Methodenartikel

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

DOI:

10.3791/54281

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25. Dezember 2016

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1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoff-Transfertechnik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanäle misst. Gap junctions interzelluläre Kommunikation ist ein wichtiger zellulärer Prozess, durch den Gewebe-Homöostase aufrechterhalten wird und die Unterbrechung dieser Zellsignalisierung hat negative Auswirkungen auf die Gesundheit.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt ein Skalpell Laden-Fluoreszenzfarbstoffübertragung (SL-DT) Technik, die interzelluläre Kommunikation über Gap Junction Kanälen misst, das ein wichtiger interzellulären Prozess, durch den Gewebshomöostase gehalten wird. Unterbrechung der interzellulären Gap Junction - Kommunikation (GJIC) durch Noxen, Toxine, Drogen usw. zu zahlreichen negativen Auswirkungen auf die Gesundheit in Verbindung gebracht worden. Viele genetisch-bedingte Krankheiten wurden Mutationen in Gap Junction-Genen verbunden. Die SL-DT-Technik ist eine einfache Funktionstest für die simultane Beurteilung der GJIC in einer großen Population von Zellen. Der Assay beinhaltet Vorbelastung Zellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff kurz mit einer Skalpellklinge durch eine Population von Zellen, die Zellmembran gestört. Der Fluoreszenzfarbstoff wird dann für eine bestimmte Zeit zu benachbarten Zellen zu durchqueren, durch gap junction Kanäle erlaubt. Der Assay wird dann durch Zugabe von Formalin zu den Zellen beendet. Die Ausbreitung der Fluorescent Farbstoff durch eine Population von Zellen mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop beurteilt und die Bilder werden mit einer beliebigen Anzahl von morphologisch Softwarepakete analysiert, die verfügbar sind, einschließlich Pakete freie Software auf dem öffentlichen Bereich gefunden. Dieser Test wurde auch für in vivo - Studien unter Verwendung von Gewebeschnitten aus verschiedenen Organen von behandelten Tieren angepasst. Insgesamt kann der SL-DT - Test eine breite Palette von in - vitro - pharmakologischen und toxikologischen Bedürfnisse dienen, und kann möglicherweise für einen hohen Durchsatz Set-up - Systeme mit automatisierten Fluoreszenzmikroskopie Bildgebung und Analyse angepasst werden , um mehr Proben in kürzerer Zeit aufzuklären.

Einleitung

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Das Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache, umfassende und relativ kostengünstige Technik bereitzustellen, die potentiellen Toxizitäten von Verbindungen zu bewerten. Dies ist ein in vitro - Ansatz , die in mehreren Zelllinien verwendet werden kann. Standard-Zellbiologie Labors ausgestattet mit Epifluoreszenz Mikroskope können die Forschung mit diesen Test durchführen.

Unsere Grundkenntnisse in der Zellfunktionen hat sich auf in - vitro - Biotests stark abhängig gewesen und hat eine wesentliche Komponente in die toxikologische Bewertung von Arzneimitteln, Umweltschadstoffe und Essen geboren Verunreinigungen....

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Protokoll

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Das Protokoll für diese Studie wurde von der Animal Care and Utilization Ausschuss der National Institutes of Health Sciences of Japan zugelassen , was ist , wo die in - vivo - Experimente durchgeführt wurden, um sicherzustellen , dass die Ratten auf humane Weise und mit Bezug zur Linderung des Leidens behandelt wurden.

1. SL-DT Bioassay

  1. Seed 3 x 10 5 WB-F344 Rattenleber - Epithelzellen auf 35 mm Durchmesser - Kulturplatten Eagles enthaltend modifiziertes Medium plus 5% fötalem Rinderserum, und Kultur der Zellen in einem Inkubator bei 37 ºC, 100% relative Luftfeuchtigkeit (RH), 5% CO 2.
  2. Kultur die Z....

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Ergebnisse

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Unterbrechung der GJIC wurde als Biomarker zur Identifizierung von toxischen Verbindungen in der nicht genotoxisch, epigenetischer Ebene der Gen - Steuerung , die induziert schädliche Auswirkungen auf die Gesundheit 14 ausgiebig genutzt. Zum Beispiel sind polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAHs) ubiquitär Verunreinigungen der Umwelt , sondern unterscheiden sich in ihrer epigenetischen Toxizitäten als Funktion ihrer molekularen Strukturen 15. Die mit niedr.......

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Diskussion

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Der SL-DT-Test ist eine einfache und vielseitige Technik in GJIC messen, aber es gibt mehrere kritische Bedenken, die berücksichtigt werden sollten geeignete experimentelle Protokolle in der Gestaltung. Für robuste Messungen von GJIC die SL-DT-Test dort verwendet, muss eine gute Farbstoff Ausbreitung des LY durch gap junctions der Zellen sein. Zumindest sollte eine ausreichende Zeit, um sicherzustellen, gewählt werden, dass der Farbstoff breitet sich durch acht oder mehrere Reihen von Zellen aus den Skalpell beladenen Z.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Unterstützt durch NIEHS-Zuschüsse #R01 ES013268-01A2, und der Inhalt liegt allein in der Verantwortung des Autors und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung des NIEHS dar, und unterstützt von CETOCOEN UPgrade Projekt-Nr. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
WB-F344 Rattenleber-Epithelzellenvon Drs. J. W. Grisham und M. S. Tsao von der University of North Carolina (Chapel Hill, NC)keinezur Verfügung gestellt von Dr. J. W. Grisham und M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC
35 mm KulturplattenCorning430165
25 cm2 KulturflaschenCorning430639
75 cm2 KulturflaschenCorning430641
D-medium, ein von Eagles modifiziertes Medium ThermoFisher/GIBCO Formel Nr. 78-5470EF
fötales RinderserumThermoFisher/GIBCO 10437
0,25% Trypsin-EDTA ThermoFisher/GIBCO 15050
phosphatgepufferte Kochsalzlösunghausgemacht, siehe unten für die Zutat Cat#'s137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO><4
KClJT Baker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT Bäcker - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt 3246-01
Luzifer Gelb CH, LithiumsalzSigma-Aldrich ChemikalieL0259
Rhodamin-DextranSigma-Aldrich ChemikalieR9379
1-MethylanthracenSigma-Aldrich Chemikalie
PhenanthrenSigma-Aldrich ChemikalieP11409
ResveratrolSigma-Aldrich ChemikalieR5010
D609Tocris Bioscience 1437
AcetonitrilEMDAX0145-1
37%ige Lösung FormaldehydJT Baker - Mallinckrodt 2106-01
#20 chirurgische KlingeFine Science Tools Inc. 10317-14
50 ml konische sterile RöhrchenThermo scientific 
Nikon Epifluoreszenzmikroskop Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC dichroitischer WürfelNikon -Mager Scientific96107
CCD-KameraNikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ CCD-Bildgebungssystem
Nikon -Mager ScientificNikon NIS-Elements F2.2 Bildgebungssystem.
ImageJNationales Institut für Gesundheithttp://imagej.nih.gov/ij/
339652

Referenzen

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  1. Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
  2. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Gap Junctional Intercellular CommunicationScalpel Loading Fluorescent Dye TransferLucifer Yellow Dye TransferEpifluorescence MicroscopyPhenanthrene Toxicity AssayCell Membrane PerturbationDye Migration AnalysisToxicant Effects AssessmentIn Vitro ToxicologyFunctional Biomarker Assay

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