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Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

DOI:

10.3791/54296

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October 18th, 2016

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1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie vergleicht zwei verschiedene Methoden der Isolierung humaner Monozyten zur Gewinnung von in vitro dendritischen Zellen (DCs). Monozyten werden durch Adhärenz selektiert oder durch magnetische Trennung negativ angereichert. Die Monozytenausbeute und -viabilität sowie die Viabilität, Proliferation und Expression von CD11c/CD14-Oberflächenmarkern werden zwischen beiden Methoden verglichen.

Abstract

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Dendritische Zellen (DCs) sind Antigen-präsentierende Zellen des Immunsystems, die eine entscheidende Rolle bei der Lymphozytenreaktion, den Abwehrmechanismen des Wirts und der Pathogenese von Entzündungen spielen. Die Isolierung und Untersuchung von DCs war in der biologischen Forschung aufgrund ihrer charakteristischen Merkmale wichtig. Obwohl sie essentielle Schlüsselmediatoren des Immunsystems sind, sind DCs im Blut sehr selten und machen etwa 0,1 - 1% der gesamten mononukleären Zellen im Blut aus. Daher beruhen Alternativen für Isolierungsmethoden auf der Differenzierung von DCs von Monozyten, die aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) isoliert wurden. Die Verwendung geeigneter Isolierungstechniken, die Einfachheit, Erschwinglichkeit, hohe Reinheit und hohe Ausbeute der Zellen kombinieren, ist unbedingt zu berücksichtigen. In der vorliegenden Studie werden zwei unterschiedliche Methoden zur Erzeugung von DCs verglichen. Monozyten wurden durch Adhärenz selektiert oder mittels magnetischem Trennverfahren negativ angereichert, gefolgt von der Differenzierung in DCs mit IL-4 und GM-CSF. Die Lebensfähigkeit, Proliferation und der Phänotyp von Monozyten und MDDC wurden mit Hilfe von Viabilitätsfarbstoffen, MTT-Assays und CD11c/CD14-Oberflächenmarkeranalyse mittels bildgebender Durchflusszytometrie bewertet. Obwohl die magnetische Trennmethode im Vergleich zur Adhäsionsmethode einen signifikant höheren Prozentsatz an Monozyten mit höherer proliferativer Kapazität ergab, haben die Ergebnisse gezeigt, dass beide Techniken in der Lage sind, gleichzeitig Monozyten zu erzeugen, die in der Lage sind, sich nach sieben Tagen in Kultur zu proliferieren und zu lebensfähigen CD11c+ MDDCs zu differenzieren. Beide Methoden ergaben > 70% CD11c+ MDDCs. Daher liefern unsere Ergebnisse Erkenntnisse, die zur Entwicklung zuverlässiger Methoden zur Isolierung und Charakterisierung menschlicher DCs beitragen.

Introduction

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Dendritische Zellen (DCs) sind wesentliche Vermittler der angeborenen und adaptiven Immunsystem. Sie funktionieren auf primäre Immunantworten induzieren und die Entwicklung von immunologischen Gedächtnisses erleichtern. Diese Zellen sind in erster Linie verantwortlich für die Antigen - capture, Migration und T - Zell - Stimulation und werden daher als professionelle Antigen präsentierende Zellen bezeichnet (APCs) 1 .Manipulation von DCs in einer Vielzahl von Forschungsfeldern und im klinischen Umfeld verwendet werden könnte , anders zu behandeln Entzündungserkrankungen wie HIV 6,7, Krebs 8, Autoimmunerkrankungen 9 und allergische Reaktionen 10. DCs sind auch für Drogenmissbrauch Forschung eingesetzt, um unbekannte Mechanismen und Wege zu lösen , wie sie im Zusammenhang mit Alkoholabhängigkeit 11-14, Drogenabhängigkeit 13,15, und die Kombination von HIV - Infektionen und Drogenmissbrauch 16-19. Diese laufenden Studien und zukünftige Studien in auf dem Gebiet der Immunologie machen in vitro Generierung von DCs extrem wichtig für die Forschung. Es gibt jedoch einige Schwierigkeiten , die mit DCs aus humanem Blut zu isolieren , da sie nur 0,1 bilden - 1% der gesamten mononuklearen Blutzellen 20.

Bis heute sind einige der gut etablierten Methoden zur Erzeugung von DCs in vitro besteht aus Kunststoff oder Glas , Adhäsion von Monozyten 21,22, Dichtegradientenzentrifugation 23, spezifischer Marker basierend Trennung wie magnetische aktivierte Zellsortierung 22, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung 24, positive Selektion von CD14 + Monozyten Dextran-beschichteten magnetischen Nanopartikel 25 verwenden und schnelle Isolierung von hoch gereinigten Monozyten vollautomatisierte negativen Zellselektion 26 verwendet wird . Allerdings bleibt die beste Methode der Wahl umstritten. Daher DC Erzeugungstechniken zu verbessern, wurden verschiedene Verfahren entwickelt worden, in denenDie Reinheit dieser Zellen stark durch Differenzierung aus gereinigtem CD34 + Vorläuferzellen und Monozyten , isoliert aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) 27 erhöht werden kann. Wie vor erwähnt, ist ein weit verbreitetes und beliebte Methode für Monozyten - abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) Erzeugen der Fähigkeit der Monozyten zu untersuchen , um Glas oder Kunststoff (Adhärenz - Methode) 21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist eine schnelle und einfache Methode, die nicht die Verwendung von komplexer Ausrüstung erfordert. Jedoch enthalten einige Nachteile dieses Verfahrens Lymphozyt Kontamination, eine geringe Flexibilität und Monocyten transient Manipulation 28. Ein alternatives Verfahren zur Einhaltung Methode ist die magnetische Isolierung von Monozyten aus Gesamt PBMCs, insbesondere bei Verwendung eines menschlichen Monocyten - Anreicherungs Kit, der 26 Monozyten aus PBMCs durch negative Selektion isoliert ausgebildet ist. Während dieses Verfahrens werden unerwünschte Zellen zur Entfernung mit tetrameren gezielteAntikörper-Komplexe und Dextran-beschichtete magnetische Teilchen. Der Vorteil dieser Isolationsmethode besteht darin, daß die unerwünschten markierten Zellen mit Hilfe eines Magneten getrennt werden, während die Zielzellen frei, ohne dass Spalten aus in ein neues Röhrchen gegossen werden. Bis heute mit der Verfügbarkeit von spezifischen monoklonalen Antikörpern, die spezifisch Zellpopulationen, die magnetische Trenntechnik hat etikettieren kann nicht einfach eine zusätzliche Methode, sondern eine Notwendigkeit für die Isolierung von seltenen Zellen in dem Gebiet der Immunologie werden. Beispielsweise Techniken wie magnetische Zellsortierung mit handelsüblichen paramagnetischem MACS-Nanopartikel haben die Entwicklung neuer Ansätze für Forschung und klinische Anwendungen 22,29 erleichtert. Darüber hinaus haben die jüngsten Studien Forschung Vergleich DC Generation von Monozyten Adhärenz und MACS - Technologie Methoden eine höhere DC - Reinheit und Lebensfähigkeit nachgewiesen MACS getrennt Monozyten 22,30 verwendet.

Die aktuelle Studie präsentiertEin Vergleich zwischen den zwei Verfahren zur Herstellung von humanen DCs aus Monozyten aus PBMCs isoliert: 1) monocyte Isolierung durch Adhärenz und 2) monocyte Isolierung durch negative Selektion Kommerzielle menschlichen Monocyten Anreicherungs Kit. Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass die negative Selektion magnetische Trennverfahren Monozyten erzeugt die höchste Ausbeute an Monozyten keine signifikanten Unterschiede in Monozyten Lebensfähigkeit zu isolieren, wenn sie mit isolierten Monozyten durch die Einhaltung Methode verglichen. Wiederum nach sieben Tagen, die durch magnetische Trennung getrennt Monozyten in MDDCs differenziert mit deutlich höheren proliferative Kapazität und höhere Menge an Zellen, die doppelt positiven (+ CD11c / CD14 +) Phänotyp ohne MDDC Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Insgesamt unterscheidet sich die aktuelle Studie aus den bisherigen Studien oben Bezug genommen wurde, da es die Fähigkeit beider Techniken demonstriert gleichzeitig Monozyten erzeugen, die von wuchernden fähig sind und Differenzierung in CD11c +MDDCs (> 70%) nach sieben Tagen in Kultur ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Darüber hinaus bietet der derzeitige Ansatz zum ersten Mal Charakterisierung verschiedener CD11c / CD14 MDDCs Populationen von Abbildungs ​​Durchflusszytometrie.

Zusammengefasst, da DCs eine Brenn Rolle in Bezug auf die Forschung im Bereich der Immunologie spielen, müssen verschiedene Parameter berücksichtigt werden , wenn man bedenkt , wie sie abgeleitet sind und welche sind Methoden verwendet , um sie in vitro zu isolieren und Kultur. Daher zielt diese Studie Erkenntnisse über zwei verschiedene Methoden der Monozyten-Isolierung und wie diese Methoden unterschiedlich Monozyten Lebensfähigkeit und Ausbeute schließlich dendritischen Zellen Lebensfähigkeit, Proliferation zu beeinflussen, und Phänotyp beeinflussen. Diese Ergebnisse werden stark auf dem Gebiet der Immunologie beitragen und ein ausführliches Protokoll der DC-Isolierung, Reinigung und Charakterisierung liefern.

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Protocol

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Insgesamt menschlichem Blut Studien wurden von der Institutional Review Board (IRB) der FIU, IRB-Protokoll Genehmigung # IRB-13-0440, geprüft und genehmigt. Menschliche leukopaks wurden aus der Gemeinschaft Blutbank in Miami, FL gekauft.

1. Isolierung von PBMCs durch Standarddichte Gradiententechnik

  1. Durchführen einer 1: 1-Verdünnung von Blut mit 1x-phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einem T75-Kolben.
  2. Pipette 15 ml Dichtegradient-Lösung in 50 ml Zentrifugenröhrchen und Schicht sorgfältig (25 bis 30 ml / Röhrchen) des verdünnten Blut über diesen Gradienten.
  3. Zentrifuge für 20 min bei 1200 × g mit einer Beschleunigung von 1 und Verzögerung von 0.
  4. Nach dem Zentrifugieren sammeln, um die Grenzschicht (weiße Blutkörperchen) in eine neue 50 ml Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Zellen zweimal in PBS (3 min bei 1.080 × g). Entsorgen Sie jedes Mal den Überstand.
  5. Behandlung von Zellen mit Ammoniumchlorid-Kalium Lysieren (ACK) Puffer (zur Lyse der roten Blutzellen). 10 ml Puffer und incubate für 15 min bei 4 ° C.
  6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, Zentrifuge 3 min bei 1.080 x g und verwerfen jedes Mal Überstand.
  7. Speichern Sie das Pellet, das die PBMCs enthalten wird.
  8. Fahren Sie mit Monozyten- Reinigungsverfahren der Wahl.

2. Monozyt Reinigung durch Adherence-Methode

  1. Bereiten vollständige Zellkulturmedium, das L-Glutamin (300 mg / ml) und supplementiert mit Penicillin (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) und 10% fötalem Rinderserum.
  2. Erlauben PBMCs für etwa 2 Stunden anhaften , indem sie in einem T75 - Kolben bei einer Konzentration von 5 x 10 7 Zellen pro 10 ml vollständigem Medium bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator kultiviert werden .
  3. Nach der Inkubation Entfernen nicht-adhärenten Zellen aus den Kulturkolben schwimmend und sanft adhärenten Zellen zweimal mit PBS waschen.
  4. Inkubieren adhärenten Zellen in Komplettzellkulturmedium, supplementiert mit 2 & mgr; l / ml von humanem Granulozyten-macrophage Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin 4 (IL-4) in einer Stammkonzentration von 10 ug / ml gelagert.
  5. Ändern Sie die Hälfte des Mediums und füllt Zytokine alle 48 Stunden.
  6. Lassen Sie 5 - 7 Tage die für die Differenzierung von Monozyten in MDDCs.

3. Monozyt Reinigung durch magnetische Trennung Methode

  1. Sammeln Sie PBMCs von Standarddichte Gradiententechnik, gießen Sie in ein 5 ml Polystyrolröhrchen und resuspendieren in PBS-Puffer bei einer Konzentration von Zellen / ml.
  2. In menschlichen Monozyten Anreicherung Cocktail 50 & mgr; l / ml Zellen, gut mischen und Inkubation bei 4 ° C für 10 min.
  3. Nach der Inkubation hinzufügen magnetischen Teilchen 50 & mgr; l / ml Zellen, gut mischen und bei 4 ° C für 5 min inkubiert.
  4. Bringen Zellsuspension auf ein Gesamtvolumen von 2,5 ml bis durch Zugabe von PBS-Puffer, gut mischen durch Pipettieren auf und ab 2 - 3 mal.
  5. Legen Sie das Polystyrolröhrchen ohne Kappe in die Magnetvorrichtung und zur Seite bei RT-Set für 2.5 Minuten.
  6. Nach der Inkubation und in einer kontinuierlichen Bewegung, um den Magneten aufzunehmen und die gewünschte gereinigte Monocyten-Fraktion in ein sauberes 50 ml Zentrifugenröhrchen gießen.
  7. Inkubieren adhärenten Zellen in Komplettzellkulturmedium, supplementiert mit 2 & mgr; l / ml von humanem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin 4 (IL-4) in einer Stammkonzentration von 10 ug / ml gelagert.
  8. Jede 48 Stunden, ändern Sie für 5 min bei 1.080 xg Hälfte des Mediums, des Abschaltens und erneut zu suspendieren Pellet mit neuen Medien (cRPMI) und Zytokinen.
  9. Lassen Sie 5 - 7 Tage die für die Differenzierung von Monozyten in MDDCs.

4. Trypanblauausschluß Viability Assay

Hinweis: Verwenden Sie diese Technik Zellausbeute und die Lebensfähigkeit von PBMCs zu erhalten, Monozyten und MDDCs.

  1. Ernten Sie die Zellen unter Verwendung von Standard-Trypsin-EDTA und führen Sie wäscht der Kolben und das Zellpellet unter Verwendung von PBS. Abhängig von der Größe des Pellets wiederin 5 bis 10 ml PBS suspendieren das Pellet aufzulösen.
  2. In einem Mikrozentrifugenröhrchen, führen Sie eine 1: 1-Verdünnung von Trypanblau Reagenz mit verdünnter Zellpellet.
  3. Aus dieser Mischung aliquote 10 ul in eine Zelle zu zählen Rutsche und Leseergebnisse eine automatische Zellzähler mit dem Protokoll des Herstellers nach. Wenn eine automatische Zellzähler nicht verfügbar ist, eine ähnliche Zellzahl ist möglich, eine Hämozytometer oder einen manuellen Zähler verwenden.

5. MTT Assay

  1. Platten Zellen bei einer Konzentration von 4 x 10 4/100 & mgr; l Vollmedium in jede Vertiefung in einer 96-Well - Platte. Erlauben Sie 24 h für Zellen zur Kultur anzupassen.
  2. Inkubieren und führen Messungen bei 0 (Tag 0), 36 (Tag 3) und 84 (Tag 7) hr sind.
  3. Nach Beendigung der gewünschten Inkubation entfernen Medien und ersetzen mit 100 ul PBS allein.
  4. Bereiten 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl Tetrazolium Bromid-Lösung (MTT) (5 mg / ml) durch 10 ml dimeth ZugabeSulfoxid yl (DMSO) bis 1 g Natriumdodecylsulfat (SDS).
  5. Zugabe von 10 & mgr; l (5 mg / ml) MTT-Lösung in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 2 weitere Stunden.
  6. Nach der Inkubation entfernen Stände, die PBS und nicht umgesetzten MTT Mischung (gelb-Farblösung) enthalten.
  7. 100 l SDS-DMSO-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für eine weitere Stunde.
  8. Lesen Sie die Absorption bei 540 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader.

6. Zeiloberflächenfärbung Analyse von Imaging Durchflusszytometrie

  1. Nach 7 Tagen der Differenzierung von gereinigten Monozyten, verzichtet werden 1x10 6 Zellen Aliquots der Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in die entsprechende Anzahl von 1,5 - ml - Röhrchen.
  2. Beginnen Zelloberflächenfärbung durch Blockieren Zellen unter Verwendung von 50 ul hitzeinaktiviertem (HALLO) Humanserum, Inkubation bei 4 ° C für 10 min.
  3. Nach der Inkubation Zentrifugen Zellen bei 720 xg für 5 min, Überstand verwerfen.
  4. Zu Zelle pellet, fügen jeweiligen Fluorochrom-konjugierte Antikörper (zB Anti-CD11c oder anti-CD14) und lichtgeschützt für 20 min bei 4 ° C inkubieren. In getrennten Röhren, bereiten einzelne fluorochromgefärbt Proben / ml), da sie für die Kompensation benötigt werden.
  5. Nach der Inkubation, Waschen zweimal Zellen in 1 ml PBS-Puffer und zentrifugieren jedes Mal bei 720 × g für 5 min.
  6. Halten geschützten Zellen aus Licht, resuspendieren in PBS-Puffer bei einer Konzentration von Zellen / 100 & mgr; l für die Durchflusszytometrie-Analyse.
  7. Um auf lebende Zellen zu Gate, fügen 1 ul DAPI zu jedem Röhrchen vor, um die Zellen auf Einzelzell Imaging Durchflusszytometrie Instrument erwerben den Anweisungen des Herstellers nach.

7. Statistische Analyse

  1. Input alle Daten in einer Tabellenkalkulation.
  2. Vergleichen Sie die Ergebnisse der Schüler t-Test und / oder Einweg-ANOVA als angemessen.
  3. Betrachten Unterschiede statistisch signifikant zu sein, wenn p <0,05.

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Results

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Monozyten Ausbeute durch magnetische Trennung höher zu Monozyten Ausbeute nach der Adherence - Methode im Vergleich

Die präsentierten Daten in Abbildung 1 Anzeige PBMC und Monozyten - Zellzahl durch den Trypanblau-Ausschluss - Verfahren am Tag der Isolierung von PBMCs und Trennung von Monozyten. Im Durchschnitt durch die Einhaltung Methode iso...

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Discussion

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Basierend auf den bekannten Schwierigkeiten bei der Isolierung und MDDCs aus menschlichem Blut, ist die vorliegende Studie zielte darauf ab, um einen umfassenden Vergleich von zwei etablierte Methoden zur Erzeugung von MDDCs erzeugen. Das erste Verfahren ist im Vergleich eine gut etablierte traditionelle Methode zur Erzeugung MDDCs durch die Fähigkeit der Monozyten Ausnutzen auf Glas oder Kunststoff (Adhärenz - Methode) 21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist schnell und kostengünstig, und erfordern nicht...

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Disclosures

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Alle Autoren legen keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen.

Acknowledgements

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Diese Forschung wird unterstützt durch das National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, Preis K99/R00 AA021264. Zusätzliche Laborunterstützung im Rahmen des Startpakets wurde von der Abteilung für Immunologie, dem Institut für NeuroImmunpharmakologie, dem Herbert Wertheim College of Medicine und dem FIU-Büro für Forschung und wirtschaftliche Entwicklung erhalten. Gianna Casteleiro wurde von NIH/NIGMS R25 GM061347 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-5442-03Muss bei RT verwendet
werden Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Life Technologies10010-023
ACK Lysing-PufferQualität Biologisch118-156-101
RPMI 1640 MediumLife Technologies22400-089
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)Life Technologies15240-062
Fötales Rinderserum (FBS)Life Technologies16000-044
RoboSep PufferStemCell20104
EasySep Humanes MonozytenanreicherungskitStemCell19059
TC20 Automatisierter ZellzählerBio-Rad145-0101
FITC-DextranSigma AldrichFD4-100MG
Trypanblau-Fleck (0,4%)Life Technologies15250-061
Synergy 2 Multimode-LesegerätBiotek7131000
XTT Natriumsalz-Bioreagenz (XTT)Sigma AldrichX4626-100MG
Dimethylsulfoxid-Bioreagenz (DMS)Sigma AldrichD8418-500ML
Thiazolylblau-Tetrazoliumbromid (MTT)Sigma Aldrichm5655-500MG
Natriumdodecylsulfat (SDS)Bio-Rad161-0302
Phenazin-Methosulfat (DMSO)Sigma AldrichP9626-1G
Inaktiviertes (HI) HumanserumChemiconS1-100ML
Accuri C6 DurchflusszytometerBD Accuri653119
FlowSight Amnis DurchflusszytometerEMD Millipore100300

References

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  1. Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  3. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  4. Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
  5. Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
  6. Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
  7. Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , Nova Publishers. 167-177 (2010).
  8. Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines - past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
  9. Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
  10. Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
  11. Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
  12. Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
  13. Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184(2015).
  14. Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
  15. Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
  16. Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682(2013).
  17. Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
  18. Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
  19. Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
  20. Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
  21. Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
  22. Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
  23. Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus®. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
  24. Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
  25. Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
  26. Yuan, N., et al. The American Association of Immunologists (AAI). , AAI. Miami Beach, FL. (2007).
  27. Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
  29. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  30. El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
  31. Curry, C. V. Differential Blood Count. , http://emedicine.medscape.com/article/2085133-overview (2015).
  32. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
  33. Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
  34. Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
  35. Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
  36. Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
  37. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
  38. Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
  39. Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
  40. Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).

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