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Methodenartikel

Patch-Clamp-Aufnahmen auf Intact Dorsalwurzelganglien von erwachsenen Ratten

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DOI:

10.3791/54287

⸱

29. September 2016

 ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University of California, San Francisco, 2Department of Anatomy, University of California, San Francisco

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt, wie man intakte dorsale Wurzelganglien für Patch-Clamp-Aufnahmen vorbereitet. Dieses Präparat erhält die Mikroumgebung für Neuronen und Satelliten-Gliazellen aufrecht und vermeidet so die phänotypischen und funktionellen Veränderungen, die bei dissoziierten DRG-Neuronen beobachtet werden.

Zusammenfassung

Patch-Clamp-Studien von Dorsalwurzelganglien (DRGs) Neuronen haben unser Verständnis des peripheren Nervensystems erhöht. Derzeit sind die meisten Aufzeichnungen auf dissoziierten DRG Neuronen durchgeführt, die ein Standardpräparat für die meisten Laboratorien ist. Neuronal Eigenschaften können jedoch durch axonalen Schädigung geändert werden, die durch Enzymverdauung verwendet in dissoziierten Neuronen zu erwerben. Weiterhin kann distanzierte Neuron Präparate nicht vollständig die Mikroumgebung der DRG dar, da Kontaktverlust mit Satelliten-Glia-Zellen, die die primären sensorischen Neuronen ist eine unvermeidliche Folge dieses Verfahrens umgeben. Um die Einschränkungen bei der Verwendung herkömmlicher distanzierte DRG - Neuronen für Patch - Clamp - Aufnahmen zu überwinden, die in diesem Bericht beschreiben wir eine Methode , um intakte DRGs vorzubereiten und Patch - Clamp - Aufnahmen auf einzelnen primären sensorischen Neuronen ex vivo durchzuführen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle und unkomplizierte Herstellung von intakten DRGs, imitiert invivo - Bedingungen von DRG - Neuronen im Zusammenhang mit der sie umgebenden Satelliten Gliazellen und Basalmembran zu halten. Weiterhin vermeidet das Verfahren vor Manipulation axonale Verletzung und Enzymverdau wie bei DRGs dissoziierenden. Diese ex vivo Herstellung kann zusätzlich verwendet werden , um die Interaktion zwischen primären sensorischen Neuronen und Satelliten - Gliazellen zu studieren.

Einleitung

Sensation ist von wesentlicher Bedeutung für einen Organismus für das Überleben und Wohlbefinden. Die Übertragung der Impulse ist abhängig von der sensorischen Bahnen an peripheren Enden der Axone von primären sensorischen Neuronen beginnen. Primären sensorischen Neuronen, mit Ausnahme des Nucleus mesencephalicus des Trigeminus, sind in der Trigeminalganglien und Dorsalwurzelganglien (DRGs) gelegen. Sie dienen als Torwächter der sensorischen Informationen 1. Am perikarial Membran, wie in den zentralen und peripheren Terminals, exprimieren DRG Neuronen Rezeptoren und Ionenkanäle, wie Glutamat - Rezeptoren, TNF alpha - Rezeptoren transient receptor potential Kationenkanal - Unterfamilie V Element 1 (TRPV1), Natriumkanäle, etc. 2 -7. Patch-Clamp-Aufnahmen der perikarial Membran erlauben Verständnis funktionelle Veränderungen vieler dieser Rezeptoren und Kanäle während des Neurons.

Die Patch-Clamp-Aufnahmetechnik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für studie Aktivitäten der Kanäle oder Rezeptoren , und eine große Anzahl von Studien haben zu sterben durch die Anwendung dieser Technik auf DRG - Neuronen 8-10 durchgeführt. In den meisten Studien wird die DRG durch Schneiden der dorsalen Würzelchen und Spinalnerven der Nähe des Ganglion entfernt. Nach dem Zerkleinern wird das Ganglion dann in Verdauungsenzyme gelegt, die in Dissoziation der DRG-Neuronen führen, die dann sofort aufgezeichnet werden können oder kultiviert für mehrere Tage vor der Aufzeichnung. Leider beinhaltet die Dissoziation von DRG-Neuronen eine notwendige Axotomie der Nähe des Perikarya. Sobald dissoziiert und axotomisierten unterliegen DRG Neuronen phänotypischen Veränderungen sowie Änderungen in Membran Erregbarkeit 11,12. Der Kontaktverlust zwischen dem Perikarya von einzelnen Neuronen und die Satelliten Gliazellen , die normalerweise sie umgeben ist wahrscheinlich auf diese Veränderungen 13 beizutragen. Das Übersprechen zwischen den Neuronen und Gliazellen Satelliten ist sowohl wesentlich unter physiologischen Bedingungen und in Anpassung an Pathologschen Bedingungen , wie sie auf hartnäckigen Schmerzen 14,15 führen. Es wäre eine Herausforderung, die Interaktion zwischen den Neuronen und Satelliten-Gliazellen zu studieren, um ein dissoziierten DRG Vorbereitung.

Intact DRGs, andererseits bieten näher an in vivo - Bedingungen. In den vergangenen Jahren hat sich unser Labor, sowie einige andere Gruppen, hat sich von erwachsenen Ratten intakt DRGs wurden unter Verwendung von Änderungen der primären sensorischen Neuronen unter verschiedenen Bedingungen mit chronischen Schmerzen 3-5,11,15-17 assoziiert zu untersuchen. Obwohl die in diesen Studien verwendeten Techniken etwas etabliert sind, ein Schritt-für-Schritt-Beschreibung noch nicht veröffentlicht wurde. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir eine bequeme und schnelle Art und Weise intakt DRGs und ihre Verwendung für Patch-Clamp-Aufnahmen vorzubereiten.

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Protokoll

Ethik-Statement: Alle Verfahren für die Erhaltung und Nutzung der Versuchstiere entsprachen den Vorschriften der UCSF Ausschüsse für Tierforschung und wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der NIH Regelungen für Tier Verwendung und Pflege (Veröffentlichung 85 durchgeführt - 23, 1996 überarbeitet ). Die UCSF Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt die in dieser Studie verwendeten Protokolle.

1. Herstellung von Instrumenten, Lösungen und Geschirr

  1. Bereiten Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF).
    1. Bereiten 500 ml 10fach niedriger Kationenlösung und 500 ml 10x Bicarbonatlösung (siehe Tabelle 1 und 2 für die Herstellung der Lösung). Lagerung bei 4 ° C und Verwendung innerhalb eines Monats.
    2. Bereiten 600 ml frischem aCSF mit 60 ml 10fach niedriger Kationenlösung mit 60 ml Bicarbonat-Lösung vermischt und fügen Sie dann 480 ml deionisiertes Wasser auf ein Endvolumen von 600 ml zu erreichen. Blase die aCSF mit Carbogen(5% O 2 und 95% CO 2) für mindestens 10 min vor der Verwendung.
  2. Ziehen Sie Patch-Pipette aus Kapillar-Glas.
    1. Legen Sie dünnwandige Kapillare Glas in eine Pipette Abzieher, um die Aufnahme Pipetten vorzubereiten.
      Hinweis: In unserem Labor werden die folgenden Einstellparameter des Puller verwendet werden, um die ideale Pipettenform zu erreichen: Wärme (510), Geschwindigkeit (32). Die ideale Form für Pipetten intakte DRG Aufnahme sollte eine graduelle schlanken Verjüngung mit einem geringen Konuswinkel haben, und dies kann am besten durch Versuch und Irrtum erreicht werden.
    2. Stellen Sie sicher , dass der Widerstand der Pipette 3-5 MOhm ist , wenn sie mit internen Lösungen gefüllt (siehe Tabelle 3 für Lösung Vorbereitung). Bitte beachten Sie Axon Leitfaden für die detaillierte Verfahren zur Messung von 18 Pipette Widerstand.
  3. 1 mg Kollagenase zu 400 ul aCSF, um eine Endkonzentration von 13 Einheiten / ml zu ergeben. Dann füllen Sie jede Glaspipette mit etwa 20 ul Kollagenase-Lösung. Geschäftdie gefüllten Pipetten in einem C - Gefrierschrank -20 o und innerhalb von drei Wochen.
  4. Bereiten 200 ml kaltem aCSF (etwa 4 o C). Um die aCSF kühlen sie schnell platzieren in einen Becher, versiegeln Sie mit Plastikverpackung und in einem -20 ° C Gefrierschrank für etwa 20 Minuten , bis es zu gefrieren beginnt. Das Becherglas in einem Eisbad und Blase mit Carbogen für 10 min. Blase die restlichen 400 ml aCSF mit Carbogen bei RT.
  5. Während die aCSF abkühlt, schneiden Sie das Ende einer Kunststoff-Einweg-Transferpipette um die Öffnung zu einem Durchmesser von 5 mm zu vergrößern (das verwendet wird, um die DRG zu übertragen). Sammeln Sie die folgende chirurgische Instrumente: Skalpell (# 15), Mayo geraden und gebogenen Schere, fein 2 mm Spitze rongeur, Adson (Zahn) Zange, Iris Schere, Feder Schere und zwei feinen Pinzette. Gießen Sie das mit Sauerstoff angereicherte Kälte aCSF in 3 Petrischalen aus Glas (Außendurchmesser: 10 cm).

2. DRG Dissection

  1. Anesthetize eine Ratte (200-220 g) mit Natrium pentobarbital (100 mg / kg, ip) und bestätigen, dass das Niveau der Anästhesie durch Pedal Prüfung Reflex und Augen Lidschlussreflexes ausreichend ist.
  2. Nach Überprüfung, dass die Ratte betäubt, rasieren den Lendenbereich und einschneiden die Haut und das Unterhautgewebe entlang der Mittellinie. Lösen Sie die paraspinale Muskeln von den Dornfortsätzen an der L1-S2-Ebene ein feines Periostelevatorium verwenden.
  3. Verwenden einer gebogenen Schere die Dornfortsätze von L1 bis S2 zu schneiden. Verwenden Sie gerade Mayo Schere Querschnitte in der exponierten Wirbelsäule bei etwa L1 und S1 und entfernen Sie dieses Segment der Wirbelsäule en bloc zu machen und es schnell untertauchen in kaltes aCSF (hergestellt in Schritt 1.5) für 2-3 min. Nach dem Entfernen der lumbalen DRGs wird Euthanasie durch bilaterale Thorakotomie durchgeführt, während die Ratte noch im tiefen Pentobarbitalbetäubung ist.
  4. Spülen Sie weg das Blut aus der entfernten Wirbelsäule und an Gewebe und übertragen in eine Petrischale mit kaltem aCSF. Use eine feine rongeur die Schichten zu entfernen. Schneiden Sie die Dura mater entlang der Mittellinie mit Mikroschere das Rückenmark zu belichten. Heben Sie vorsichtig das Rückenmark, und schneiden Sie die Nervenwurzeln an ihrem Eintrittspunkt im Rückenmark Iris Schere, entfernen Sie dann das Rückenmark.
  5. Übertragen Sie die verbleibende Wirbel mit DRGs auf die zweite Petrischale mit kaltem aCSF gefüllt. Identifizieren Sie die L4 und L5 DRGs auf der Grundlage ihrer relativen Position zu Querfortsätze und Ischiasnerv.
    Hinweis: Um den Ischiasnerv Aufrechterhaltung intakt helfen L4 und L5 DRG (der Ischiasnerv aus dem L4-6 Spinalnerven stammt) zu identifizieren.
  6. Verwenden Dumont Pinzetten und Scheren Noyes die DRGs von den umgebenden Bindegewebe zu befreien. Halten Sie die Nervenwurzel und Spinalnerven zu den DRGs angebracht.
  7. Verwenden Sie die Transferpipette die DRGs in die dritte Petrischale für die weitere Zergliederung zu bewegen.
  8. Unter dem Präpariermikroskop vorsichtig entfernen, so viel wie möglich von der epineurium umgebenden the DRG.
    1. Verwenden Sie die Noyes Feder Schere um eine Öffnung zu schneiden, wo die dorsalen und ventralen Wurzeln der DRG und trennen Sie die ventralen Wurzel aus der DRG verbinden. Verwenden Sie Dumont # 5 Pinzette mit stumpfen Spitzen der epineurium zu halten, und verwenden Sie einen anderen feinen Pinzette die DRG vom epineurium zu rollen.
    2. Weiter so viel wie möglich von epineurium an DRGs mit den feinen Pinzette zu entfernen.
      Hinweis: Ein gut seziert DRG ist wichtig, eine gute Verdauung im nächsten Schritt zu erhalten.

3. DRG Verdauung

  1. Übertragen Sie die DRG auf die Aufzeichnungskammer. Achten Sie auf die Seite der DRG, wo die Nervenwurzeln Gesichter nach unten stammen.
    Anmerkung: Auf diese Weise werden die meisten Neuronen zugänglich sind.
  2. Verwenden Sie einen Anker der DRG zu stabilisieren. Perfuse DRG mit oxygeniertem aCSF mit einer Rate von 0,5 ml / min durch Kunststoffrohre mit einer peristaltischen Pumpe verbunden, die auf das Aufzeichnungs rig nächsten auf einem Tisch platziert wird.
  3. Warten für 30 min die Zellen zu erlauben, sich zu erholen. Bewerten Sie die Qualität der DRG unter Infrarot-Differential-Schnittstelle Kontrast (IR-DIC) Optik bei 40facher Objektivvergrößerung durch eine CCD-Kamera.
    Hinweis: Gut DRGs in der Regel viele runde enthält, auch gegenüber, umgeben Neuronen, die durch Satelliten Gliazellen auf seiner Oberfläche.
  4. Digest einen kleinen Bereich der Oberfläche des DRG.
    Anmerkung: Die Glas Patch-Pipetten angeordnet sind, in Pipettenhalter, die kleine Kupplungen sind, die Schläuche erlauben, mit einer luftdichten Dichtung an der Glaspipette befestigt werden kann.
    1. verbinden Individuell zwei 1 ml Spritzen mit den Pipettenhalter durch zwei Stücke von kleinem Durchmesser Gummischlauch. Legen Sie eine Glaspipette mit Kollagenase in einer der Pipettenhalter und eine leere Glaspipette in die andere gefüllt.
    2. Verwenden Sie den Mikromanipulator die Pipetten knapp über dem DRG zu positionieren. Dann unter dem Mikroskop Vergrößerung, kollidieren die Spitzen von zwei Pipetten gegeneinander sanft die Öffnungen von Pipettenspitzen, um zu vergrößern (idealerweise einen Durchmesser von 5-10 & mgr; m).
    3. Bewegen Sie den mit Enzym gefüllten Pipette nahe an der Oberfläche von DRG und kurz positiven Druck auf die Pipette enthält Kollagenase durch das Rohr gelten den Halter und die Spritze verbindet durch den Kolben etwa 0,5 ml zu verschieben.
      Hinweis: Unter dem Druck wird der Fluss des Enzyms aus der Pipette leicht den Raum zwischen den DRG-Neuronen vergrößern, die als Zeichen für die Enzym-Anwendung dienen kann.
    4. Nach 10 bis 15 min, wenn Trümmer des verbleibenden Epineurium beobachtet wird, gelten sanfte Unterdruck auf die leere Pipetten den Schmutz abzusaugen.
      Hinweis: Auf diese Weise werden die Neuronen und die umliegenden Satelliten Gliazellen wird für die Patch-Aufnahme deutlich ausgesetzt und bereit sein.
    5. Entsorgen Sie die zwei Pipetten in den Behälter für spitze Gegenstände.

4. Patch-Clamp-Aufnahmen

  1. Platzieren Sie die Elektrodenlösung (siehe Tabelle 3) auf Eis Abbau zu verhindern. Füllen Sie das Glas Patch-Pipette mitgefiltert intrazelluläre Lösung (Spritzenfilter, Porengröße: 0,2 & mgr; m) und legen Sie die Pipette in der headsPipettenHalter. Anwenden eines sanften Überdruck auf der Pipette durch eine 5 ml-Spritze durch den Kolben etwa 1 ml Verlagern vor der Pipette in Badlösung abgesenkt wird.
    Hinweis: Dies verhindert, dass die Pipette blockiert wird.
  2. Wählen Sie "V-Klemme" Modus durch den Modus-Regler auf die Endstufe einschalten, dann öffnen "Membrantest" Schnittstelle in der Software. Bewegen Sie die Pipette der Nähe des Ziel Neuron unter dem Mikroskop Inspektion.
    Hinweis: In der intakten DRG Vorbereitung, eine dünne Schicht aus Satelliten Gliazellen jedes Neuron kapselt.
  3. Mit positivem Druck aus der Pipette den Satelliten Gliazellen Schicht, bis eine plötzliche Erweiterung des Raumes zwischen dem Neuron und der umgebenden Schicht von Satelliten Gliazellen zu durchqueren beobachtet. Halten Sie die Pipette auf das Neuron, bis ein "Grübchen" Bewegen auf dem Neuron beobachtet wird.
    Hinweis: Im Vergleich mitAufnahmen von dissoziierten Neuronen, muss der positive Druck ein wenig größer zu sein, die den Satelliten glial Zellschicht zu durchdringen und erhöhen die Chancen für eine erfolgreiche patching helfen.
  4. Reduzieren Sie den positiven Druck. Als nächstes wird eine Giga-Ohm-Dichtung mit sanften Sog erreichen.
    Hinweis: Bei diesem Verfahren wird die Erfolgsrate der Aufzeichnung mindestens 70% beträgt.
  5. Erhalten whole-cell - Konfiguration wie zuvor 19 beschrieben.
    1. Kurz gesagt, dringen in die Neuron Zellmembran über einen kurzen, aber starken Sog. Alternativ können Sie die "zappen" Funktion des Verstärkers während Sog angewendet wird.
    2. Sobald eine ganze Zelle Modus hergestellt wird, kompensieren Ganzzellkapazität und Serienwiderstand (Rs) durch den Verstärker die Kapazitäts- und Widerstandskompensation Drehknöpfe.
      Hinweis: Rs ist in der Regel 5-20 MOhm.
    3. Verlassen wir die Zelle, wenn Rs ist zunächst größer als 30 MOhm; oder Rs um mehr als 20% während der Aufzeichnung. Ebenfallsmessen das Ruhemembranpotential; verlassen eine Zelle, wenn das Ruhemembranpotential mV mehr als -50 ist.
  6. Schließen Sie die "Membrantest" Fenster. Wählen Sie "I-Klemme normalen" Modus durch den Modus-Regler auf den Verstärker einschalten.
  7. Klicken Sie auf "offenes Protokoll" in der Software auswählen und das Protokoll laden für rheobase messen. Klicken Sie auf "Aufzeichnen" Aufnahme zu starten. Messung der Eingangswiderstand und die neuronale Erregbarkeit Rheobase zu untersuchen, durch eine abgestufte Reihe von Einspritzen von Strömen in Schritten von 100 pA depolarisierende.
    1. Klicken Sie auf "offenes Protokoll" wieder und wählen Sie das Protokoll für die Membranschwelle zu messen. Ein 500 ms depolarisierenden Rampenstrom (2.000 pA / s) wird mit dem Neuron injiziert werden.
    2. Verwenden Sie die Datenerfassung und Analyse - Software (zB Clampfit) die aufgezeichneten Spuren zu analysieren gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie die Software den Eingangswiderstand (Rin) auf der Grundlage der Steady-State-IV relat zu berechnenionship während der hyperpolarisierender Strömungen ausgeliefert. Bewegen Sie den Cursor den Wert für Rheobase und Membranschwelle zu messen.
      Hinweis: Die Amplitude des Stroms erforderlich, um den AP zu induzieren als Rheobase definiert, und die niedrigste Spannung zum Induzieren AP wird als Membranschwelle definiert.
  8. Notieren Sie die Ligand induzierte Ströme.
    1. Füllen Sie eine Pipette mit den spezifischen Agonisten.
      Hinweis: Im aktuellen Bericht verwendeten wir 100 uM Glutamat und 100 uM AITC die Ströme von Glutamat-Rezeptoren und TRPA1 Rezeptoren bzw. vermittelt zu induzieren.
    2. Überprüfen Sie die Pipette, um sicherzustellen, gibt es im Inneren keine Luftblasen. Platzieren Sie die Pipette in die Pipettenhalter. Schließen Sie den Pipettenhalter mit einem Rohr zu einem Arzneimittel-Abgabesystem verbunden.
    3. Verwenden Sie den Manipulator, um die Pipette innerhalb von 50 & mgr; m des Neurons bewegen. Stellen Sie das Medikament-Abgabesystem Druck auf 1 psi und die Dauer bis 1 s. Schalten Sie den Aufnahmemodus Spannungsklemme und die Klemme bei -70 mV. gelten kurz den Druck über das Arzneimittelabgabesystem, um einen medikamenteninduzierten Strom aufzunehmen.

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Ergebnisse

Figur 1 zeigt den Vorgang der intaktes DRG für Patch - Aufzeichnung vorbereitet. 1A zeigt die Belichtung und die Position der ganglia nach Laminektomie. Abbildung 1B zeigt , L3, L4 und L5 DRGs mit den Nervenwurzeln angebracht , nachdem das Rückenmark zu entfernen. Dann L4 und 5 DRGs werden sorgfältig seziert und von den Wirbeln befreit. Als nächstes wird das Epineurium, eine transparente Membran , die die DRG umgibt, entfernt (gelber Pfe...

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Diskussion

Wir berichten über eine Methode, um ganze DRGs für die Patch-Clamp-Studien vorzubereiten. Es gibt mehrere wichtige Elemente für eine ideale Probe vorbereitet. Erstens ist es wichtig, die DRGs mit dorsalen Wurzeln angebracht zu sezieren. Danach müssen die Epineurium sorgfältig entfernt werden, während eine Beschädigung der Neuronen zu vermeiden. Schließlich freizulegen, die Neuronen und deren umgebenden Satelliten Gliazellen, ist es notwendig, die verbleibende Bindegewebe zu verdauen. Intakte DRGs von erwachsenen Ratten ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren möchten der Painless Research Foundation für die Unterstützung der Arbeit danken. Diese Arbeit wurde auch durch die NIH-Zuschüsse R01 NS080921-01 und R21 NS079897-01A1 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Pentobarbital Natriumvortech Pharmaceuticals
SpritzeBD3096591 ml, 5 ml.
SkalpellBDGröße: 15
Mayo gerade SchereFine Science Tools14010-15
Mayo gebogene SchereFine Science Tools14011-15
RongeurFine Science Tools16021-14
Adson ZahnzangeFine Science Tools11027-12
Iris SchereFine Science Tools14084-08
Noyes FederschereFine Science Tools15124-12
KnochenschereFine Science Tools16044-10Speziell zum Schneiden der Knochen.
Pinzette: Dumont, Dumoxel Biologie #5Fine Science Tools11252-30Diese haben die feinen Spitzen, die beim ersten Kauf nicht geschärft werden müssen.
Periost-AufzugSklar97-0530
DissektionsmikroskopWILD
TransferpipetteFisher Marke13-711-5AM
Petrischale (10 cm)PyrexPetrischale aus Glas kann Beschädigung der Spitzen feiner Pinzetten vermeiden
Kollagenase (Liberase TM)Roche05-401-119-001Bei einer Konzentration von 13 U/ml auflösen, aliquot in eine Glaspipette. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
FilterThermo Scientific7232520Filtern Sie die internen Lösungen für die Patch-Clamp-Aufnahme, um Verstopfungen zu vermeiden.
Die GlaspipetteSutterBF150-110-7.5
AnchorHavard Gerät64-0250stabilisiert das DRG, um Abdrift zu vermeiden.
PeristaltikpumpeWPI
PipettenabzieherSutterP97
VerstärkerMolekulare GeräteAxopatch 200B
DigitizerMolekulare Geräte1440D
MikroskopNIKONFN600
MikromanipulatorSutterMPC200
Mikroinjektion AbgabesystemGeneral ValvePicrospitzer IISchnellverabreichungssystem
für Medikamente Carbogen (95 % O2, 5 % CO2)Lokaler Anbieter
von medizinischem Gas

Referenzen

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