Verwendung zur Verfügung zu stellen. Mit unserem beschriebenen Protokoll, bieten wir eine Methode, die diese Beschränkung überwindet.
Vor kurzem .......
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Offenlegungen
Das Victor Chang Cardiac Research Institute beteiligt sich nicht an, noch duldet es, die Zerstörung menschlicher Embryonen für die Forschung. Sein Beitrag zu dieser Studie beschränkte sich auf die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen zu arbeiten.
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Royan Institute, des Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, der Iran National Science Foundation (INSF), des National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), der National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629) und des New South Wales Cardiovascular Research Network finanziert. HF wurde durch ein University International Postgraduate Scholarship der University of New South Wales, Australien, unterstützt. RPH wurde durch ein NHMRC Australia Fellowship unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei den Menschen, die an dieser Forschung teilgenommen haben.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Knockout | DMEM Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Ersatz (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Nicht-essentielle Aminosäuren | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, kein Calcium, kein Magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Tödliches Rinderserum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus Insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0,05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Kollagenase Typ IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calciumchlorid (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamin | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Polyvinylalkohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypanblau | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinnerkolben mit 1 Pendel, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Embryonale Fibroblasten der Maus (MEF) | Inhouse hergestellt (oder kommerziell erhältlich) | ||
| Humane pluripotente Stammzelllinien (hPSC) | Inhouse hergestellt (oder kommerziell erhältlich) |
Referenzen
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (200....
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Nachdrucke und Genehmigungen
