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Immunology and Infection

Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54293
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School, 2Department of Biophysics, University of Michigan

Abstract

La proteina strutturale del virus HIV-1, Pr55 Gag (o Gag), si lega alla membrana plasmatica in cellule durante il processo di assemblaggio virus. legame di Gag membrana è un passo essenziale per la formazione di particelle di virus, dal momento che un difetto nella membrana Gag risultati vincolanti in grave compromissione della produzione di particelle virali. Per ottenere i dettagli meccanicistici di interazioni di membrana Gag-lipidi, metodi in vitro basati sulla risonanza magnetica nucleare, footprinting proteine, risonanza plasmonica di superficie, liposomi flottazione centrifugazione, o tallone di fluorescenza dei lipidi vincolanti sono stati sviluppati finora. Tuttavia, ciascuno di questi metodi in vitro ha i suoi limiti. Per superare alcune di queste limitazioni e fornire un approccio complementare ai metodi precedentemente stabiliti, abbiamo sviluppato un test in vitro in cui le interazioni tra HIV-1 Gag e membrane lipidiche si svolgono in un ambiente "cell-like". In questo saggio, Gag legame con membrane lipidiche viene analizzato visivamente utilizzando YFP-Tagged Gag sintetizzato in un germe di grano, con sede a sistema di traduzione vitro e GUVs preparati da una tecnica electroformation. Qui si descrive lo sfondo e dei protocolli di ottenere proteine ​​Gag full-length myristoylated e membrane GUV necessarie per il test e di individuare Gag-GUV vincolante al microscopio.

Introduction

dell'immunodeficienza umana di tipo 1 del virus (HIV-1) è un virus con involucro che assembla a gemme e dalla membrana plasmatica (PM) nella maggior parte dei tipi di cellule. L'assemblaggio del virus HIV-1 particelle virali è guidato dal 55 kDa proteina virale chiamata nucleo Pr55 Gag (Gag). Gag è sintetizzato come un precursore poliproteico composta da quattro principali domini strutturali, ovvero matrice, capside, nucleocapside e p6, nonché peptidi due distanziatori SP1 e SP2. Durante il montaggio, la matrice (MA) dominio è responsabile per il targeting di Gag al sito di assemblaggio, il capside (CA) dominio media interazioni-Gag Gag, il nucleocapside (NC) dominio recluta virale di RNA genomici, e fattori dell'ospite p6 reclute che aiuti scissione particella del virus dalla membrana plasmatica. Gag subisce anche una modifica co-traslazionale mediante aggiunta di un acido grasso 14-carbonio o miristato porzione al suo N-terminale.

legame di Gag membrana è un requisito essenziale per l'assemblaggio virale, poiché mutants che sono difettosi in membrana vincolante non riescono a produrre particelle virali. Noi e altri hanno dimostrato che il legame di Gag è mediata da segnali bipartite all'interno del dominio MA membrana: la frazione miristato N-terminale che media interazioni idrofobiche con il doppio strato lipidico e un gruppo di residui di base all'interno del dominio MA definito come regione altamente di base ( HBR) che interagisce con i lipidi acidi sul PM 1-4. Studi di Gag-membrana interazioni con l'espressione ectopica di polifosfoinositidi 5-fosfatasi IV (5ptaseIV), un enzima che catalizza l'idrolisi di PM-specifica acida phosphatidylinositol- fosfolipidi (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] per fosfatidilinositolo-4-fosfato, in cellule suggerito che Gag-PM localizzazione è mediata da PI (4,5) P 2 3,5. Tuttavia, gli studi in vitro che mira a comprendere i dettagli più meccanicistici di Gag-PI (4,5) P 2 interazioni hanno dimostrato di essere difficile per una serie di motivi. Peresempio, purificazione di full-length myristoylated HIV-1 Gag per esperimenti biochimici è stato tecnicamente difficile almeno in parte a causa della tendenza di Gag ad aggregarsi durante la purificazione. Quindi, le forme tronche di HIV-1 gag, come Myr-MA o Myr-MA-CA, o la forma non myristoylated sono stati spesso utilizzati in studi che necessitano di purificazione Gag (ad esempio, la risonanza magnetica nucleare, footprinting proteine, e la superficie risonanza plasmonica 6-9). In alternativa, accoppiato in reazioni di trascrizione-traduzione in vitro sono stati utilizzati per produrre full-length myristoylated HIV-1 Gag in altri studi biochimici 1,2. Tipicamente in questo sistema, un plasmide Gag-codifica è trascritta e tradotta con lisati cellulari eucariotiche (per esempio, lisati di reticolociti di coniglio) che sono privi di qualsiasi membrane cellulari e RNA messaggeri ma contengono i meccanismi di trascrizione e traduzione. Dopo la reazione, lisati cellulari contenenti Gag sono mescolati con membranes per l'analisi delle interazioni Gag con i lipidi. Oltre alla facilità di preparazione integrale myristoylated Gag, metodi che utilizzano il sistema di traduzione in vitro trascrizione hanno un vantaggio che la sintesi Gag e successiva membrana reazioni di legame si verificano in un ambiente 'eucariotica citosol-like' che possono rappresentare le condizioni fisiologiche. Questa struttura ha contribuito agli studi che hanno dimostrato che le molecole di RNA legate al dominio MA regolano Gag legame con lipidi acidi in modo competitivo 1,2,10-12. Tuttavia, poiché la quantità totale di proteine ​​Gag ottenuti in questi lisati cellulari non sono elevati, marcatura metabolica delle proteine ​​con amminoacidi radiomarcati necessarie per il loro rilevamento.

A seconda del metodo per misurare le interazioni Gag-lipidi, sono stati utilizzati una varietà di preparazioni di membrane. Ciascuno di questi metodi ha i suoi punti di forza e limiti. La maggior parte dei test NMR basati richiedono l'uso di lipidi con brevi acilecatene che sono solubili in acqua (per esempio, C4- e C8-PI (4,5) P 2) 6,8. Mentre i metodi NMR per testare legame di Gag ai lipidi che hanno catene acile da tempo trovato nelle cellule sono in fase di sviluppo, sono stati utilizzati soltanto con myristoylated o nonmyristoylated MA finora 8,13. In alternativa, liposomi preparati da lipidi che hanno catene lunghezza acilici nativi sono stati utilizzati in metodi biochimici come flottazione liposomi o fluorescenti tallone liposoma analisi di legame 2,3,10,14-16. Tuttavia, liposomi usati in questi test hanno piccolo diametro, e quindi le loro membrane hanno curvature ripidi e positivi. Al contrario, durante la prima fase di assemblaggio delle particelle nelle cellule HIV-1-infetti, Gag lega al PM, che è quasi planare sulla scala di Gag, e, successivamente, induce curvatura negativa durante erba. Pertanto, le membrane liposomi con curvatura ripida e positivo potrebbe non essere doppi strati lipidici ideali per studiare le interazioni Gag-lipidico. Per quanto riguarda i liposomi flotsaggi ation, un altro potenziale avvertimento è che l'esposizione di complessi Gag-lipidi a gradiente di saccarosio ipertonico durante la centrifugazione possono influenzare l'esito sperimentale. Per alleviare queste limitazioni e fornire un sistema sperimentale complementare, saggi per Gag legame giganti vescicole unilamellari (GUVs) sono stati sviluppati negli ultimi anni. GUVs sono vescicole doppio strato lipidico singoli i cui diametri estendersi a diverse decine di micrometri. Così, la curvatura di queste membrane analogo al PM sulla scala di Gag. Inoltre, grazie alle sue grandi dimensioni, che consente il controllo visivo in microscopi ottici, membrana vincolante proteine ​​Gag di fluorescenza etichettati o etichettati a queste vescicole sulla miscelazione può essere facilmente determinato senza successiva elaborazione di complessi Gag-lipidici.

Abbiamo qui descritto un protocollo per studiare l'HIV-1 gag membrana vincolante utilizzando GUVs ottenuti da un metodo electroformation. Vari metodi come dolce idratazione, idratazione gel-assistita, microfonogetto rofluidic e electroformation 17-22 sono stati utilizzati per ottenere GUVs. Per il protocollo qui descritto, il metodo electroformation è utilizzato principalmente per la sua efficacia nel formare GUVs con lipidi acide e la sua relativa facilità di utilizzo, senza la necessità di configurazioni costosi. Dal momento che la visualizzazione di Gag necessita di un reporter fluorescente, giallo proteina fluorescente (YFP) è geneticamente aggiunto al C-terminale di Gag (Gag-YFP). Proteine ​​Gag-YFP sono ottenute in vitro trascrizione e traduzione reazioni in a grano lisati germinali basato sulla tecnologia continuo scambio-flusso continuo (CECF). In questa tecnologia, sia la rimozione di sottoprodotti inibitori delle reazioni e fornitura di substrati di reazione e componenti energetiche vengono raggiunti in un meccanismo di dialisi a base. Per queste reazioni, è utilizzato un plasmide codificante Gag-YFP sotto il controllo di un promotore T7. Da segnalare, come illustrato in precedenza, lisati di germe di grano supportano myristoylation senza componenti aggiuntivi 23,24. Utilizzando questo metodo, è stato possibile ottenere una quantità sufficiente di full-length myristoylated Gag-YFP per la visualizzazione di Gag sulle membrane GUV 24. Qui si descrive il protocollo con cui legame HIV-1 gag a PI (4,5) P2 -contenenti membrane GUV può essere esaminato senza lunghe successiva elaborazione seguenti reazioni vincolanti e proporre che questo metodo complementare preesistente Gag-membrana test impegnativi e possono essere esteso a comprendere ulteriormente l'HIV-1 gag-membrana vincolante.

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Protocol

Giorno 1: Espressione di proteine ​​Gag Uso del germe di grano lisato-based in vitro trascrizione-traduzione sistema

1. Preparazione del virus HIV-1 gag

  1. Rimuovere tutti i reagenti del kit commerciale CECF germe di grano da congelatori (lisati germe di grano sono conservati a -80 ° C; altri reagenti a -20 ° C). Li Scongelare su ghiaccio e miscelare i componenti come mostrato nella Tabella 1.
Mix-1 (alimentazione della miscela)
soluzione di alimentazione 900 ml
Aminoacidi 80 ml
metionina 20 microlitri
Totale 1.000 ml
Mix-2 (lisato miscela)
lisati germe di grano 15 ml
acqua libera RNase 7 ml
Aminoacidi 4 pl
metionina 1 ml
Plasmidi DNA in tampone TE (1 mg / mL) ** 4 pl
tampone di reazione 15 ml
RNasin * 4 pl
Totale 50 microlitri

Tabella 1: Composizioni di impasti necessari per le reazioni di germe di grano.
Nota: Se l'esperimento è stato progettato per esaminare l'effetto di rimozione di RNA da RNasi sulla membrana Gag vincolante, sostituire gli inibitori della ribonucleasi con acqua RNase-free. Plasmid DNA deve essere esente da impurità secondo le istruzioni del produttore. Tuttavia, plasmids preparati utilizzando convenzionale, ma non endotossine-libero, kit di isolamento plasmide sono stati utilizzati con successo. le istruzioni del produttore consiglia anche usando il DNA sciolto in acqua priva di nucleasi. Se si utilizza il DNA sospeso in TE [10 mM Tris-HCl (pH 7.4) contenente 1 mM EDTA], evitare l'uso di concentrazioni più basse di DNA, in quanto EDTA in TE può influenzare la resa. Plasmidi disciolti in tampone TE ad una gamma di concentrazione di 0,8-1 mg / mL sono stati usati con successo.

  1. In primo luogo aggiungere la miscela di alimentazione (Mix-1) nel cassetto di reazione (camera trasparente). Quindi aggiungere la miscela lisato (Mix-2) per l'altra camera (rosso). Non introdurre eventuali bolle mentre l'aggiunta di miscele nelle loro rispettive camere, dal momento che possono portare a scambio inefficiente dei componenti della soluzione e quindi ridurre l'efficienza della reazione.
  2. Coprire le camere con la pellicola adesiva fornito con il kit.
  3. Inserire la cassetta reazione nello scomparto della cassetta e incubate l'assemblea per 24 ore a 24 ° C ad una velocità costante di agitazione 900 giri in un Eppendorf Thermomixer R.

Giorno 2: Preparare GUVs di Electroformation e Harvest Germe di Grano Lisati

2. Preparazione di GUVs

  1. lipidi aliquote disciolti in solventi inorganici come il cloroformio o miscele di cloroformio e metanolo in fiale di vetro con tappi a vite rivestiti con fodere in teflon e avvolto con Parafilm. Maneggiare lipidi con Hamilton tipo siringhe di vetro, o, se disponibile, consigli plastica cloroformio-resistente. Estrarre flaconcini di vetro contenenti lipidi da utilizzare per la preparazione GUV dal -20 ° C freezer.
    1. Una volta che le fiale sono equilibrati a temperatura ambiente, assicurarsi mediante ispezione visiva che le sospensioni dei lipidi sono chiare. La qualità dei lipidi, in particolare lipidi acidi, come fosfatidilserina palmitoil-oleoyl (POP) e PI (4,5) P 2, è importante per gli esperimenti di successo. Non utilizzare i lipidi che sonoin aliquote per più di 2 mesi.
  2. Pre-riscaldare un blocco di calore alla temperatura desiderata. Questa temperatura deve essere di almeno 5 ° C superiore alla temperatura di fusione (Tm) del lipide (s) con la più alta T m.
  3. Calcolare i volumi di lipidi necessari in base ai rapporti di lipidi molari desiderati. Per studiare l'HIV-1 gag vincolante qui, utilizzare i seguenti rapporti molari, come illustrato nella tabella 2.
mix Lipid rapporto molare Volume (in ml) la concentrazione della
POPC + POPS + Chol 46,6 + 23,3 + 30 19,74 + 10,18 + 6,57 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P2 16.11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml
Brain-PI (4,5) P 2: 1 mg / ml

Tabella 2: Volumi di diversi lipidi utilizzato per ottenere GUVs.

  1. Aggiungere i volumi desiderati di lipidi in un flaconcino di vetro con tappo a vite pulito.
  2. Scivoli di dimensioni 25 x 50 x 1,1 mm 3 e resistenza 70-100 Ohm (come descritto nel catalogo) Utilizzare ITO-rivestito. Inserire due scivoli ITO rivestite su un banco pulito. Ogni camera electroformation richiede due indio-stagno-ossido (ITO) vetrini Rivestiti. Verificare che il lato conduttore del vetrino è rivolto verso l'alto controllando la resistenza con un multimetro. Si dovrebbe mostrare un valore di circa 200 Ω. Assicurarsi che la superficie delle diapositive sono pulite strofinando delicatamente con etanolo al 70% utilizzando salviette privo di lanugine.
  3. Pulire la superficie esterna di un ago di una siringa rinsing con cloroformio e posizionare la siringa sul blocco di calore.
  4. Posizionare una nuova diapositiva di vetro ITO rivestita sul blocco di calore con il lato conduttore rivolto verso l'alto e lasciarlo equilibrare alla temperatura desiderata di solito circa 2-3 minuti. Non riutilizzare i vetrini ITO rivestite per un rischio potenziale che l'ITO-rivestimento sulle lastre di vetro potrebbe essere danneggiata durante le procedure di pulizia.
  5. Utilizzare un volume di 40-50 ml della miscela lipidica per ogni diapositiva per uniforme e tuttavia rapida diffusione dei lipidi sul vetrino. Regolare il volume totale con un solvente organico appropriato come cloroformio.
    1. Mettere una metà del volume totale della miscela lipidica sul vetrino e diffondere immediatamente il lipide mediante la siringa pulita (passo 2.6) per lasciare un film lipidico uniforme (spostando l'ago 2-3 volte lungo il vetrino). Stendere il film lipidico delicatamente (ma presto) per evitare danni al rivestimento ITO sottile. Non uniforme diffusione o ruvida diffusione può portare a sub-ottimalerendimenti o l'eterogeneità computazionale di GUVs.
    2. Pertanto, garantire la diffusione uniforme controllando il film lipidico dopo la diffusione prima di procedere alla fase successiva. Se l'opacità del film appare eccessivamente non uniforme, ripetere la procedura utilizzando una nuova diapositiva.
  6. Posizionare il vetrino rivestito all'interno di una capsula di Petri con il lato rivestito rivolto verso l'alto.
  7. Ripetere i passaggi 2,6-2,9 per il resto della miscela utilizzando un'altra diapositiva ITO rivestite.
  8. Porre la capsula di Petri contenente entrambi i vetrini in una camera a vuoto essiccazione convenzionale per 60-90 minuti per rimuovere ogni traccia di solventi organici.
  9. Durante questo processo, impostare l'incubatrice alla stessa temperatura come quella del blocco di calore (65 ° C nella maggior parte dei casi) e pre-caldi 300 mM di soluzione di saccarosio in incubatrice.
  10. Dopo l'essiccazione, portare la capsula di Petri al banco e posizionare il vetrino su una superficie pulita.
  11. Pulire delicatamente una guarnizione PDMS (Figura 1) utilizzando 70% di etanolo e asciutto completamente.
  12. Collocare sul vetrino lipidi rivestite come mostrato in Figura 1 e delicatamente e fermamente premere in modo che le forme guarnizione a tenuta stagna. Confermare l'assenza di spazi tra guarnizione PDMS e il vetrino. Ciò provoca la formazione di una camera poco profonda che contiene la soluzione di saccarosio.

Figura 1
Figura 1:. Il layout del vetrino ITO rivestito utilizzato per electroformation Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Riempire la camera con soluzione di saccarosio pre-riscaldato senza bolle.
  2. Posizionare l'altra vetrino rivestito sopra per effettuare una tenuta ermetica. Assicurarsi che non vi siano bolle. L'assemblaggio finale dovrebbe apparire come mostrato nella Figura 2. Fissare la camera di usinclip g legante.

figura 2
Figura 2:. Rappresentazione schematica della camera di electroformation (vista laterale) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Rimuovere l'eccesso di saccarosio tramite aspirazione e pulire le diapositive utilizzando salviettine privo di lanugine. Fissare i vetrini alla barra di rame in modo che i lati conduttivi sono in contatto uniforme con la barra. Assicurarsi che solo un lato conduttivo del vetrino è in contatto con una barra di rame.
  2. Collegare la barra di rame per l'uscita del generatore di funzioni utilizzando i morsetti a coccodrillo. Posizionare il gruppo all'interno dell'incubatrice per permettere il montaggio raggiunga la temperatura desiderata.
  3. Applicare una frequenza dell'onda sinusoidale di 10 Hz e una differenza di potenziale di 1 V per 90 min. assicue che la tensione sia 1 V da un multimetro come illustrato nella figura 3. Continuare il processo per 90 min.

Figura 3
Figura 3:. Le posizioni in cui gli elettrodi del multimetro sono collocati per la frequenza e la corrente di misurazione Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Dopo 90 min, ridurre lentamente la frequenza di 2 Hz e continuare electroformation per altri 10 min. Durante questo tempo, il raccolto nella reazione di traduzione in vitro (passi 3.1-3.2).
  2. Spegnere il generatore di funzioni e permette il montaggio raffreddare lentamente a temperatura ambiente (spegnendo l'incubatore e lasciando la porta dell'incubatore leggermente aperta).
  3. Dopo raffreddamento, scollegare i cavi al generatoredai gruppi di scorrimento. GUVs può essere molto fragile e quindi hanno bisogno di essere gestiti molto delicatamente. portare con cautela il gruppo al banco.
  4. Smontare la camera rimuovendo delicatamente la slitta superiore con pinze. Raccogliere le GUVs sospensione contenente saccarosio con un taglio di 1.000 punta microlitri e trasferimento in una provetta pulita. Maneggiare il tubo con delicatezza per evitare di disturbare GUVs.
  5. Utilizzare immediatamente le GUVs. GUVs sono stabili per almeno 90 minuti dopo la raccolta se conservata a temperatura ambiente.

3. Le reazioni Harvest in vitro di traduzione

  1. Raccogliere le reazioni in vitro traduzione contenenti proteine ​​desiderate dalla camera rossa con una micropipetta in un tubo.
  2. Per rimuovere le proteine ​​aggregate, girare i lisati a 16.200 xg per 15 min a una centrifuga da tavolo e trasferire con attenzione il surnatante in un altro tubo.

4. GUV binding assay

  1. Utilizzando una punta taglio, mescolare 51; l di reazioni in vitro traduzione contenenti proteine ​​tradotte e 5 ml di GUVs in un tubo ed incubare a temperatura ambiente per 2-3 minuti.
  2. Allegare un foglio PDMS con un piccolo foro (3-4 mm di diametro) su un vetrino pulito e garantire la tenuta stagna premendo delicatamente e fermamente contro il vetrino.
  3. Mettere il composto 10 microlitri dal punto 4.1 nel piccolo foro.
  4. Immagine la miscela sotto un microscopio a fluorescenza confocale epi o invertita a temperatura ambiente.
    Nota: per evitare l'evaporazione, la camera di imaging può essere coperto da un vetrino.

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Representative Results

Utilizzando il protocollo di cui sopra, abbiamo preparato GUVs composto da POPC + POPS + Chol (rapporto molare: 4.66: 2.33: 3). Questa composizione è stata scelta in modo da riflettere circa le concentrazioni di PS e di colesterolo del PM. Robusto ed efficiente vincolante di Gag è stato osservato solo quando il cervello-PI (4,5) P2 è stato incluso nella miscela POPC + POPS + Chol (PI-cervello (4,5) P 2 [rapporto molare POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1] in questo esempio) (Figura 4, confrontare pannelli B e D con a e C). Legame GUVs composti POPC + Gag-YFP SCHIOCCA + Chol + brain-PI (4,5) P 2 è evidente l'aumento dell'intensità della fluorescenza sulla superficie della membrana. Questo aumento può essere visto anche nei profili di intensità di fluorescenza (Figura 4, in basso) lungo la linea che attraversa il confine GUV (XX 'nella Figura 4C e D).

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Figura 4: Gag lega al cervello-PI (4,5) P2 -contianing GUVs Una sezione trasversale confocale di POPC + POPS + Chol (A e C) e POPC + POPS + Chol + PI (4,5) P2. GUVs (B e D). Distribuzione di Gag-YFP è mostrato in verde. immagini ingrandite dei GUVs selezionati (scatole gialle) sono mostrati in pannelli C e D. intensità della fluorescenza profili lungo le linee scelte a caso disegnate per attraversare i lati opposti del GUVs (X di X ') sono visualizzabili sotto le immagini. Bar = 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il saggio di legame GUV come descritto sopra fornisce una buona alternativa in scenari in cui altri test interazione proteina-lipide hanno i loro limiti. Questo test ci permette di esaminare le interazioni tra myristoylated Gag a figura intera e lipidi acidi con catene acilici lunghezza nativa nel contesto doppio strato lipidico e farlo senza lunghe centrifugazione di galleggiamento grazie ad alta densità gradienti di saccarosio o di altre lavorazioni di post-binding di Gag-lipidico complessi. Un altro vantaggio è che il comportamento di Gag può essere esaminato in una miscela complessa (per esempio, in presenza di componenti citosolici), che non è facilmente ottenuto in altre tecniche in tempo reale, come saggi di risonanza plasmonica di superficie a base. Pertanto, si può affermare che il saggio qui descritto permette di valutare in tempo reale delle interazioni lipidi Gag-acidi in un contesto più nativa di altri test utilizzati nel campo.

Tuttavia, vi sono limitazioni associate con il metodo comebene. Per garantire che GUVs in un dato preparato hanno composizione simile tra loro e alla miscela originale, electroformation devono essere eseguite ben al di sopra della temperatura di transizione dei lipidi che hanno la più alta temperatura di transizione presente nella miscela di 25,26. Tuttavia, è possibile che l'esposizione di lipidi a temperature più elevate per più tempo può portare alla rottura dei lipidi 25,27. Pertanto, per controllare la qualità del GUVs, oltre al controllo visivo attivato per inclusione di coloranti fluorescenti di lipidi (ad esempio, DID), è desiderabile per verificare la funzionalità del lipide di interesse [ad esempio, PI (4,5) P 2 ] utilizzando una sonda specifica-lipidico. Inoltre, con composizioni GUV che danno luogo a separazione di fase ad una certa temperatura, occorre prestare attenzione a mantenere con precisione una temperatura desiderata osservando l'interazione proteina-GUV. Un'altra limitazione è che le soluzioni di elevata forza ionica sono incompatibili con l'elettroprotocollo di formazione qui descritto, e quindi GUVs vengono coltivati ​​e mantenuti in 300 mm soluzione di saccarosio 26. In particolare, però, alcuni studi hanno utilizzato con successo i buffer a forza ionica fisiologici nei loro protocolli electroformation modificati 28.

Un aspetto critico è la quantità di Gag. Un sistema basato su lisato di reticolociti di coniglio viene spesso utilizzato per la preparazione di full-length HIV-1 gag in saggi di liposomi di galleggiamento. Tuttavia, la quantità di YFP-tagged Gag full-length ottenuto in questo sistema era insufficiente per la visualizzazione di Gag legame GUVs. Per risolvere questo problema, il sistema di trascrizione-traduzione di germe di grano lisato a base privo di cellule, che produce circa 8-10 volte quantità maggiore di Gag, è stato usato nel test corrente. Tuttavia, se GUV esperimenti di legame devono essere eseguite in assenza di componenti lisato cellulare eucariotica, si può usare proteine ​​purificate marcati con un fluoroforo come è stato fatto recentemente (descritte di seguito).

E 'stato dimostrato che specifica ed efficace legame di Gag alle membrane è un processo cooperativo regolato da vari fattori quali miristato, RNA, headgroups lipidici e catene di acidi e interazioni Gag-Gag (valutata in riferimento 29). Il sistema in vitro di descrivere qui può essere esteso per affrontare i ruoli di fattori singolarmente o in combinazione per comprendere l'ordine degli eventi nel processo cooperativo di Gag membrana vincolante. Finora, il sistema di analisi descritto chiarito un ruolo inaspettato della insaturi PI (4,5) P 2 catene acil nel legame di Gag, ma non quella di un canonica PI mammiferi cellule origine (4,5) P 2 -binding dominio ( il dominio di omologia pleckstrin della fosfolipasi C delta 1) 24, un risultato che non era stato rivelato da saggi di liposomi di galleggiamento. sistemi di dosaggio GUV-based sono stati utilizzati anche per capire altri aspetti della biologia Gag. Utilizzando un derivato Gag contenente un ricez inducibile artificialeMotivo erization e GUVs con zattera-like e non zattera come domini, Keller et al. hanno esaminato la relazione tra Gag partizionamento di domini 'zattera-like' e multimerizzazione 30. Uno studio di Carlson et al. Ha utilizzato il sistema GUV e purificata e fluorescente Gag di capire l'ordine sequenziale di reclutamento dei vari endosomiali ordinamento complessi necessari per il trasporto (ESCRT) proteine ​​di membrana da Gag 31. Di recente, un altro studio ha riportato la ricostituzione del processo di gemmazione delle vescicole Gag-indotta sul GUV utilizzando Gag coniugata con un fluoroforo 32. HIV-1 gag multimerizzazione porta alla formazione di submembrane reticolo Gag che è pensato per la curva delle membrane durante l'assemblaggio. Quindi, con un ulteriore miglioramento dei sistemi di dosaggio Gag-GUV, il rapporto tra i cambiamenti di curvatura della membrana e membrana Gag vincolante, che è probabilmente l'aspetto meno ben compreso di montaggio dell'HIV, può essere analizzato come si sta facendo FOr altre proteine ​​curvatura sensibile cellulari 33.

In sintesi, con questo protocollo, si possono ottenere quantità sufficienti di myristoylated Gag full-length e visualizzare Gag legame alle membrane GUV. Questo protocollo può essere ulteriormente sviluppato per esaminare varie fasi di HIV-1 montaggio e processi in erba.

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Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Mohammad Saleem, Jing Wu e Krishnan Raghunathan per le discussioni utili. Ringraziamo anche Priya Begani per l'assistenza durante le riprese. Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 AI071727 (Ao) e R01 GM110052 (a SLV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital Multimeter Meterman 30XR A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator Instek GFG-8216A A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.
ITO coated glass slides Delta Technologies, Loveland, CO CG-90IN
Incubator Hoefer Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber Nalgene
Thermomixer R Eppendorf 21516-166
Syringe Hamilton 80400 Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit BiotechRabbit,
Berlin, Germany		 BR1401001
DiD Life Technologies, Carlsbad, CA  D7757
POPC Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL  850457C
POPS Avanti Polar Lipids 840034C
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700041P
Brain-PI(4,5)P2  Avanti Polar Lipids 840046X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
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Immunologia HIV-1 gag vincolante membrana assemblaggio virus electroformation PI (4,5) P Giganti vescicole unilamellari lipidi biofisica
Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane
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Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A.… More

Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (113), e54293, doi:10.3791/54293 (2016).

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