Methodenartikel

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

DOI:

10.3791/54300

⸱

27. September 2016

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein hoher Durchsatz, automatisierte, Tabakprotoplasten Produktion und Transformation-Methodik beschrieben. Das Robotersystem ermöglicht massiv parallele Genexpression und Entdeckung im Modell BY-2-System, das auf nicht-Modellpflanzen übersetzbar sein sollte.

Zusammenfassung

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Im letzten Jahrzehnt gab es ein Wiederaufleben in der Verwendung von Pflanzenprotoplasten gegeben, die von Modellarten reichen Spezies zu beschneiden, für die Analyse von Signalwegen, Transkriptionsregulationsnetzwerke, die Genexpression, Genom-Bearbeitung und Genin. Darüber hinaus wurden erhebliche Fortschritte bei der Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten hergestellt worden, die noch mehr Interesse an der Nutzung dieser Systeme für Pflanzengenom erzeugt hat. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Automatisierung der Isolierung von Protoplasten und Transformation von einem 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Tabaksuspensionskultur unter Verwendung einer Roboterplattform entwickelt. Die Transformationsverfahren wurden unter Verwendung eines orangefarbenen fluoreszierendes Protein (OFP) Reportergen (pporRFP) unter der Steuerung des Mosaikvirus 35S-Promotor Cauliflower validiert (35S). OFP-Expression in Protoplasten wurde durch Epifluoreszenzmikroskopie bestätigt. Die Analysen enthalten auch Protoplasten Produktionseffizienz Methoden propidium Jodid. Schließlich wurden Low-Cost-Lebensmittel-Grade-Enzyme für die Protoplasten-Isolierungsverfahren verwendet, wodurch die Notwendigkeit für Labor-Grade Enzyme zu umgehen, die im Hochdurchsatz automatisierte Isolierung von Protoplasten und Analyse zu kostspielig sind. Basierend auf dem Protokoll in dieser Arbeit entwickelt wurde, kann der gesamte Vorgang von Isolierung von Protoplasten zur Transformation durchgeführt werden, in weniger als 4 Stunden, ohne Eingabe vom Bediener. Während das Protokoll in dieser Arbeit entwickelte mit der BY-2-Zellkultur bestätigt wurde, sollten die Verfahren und Methoden auf jede beliebige Pflanze Suspensionskultur / Protoplasten System übersetzbar sein, die Beschleunigung von Pflanzengenomforschung ermöglichen soll.

Einleitung

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In den letzten Jahren hat es erhebliche Impulse auf die Gestaltung von transgenen Kulturen gelegt worden , um verschiedene Krankheiten 1, verleihen Herbizidresistenz 2, verleihen Dürre 3,4 und Salztoleranz 5, verhindern Herbivorie 6, erhöhen Biomasseertrag 7 und verringern Zellwand Widerspenstigkeit überwinden 8. Dieser Trend wurde durch die Entwicklung neuer molekularer Werkzeuge zur Erzeugung transgener Pflanzen Aided, einschließlich Genom-Bearbeitung mit CRISPR und Talens 9 und Gen durch dsRNA - Silencing 10, miRNA 11 und siRNA 12. Während diese Technologien die Erzeugung transgener Pflanzen vereinfacht haben, haben sie erstellt auch einen Engpass, wo die schiere Anzahl der transgenen Pflanzen erzeugt wird, nicht traditionellen Systemen mit gescreent werden, die auf die Pflanzenregeneration verlassen. Im Zusammenhang mit diesem Engpass, während zum Schweigen zu bringen und Genom-Editing-Konstrukte schnell in Pflanzen eingeführt werden kann, sind viele dergezielte Züge nicht den gewünschten Effekt zu erzeugen, die oft erst entdeckt, wenn Pflanzen im Gewächshaus analysiert werden. In dieser Arbeit haben wir ein Verfahren zur schnellen, automatisierten Hochdurchsatz-Screening von Pflanzenprotoplasten entwickelt, die speziell den aktuellen Engpass in der frühen Screening einer großen Anzahl von Genombearbeitung und Gen-Silencing Ziele zu adressieren.

Die Verwendung von Protoplasten zu intakten Pflanzenzellen gegenüber, hat mehrere Vorteile für die Entwicklung eines automatisierten Plattform. Zuerst Protoplasten werden aber nach Aufschluss der Pflanzenzellwand isoliert und mit dieser Barriere nicht mehr vorhanden ist , wird die Transformationseffizienz 13 erhöht. In intakten Pflanzenzellen gibt es nur zwei etablierte Methoden zur Transformation, Biolistik 14 und Agrobacterium -vermittelte Transformation 15. Keines dieser Verfahren kann leicht an Liquid-Handling-Plattformen übersetzt werden, wie Biolistik erfordert spezielle Ausrüstung für transformation, während Agrobacterium -vermittelte Transformation erfordert Kokultur und anschließende Entfernung der Bakterien. Weder sind zugänglich für Hochdurchsatzverfahren. Im Falle von Protoplasten wird routinemßig Transformations 16, unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) -vermittelte Transfektion durchgeführt , die nur mehrere Lösungs Austausch erfordert, und ist ideal für Liquid - Handling - Plattformen geeignet. Zweitens, Protoplasten, per Definition, Single-Zellkulturen sind, und damit die mit Verklumpung und Kettenbildung verbundenen Probleme in pflanzlichen Zellkulturen, die nicht in Protoplasten beobachtet. Im Hinblick auf die schnelle Screening eine plattenbasierte Spektrophotometer, Verklumpung von Zellen, oder Zellen in mehreren Ebenen werden in den Erwerb konsistente Messungen zu Schwierigkeiten führen. Da Protoplasten auch dichter ist als die Kulturmedien sind, sedimentieren sie auf den Boden des Wells, um eine Monoschicht bilden, die für plattenbasierte Spektrophotometrie förderlich ist. Schließlich, während Pflanzenzellkulturen sind primarily aus Kallus 17 abgeleitet, Protoplasten können aus einer Anzahl von Pflanzengeweben geerntet werden, zu der Fähigkeit führt die gewebespezifische Expression zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Fähigkeit, Wurzel- oder blattspezifische Expression eines Gens kann sehr wichtig sein, um Phänotyp Vorhersage zu analysieren. Aus diesen Gründen sind die in dieser Arbeit entwickelten Protokolle wurden validiert Protoplasten isoliert von der weit verbreiteten Tabak (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow' 2 (BY-2) Suspensionskultur mit.

Die BY-2 - Suspensionskultur wurde als "HeLa" Zelle von höheren Pflanzen beschrieben worden ist , wegen seiner allgegenwärtigen Einsatz in der molekularen Analyse von Pflanzenzellen 18. Kürzlich wurden BY-2 - Zellen verwendet , um die Effekte der Pflanze zu untersuchen Stressoren 19-22, intrazelluläre Proteinlokalisation 23,24 und Grund Zellbiologie 25-27 der breiten Verwendbarkeit dieser Kulturen in Pflanzenbiologie demonstriert. Ein zusätzlicher Vorteil der BY-2 Kulturen ist dieFähigkeit , die Kulturen mit Aphidicolin zu synchronisieren, was zu einer verbesserten Reproduzierbarkeit für Genexpressionsstudien führen kann 28. Darüber hinaus wurden für die Extraktion von BY-2 - Protoplasten unter Verwendung von Low-Cost - Enzyme 29,30, als Enzyme traditionell verwendet zur Erzeugung von Protoplasten sind unerschwinglich für Hochdurchsatz - Systeme Methoden entwickelt. Als solches beschriebene Protokoll unter validiert wurde die BY-2-Suspensionskultur verwendet, aber es sollte auf jede Pflanzenzellsuspensionskultur abänderbar ist. Proof-of-Concept - Experimente werden mit einem Orange - Fluoreszenz - Protein (OFP) Reporter - Gen (pporRFP) von den Hartkorallen Porites ausgeführt Porites- 31 unter der Kontrolle des CaMV 35S - Promotors.

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Protokoll

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1. Einrichtung Suspension Zellkulturen

  1. Bereiten Flüssigkeit BY-2 - Medien durch Zugabe von 4,43 g Linsmaier & Skoog Basal Medium, 30 g Saccharose, 200 mg KH 2 PO 4 und 200 & mgr; g von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) zu 900 ml destilliertem Wasser und pH-Wert auf 5,8 mit 0,1 M KOH. Nach dem Einstellen des pH, passen auf 1000 ml mit destilliertem Wasser und Autoklaven Endvolumen. Medien können bei 4 ° C zu 2 Wochen gelagert werden.
  2. Beimpfen eines 250 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der Flüssigkeit BY-2-Medien und einem einzigen Stück BY-2 Kallus (> 1 cm Durchmesser) gezüchtet auf festen BY-2-Medien (flüssig BY-2-Medien mit Zusatz von 1% Agar) und Dichtung mit Aluminiumfolie. Inkubiere Kultur bei 28-30 ° C unter Schütteln für 5 Tage.
    HINWEIS: BY-2-Kallus wird auf festen Medien zur Langzeitlagerung aufrechterhalten, wie Flüssigkulturen schnell überwuchern wird. Kultur Volumen kann je nach Bedarf eingestellt werden, in der Regel eine 100-ml-Kultur fähig sein wird, dreiunddreißig 6-w des Ladensell-Platten.
  3. Transfer 2 ml log-Phase BY-2-Kultur zu 98 ml frischem BY-2-Medien und Inkubation für 5-7 Tage bei 28-30 ° C unter Schütteln.
    Hinweis: Sub-Kultivierung von etablierten Flüssigkulturen können regelmäßig durchgeführt werden, unter Verwendung von 1: 100 Verdünnungen von 5-7 Tage alten Kulturen, anstatt Inokulation mit Kallus.
  4. Mischen Sie die Kultur gründlich, wie Zellen sich schnell absetzen und Transfer 6 ml der Zellkultur zu einem 15 ml konischen Boden Zentrifugenröhrchen und lassen Sie die Zellen für mindestens 10 min absetzen. Stellen Sie das gepackte Zellvolumen auf 50% des Gesamtvolumens von Überstand zu entfernen.
  5. Shake Tube durch Umdrehen und pipettieren 500 ul in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte für die Verdauung. Verwenden Sie weiter Bohrung Pipetten, die Zellen in diesem Stadium zu übertragen, da sie dicht sind und verstopfen Standard-Pipettenspitzen.

2. Isolierung von Protoplasten

  1. Schalten Sie alle Komponenten des Robotersystems (Abbildung 1A) und öffnen Sie die Platte mover Prüfvorgänge planen weichWare. Die Task-Scheduling-Programm integriert die Mikromaschine mit den anderen Geräten Übertragung von Platten zwischen den einzelnen Geräten zu ermöglichen.
  2. Vor dem Experimentieren, definieren Sie die technischen Spezifikationen für die Laborgeräte (zB Platten, Deckel) in das verwendete Protokoll sowie Start- und Endposition für jedes Stück labware, in der Platte Mover Software wie folgt:
    1. Klicken Sie auf Setup aus dem Hauptwerkzeugleiste in der Platte Mover Software und wählen Sie das Verwalten von Containertypen Befehl.
    2. Wenn der Behältertyp wird in der bestehenden Containertyp Bibliothek aufgeführt, dann wählen Sie den entsprechenden Container.
    3. Wenn der Behältertyp nicht in der vorhandenen Container Typbibliothek aufgeführt wird und klicken Sie auf Hinzufügen eines neuen Containertyp angeben.
    4. Einen neuen Behältertyp, legen Sie die Dimensionen des neuen Behälters (Höhe, Breite, Stapelabmessungen und Greifer Offset) in den entsprechenden Registerkarten und klicken Sie auf Speichern Nach dem Hinzufügen.
      1. Wenn die richtigen Abmessungen des Herstellers nicht verfügbar sind, dann genau bestimmen alle Dimensionen auf den Millimeter genau Sätteln mit. Fehler, die die Behälterabmessungen bei der Messung wird zu einem Ausfall der Platte Mover führen.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 bis 2.2.4.1 für alle Containertypen, die die Platte Mover begegnen. Nach Abschluss dieses Schrittes für alle Labware, ist es notwendig, den Anfang und das Ende Position für jeden Behälter (Schritt 2.2.6) zu definieren.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll die labware beinhaltet die 6-Well-Platte, die Deep-Well-Platte, und die 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte.
    6. Um die Start- und Endposition jedes Behälters zu definieren, klicken Sie auf die Start / Ende Registerkarte in einem bestimmten Protokoll. Wählen Sie zuerst die Startposition jedes Behälters. Als nächstes überprüfen Sie die Box für Lidded / Unlidded sowohl an der Start- und Endposition. Wiederholen Sie dies für alle Container.
      HINWEIS: Wenn der Behälter auf einem anderen Stück EQU gelassen werdenipment (anstelle der Platte Mover) der Endstelle kann leer gelassen werden.
  3. Zu diesem Zeitpunkt manuell laden alle Platten in die Ausgangsposition für den gesamten Workflow. Laden Sie die 96-Well-fluoreszierenden Abschirmplatten in Hotel 2, 6-Well-Platten mit BY-2-Zellen in Hotel 3, eine 96 Deepwell-Platte, die für die Transformation verwendet wird, auf die Platte Heizung / Kühler Nest 2 und eine 50 ml konischen Rohr die Enzymlösung (siehe Supplemental Datei, Abschnitt 1.2.2) auf den Multimode Spender enthält.
    1. Wenn Transformation in dem Protokoll durchgeführt wird, vorge laden die 96 Deepwell - Platte mit 10 ul von Plasmid - DNA pro Well (1 ug / ul, A 260/280> 1,8), das die OFP - Reporterkonstrukt und brüten auf der Platte Heizer / Kühler bei 4 ° C. Jede Vertiefung wird für eine einzige Transformation verwendet werden, wodurch die Anzahl von Vertiefungen auf der Versuchsaufbau gefüllt abhängen.
  4. Laden Sie alle Lieferungen und Platten auf dem Automated Liquid - Handling - Plattform in den dafür vorgesehenen Stellen und die Position der einzelnen Elemente in der Automatisierungssteuerungssoftware (Abbildung 1B) definieren.
    1. Legen Sie eine 96-Well - Platte vorbelastet mit 200 ul 40% PEG in MMg (0,4 M Mannit, 100 mM MgCl 2, 4 mM MES, pH 5,7) in Spalte 1, 200 & mgr; l Propidiumiodid (PI, 1 ug / ml) in Spalte 2, und 200 ul Ethanol in Spalte 3 (Nest 2), und eine Schachtel mit Pipettenspitzen im Nest 8.
    2. Die Lage des Labware in der automatisierten Liquid - Handling - Plattform - Software, wählen Sie Extras aus dem Menü und klicken Sie auf Labware Editor zu definieren.
    3. Wählen Sie die Art von labware aus dem Pull - Down - Menü oder definieren einen neuen labware geben Sie die neue Labware - Taste.
    4. Definieren Sie die Position jedes Stück labware ausgewählt durch das Hauptprotokoll Registerkarte auswählen und auf Konfigurieren Labware. Stellen Sie sicher, dass jedes Stück von Labware auf der automatisierten Liquid-Handling-Plattform platziert istdefiniert, bevor das Protokoll läuft.
    5. Um die automatisierten Protokolle auslösen, klicken Sie auf das Profil Explorer - Fenster und wählen Sie den Namen des Protokolls ausgeführt werden (Isolierung von Protoplasten, Zellzahl und PEG-vermittelte Transformation).
    6. Klicken Sie auf Ausführen , um alle Geräte zu initialisieren, die in dem Protokoll verwendet wird.
    7. Schließlich wird in dem Fenster Arbeits Explorer, klicken Sie auf Arbeitseinheit hinzufügen alle Container / labware im System zu überprüfen und das automatisierte Protokoll beginnen.
      HINWEIS: Vollständige Beschreibungen der automatisierten Protokolle sind in der Supplemental-Datei enthalten.

3. Stellen Sie Standardkurve für Zellzahlen

  1. Manuell konzentrieren Protoplasten in einer Konzentration von 1 x 10 6 Protoplasten / ml in einem Volumen von 1 ml. Zentrifuge Protoplasten bei 1.000 xg für 10 min, und entfernt den Überstand.
  2. manuell hinzufügen 900 & mgr; l 70% Ethanol zu der Protoplastenpellet (bei 4 ° C gehalten)und resuspendieren Sie das Pellet. Inkubieren für 10 Minuten auf Eis Zellen zu fixieren.
  3. Füge 100 ul PI (1 ug / ml) zu den Protoplasten, die Kerne zu kennzeichnen und den Nachweis durch den Plattenleser.
  4. Last 80 & mgr; l Flüssigkeit BY-2-Medien in jeder Spalte und Zeile der 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte ab Spalte 2.
  5. In der Spalte 1 einer 96-Well-Fluoreszenzschirmplatte, fügen Sie 70 ul Protoplasten und 50 ul BY-2-Medien in jede Vertiefung in der Spalte.
  6. Die Platte wird in Nest 6 der automatisierten Liquid-Handling-Plattform und führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung.
    1. Um eine serielle Verdünnung auf die automatisierten Liquid - Handling - Plattform durchzuführen, klicken Sie auf Wizard Serielle Verdünnungs starten und das Transfervolumen (60 ul), die Anzahl der Mischungen und Volumen (2, 70 & mgr; l), anfängliche Brunnen (Spalte 1, Zeilen AF) einstellen, Verdünnung Brunnen (Spalten 2-11, Reihen AF) und ansaugen und abgeben Eigenschaften (0,5 mm von gut unten).
    2. Nach der Einstellung der Parameter speichern eind das Protokoll führen.
      HINWEIS: Da alle Protoplasten mit PI (aufgrund Fixierung von Zellen) markiert sind, wird die Fluoreszenz ist proportional zur Konzentration Protoplasten.
    3. Nachdem die serielle Verdünnung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus Nest 9 und in den Plattenleser ein und die Standardkurve Protokoll in der Plattenleser Software.
      HINWEIS: Eine Standardkurve wird dann durch einen Vergleich der Fluoreszenz von PI (Anregung 536 nm / Emission 620 nm) in jeder Vertiefung mit der bekannten Protoplasten Konzentration erzeugt werden.
  7. Nach Abschluss der Leserprotokoll Platte, entfernen Sie die Platte und sammeln Sie alle transgenen Zellen für Autoklaven oder anderen de-Vitalisierung Verfahren wie in Biosicherheit Protokolle definiert ".

4. Die mikroskopische Analyse der Transformation

  1. Entfernen Sie Platte mit transformierten Protoplasten (das Produkt der automatisierten Protokolls 3, Supplemental - Datei) von Hotel 1 des Robotersystems.
  2. Wendeauf inverses Mikroskop, Kamera und Leuchtstofflampe.
  3. Wählen Sie das 10X-Objektiv für die erste auf den Protoplasten konzentriert, schalten Sie die Halogenlampe, und schließen Sie den Auslöser für die Leuchtstofflampe.
  4. Lastplatte auf mikroskopisches System und Fokus auf den Protoplasten Hellfeld-.
  5. Nachdem auf Protoplasten konzentriert, schalten Sie die Halogenlampe, und öffnen Sie den Auslöser für die Fluoreszenzlampe ausgeschaltet.
  6. Wählen Sie das CY3 / TRITC-Filter-Set für die Visualisierung des pporRFP Proteins durch den transgenen Protoplasten zum Ausdruck gebracht.
  7. Scannen Sie jede Vertiefung die Anzahl der Protoplasten zur Bestimmung der pporRFP Fluoreszenzmarker exprimieren.
  8. Berechnen der Transformationseffizienz als die Gesamtanzahl der Protoplasten, die fluoreszierenden Markierung, um die Gesamtanzahl der Protoplasten exprimiert.
  9. Sammeln Sie alle Platten transgenen Zellen in zugelassenen Biosicherheit Beutel für Autoklaven oder anderen de-Vitalisierung Verfahren enthalten, wie in Biosicherheit Protokolle "definiert.

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Ergebnisse

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In der gegenwärtigen Studie variierte die Verdopplungsrate des BY-2 14 bis 18 h in Abhängigkeit von der Temperatur, bei der die Kulturen wurden, im Einklang mit früheren Berichten einer mittleren Zellzykluslänge von 15 Stunden inkubiert. Mit dieser Verdopplungsrate, eine 1: 100 Ausgangs Inokulum wurde verwendet, um Kulturen zu starten, was zu Kulturen mit einem gepackten Zellvolumen (PCV) von 50% in 5-7 Tagen. In dem aktuellen Protokoll, in denen Kulturen in 200 ml Medium gezüchtet wurde...

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Diskussion

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Das oben beschriebene Protokoll wurde für Isolierung von Protoplasten, Aufzählung und Transformation mit der BY-2 Tabaksuspensionszellkultur erfolgreich validiert; jedoch könnte das Protokoll leicht an jede Pflanzensuspensionskultur erweitert werden. Derzeit Isolierung von Protoplasten und Transformation wurde in zahlreichen Pflanzen, darunter Mais (Zea Mays) 10, Karotte (Daucus carota) 32, Pappel (Populus euphratica) 33, Traube (Vitis vinifera) 3...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interesse haben.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde unterstützt durch Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Orbitor RS Microplate MoverThermo Scientific
Bravo Liquid HandlerAgilent
Synergy H1 Multi-Mode ReaderBioTek
MultiFlo FX Multi-Mode DispenserBioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC Ultraflat Heizung/KühlerInheco
Vworks Automation SoftwareAgilentSoftware zum Steuern und Schreiben von Protokollen für Agilent Bravo
Momentum SoftwareThermo ScientificAufgabenplanungssoftware zur Steuerung von Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 SoftwareBiotekSoftware zum Steuern und Schreiben von Protokollen für MultiFlo FX
IX81 Inverses MikroskopOlympus
Zyla 3-Tap MikroskopkameraAndor
ET-CY3/TRITC Filter SetChroma Technology Corp49004
Rohament CLAB EnzymeProbenflascheLow-Cost Celluase
Rohapect UFAB EnzymeProbenflascheLow-Cost Pektinase
Rohapect 10LAB EnzymeProbenflaschekostengünstige Pektinase/Arabinase
Linsmaier & Skoog BasalmediumPhytotechnology LaboratoriesL689
2,4-DichlorphenoxyessigsäurePhytotechnology LaboratoriesD295
PropidiumiodidSigma AldrichP4170
Poly(ethylenglykol) 4000Sigma Aldrich95904-250G-Fehemals Fluka PEG
Propidium iodidFisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
NatriumacetatFisher ScientificBP333-500
MannitolSigma AldrichM1902-1KG
SaccharoseFisher Scientific S5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6-Well-PlatteThermo Scientific103184
96-Well-Deep-Well-Platte 1,2 ml ThermoScientificAB-0564
96-Well-BodenplatteThermo Scientific165305
Finntip 1000 Pipettenspitzenmit breiter BohrungThermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500
7000190

Referenzen

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