Imaging Calcium in Drosophila Bei Eiaktivierung

Eine Änderung der intrazellulären Ca ²⁺ -Konzentration in Ei (Eizelle) Aktivierung ist ein konserviertes Bestandteil aller untersuchten Organismen ^1,2. Dieses Ereignis löst eine breite Palette von Ca ²⁺ -abhängigen Prozessen des Zellzyklus und Übersetzung von gespeicherten mRNAs einschließlich Wiederaufnahme. Aufgrund dieser Anforderung für Ca ^2+, hat die vorübergehende Veränderungen der intrazellulären Ca ²⁺ -Konzentrationen Visualisierung gewesen Zentrum des Interesses.

Historisch wurden Modellorganismen für Studien über Eiaktivierung ausgewählt basierend auf der Größe und Verfügbarkeit ihrer Eier. Verschiedene Visualisierungs Ansätze wurden verwendet , um folgen und zu quantifizieren Veränderungen der intrazellulären Ca ²⁺ -Konzentrationen in diesen Systemen, einschließlich: das Photoprotein Aequorin in Medaka - Fisch ^3; Ca ²⁺ empfindliche fluoreszierende Farbstoffe wie Fura-2 in Seeigel und Hamster ^4,5; und Calcium - Grün-1-Dextran in Xenopus ^6.

Die Erzeugung und Verbesserung von genetisch kodierte Kalzium - Indikatoren (GeCIS) hat die Fähigkeit , Ca zu visualisieren umgewandelt ²⁺ Dynamik in vivo ^7. Diese genetischen Konstrukte werden in spezifischen Geweben und begrenzen die Notwendigkeit für invasive Gewebezubereitungen ⁸ ausgedrückt.

GCaMPs sind ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) -basierten Klasse von GeCIS , die aufgrund ihrer hohen Affinität Ca ²⁺ sehr effektiv gewesen sind, Signal-zu-Rausch - Verhältnis und die Kapazität zu ^9-11 angepasst werden. In Gegenwart von Ca ²⁺ erfährt der GCaMP Komplex eine Reihe von Konformationsänderungen, wobei der Ca ²⁺ Bindung an Calmodulin ausgehend , dass die Ergebnisse in einer erhöhten Fluoreszenzintensität der GFP - Komponente ^9.

GCaMPs wurden in der Forschung über Drosophila Neuronen zu visualisieren Änderungen in intrazellulärem Calcium ¹² extensiv verwendet. Die jüngsten applicatiauf der GCaMP Technologie Ca ²⁺ in reifen Drosophila Eier zu visualisieren hat einen einzigen transienten Ca ²⁺ Welle bei Eiaktivierung ^13,14 enthüllt. Die Ca ²⁺ Welle kann während des Eisprungs in vivo ¹³ oder bei höherer Vergrößerung unter Verwendung eines ex vivo - Aktivierungs - Assay ^13,14 bei geringer Vergrößerung sichtbar gemacht werden. In dem ex vivo Assay werden Einzel reifen Eizellen aus den Ovarien isoliert und aktiviert , um eine hypotonische Lösung, bezeichnet als Aktivierungspuffer, der die Ereignisse in vivo Aktivierung ^15-17 zu rekapitulieren gezeigt wurde.

Diese Ex - vivo - Test ermöglicht eine einfache hochauflösende Visualisierung der Ca ²⁺ Welle unter verschiedenen experimentellen Bedingungen einschließlich pharmakologische Unterbrechung, physikalische Manipulationen und genetische Mutanten. Dieser Artikel zeigt die Herstellung von reifen Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung und the nachfolgende Mikroskopie die Ca ²⁺ Welle mit GCaMP zur Visualisierung verwendet. Dieser Ansatz kann verwendet werden , um die Initiierung und Kontrolle der Ca ²⁺ Welle zu testen und nachgelagerten Ergebnisse zu untersuchen.

Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitung für Dissection

Hinweis: Die beschriebenen Schritte sind hier in Übereinstimmung mit E. Gavis, Princeton University & Weil et. al. ^18. Führen Sie die folgenden Schritte zwei Tage vor Bildgebung.

1. Nehmen Sie eine Fliege Fläschchen ca. 10 ml feste Nahrung enthält, und eine kleine Menge von Trockenhefe zu einer Ecke hinzufügen, weniger als 1 g ausreichend ist.
   Hinweis: Weitere Informationen über das Fliegenflaschen oder Nahrung siehe "Drosophila Wartung" ^19.
2. Merken 1 - 3 Tropfen Wasser, um die Hefe zu hydratisieren.
3. Stellen Sie das Fläschchen beiseite zu einem Winkel von 45 ° und ermöglichen 3-5 min für die Hefe, das Wasser aufzunehmen.
4. Während die Hefe das Wasser absorbiert, wählen Sie eine Flasche von Fliegen UASt- myr GCaMP5 ²⁰ angetrieben durch wannen VP16GAL4 (bezeichnet als GCaMP5) zum Ausdruck , die vor kurzem entstanden sind (ein myristoyumgerechnet Form wurde der GCaMP5 durch Anbinden der GECI an die Membran in dem Ei) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu schaffen, gewählt.
5. Betäuben die Fliegen in der Flasche mit CO ₂ -Gas. Achten Sie darauf, die Flasche umgedreht zu halten, um nicht Fliegen im Nassfutter zu verlieren.
6. Zünglein an der narkotisierten Fliegen auf einen CO ₂ Pad und sortieren 10 bis 15 Frauen und 5 Männer mit einem Pinsel unter einem Binokular mit. Hinweis: Es ist Standard-Männchen sind gesunde Frauen für die Präparation zur Verfügung zu stellen.
7. Wenn das Fläschchen aus Schritt 1.3 bereit ist, fügen Sie in das Fläschchen die ausgewählten Fliegen. Achten Sie darauf, das Fläschchen horizontal zu halten, bis die Fliegen aktiv.
8. Legen Sie das Fläschchen bei 25 ° C für ca. 36 Std.
9. Lege die restlichen Fliegen aus dem CO ₂ - Pad auf der Flasche oder zu verwerfen.

2. Präparieren Drosophila Ovarien

Anmerkung: Die beschriebenen Schritte sind hier gemäß Weil et. al.

1. Nach 36 h, mit CO ₂ , die Fliegen aus dem yeasted Fläschchen betäuben.
2. Sobald die Fliegen in der Phiole narkotisiert werden , um sie auf das Kissen CO ₂ Spitze mit einem Pinsel unter einem Binokular sortiert werden.
3. Wählen Sie eine Frau.
4. Isolieren Sie die beiden Ovarien vom Weibchen. Für detaillierte und vollständige Protokoll siehe Weil et. al. ^18. Zusammenfassend:
   1. Setzen Sie einen kleinen Tropfen mit Sauerstoff angereichert Halocarbonöl (Serie 95) auf einem Nr 1.5, 22 x 40 mm Deckglas.
   2. Fassen Sie die Frau mit einer Pinzette an der vorderen des Bauches.
   3. das Weibchen unter dem Binokular halten, um den zweiten Satz von Zangen verwenden, um sanft den hinteren Teil des weiblichen entfernen.
   4. Wischen Sie das hintere Gewebe aus der zweiten Zange ab.
   5. Druck auf den Bauch Hohlraum mit dem zweiten Zange von der anterioren zum posterioren des Bauches. Die beiden undurchsichtigen Ovarien sollte die Zange halten, wenn sie außerhalb der FEMAle.
   6. Tippen Sie auf die Ovarien in das Öl.
   7. Entfernen Sie alle Gewebe aus der Zange durch die Zange Abwischen.
   8. Wiederholen Sie diese Schritte (2.4.1 - 2.4.7) drei Deck zu erhalten, mit je Ovarien von einer Fliege.

3. Isolierkanne Einzelne Ältere Eier

1. Unter einem Standard-Binokular mit der Vergrößerung 4X gesetzt, auf dem ersten Deckglas aus Schritt 2.4, trennen die beiden Ovarien durch die Eileiter reißen.
2. Führen Sie ein Paar geschlossene Zange in die Mitte eines einzigen Ovar, dabei keine Eikammern zu durchstechen.
3. Legen Sie eine Standard-Sezieren Sonde in die Mitte des Ovar neben der geschlossenen Zange.
4. Vorsichtig ziehen Sie das Sezieren Sonde durch den Ovarien in Richtung des hinteren Pol, wo die reifen Eier (Stufe 14 Eikammern) angeordnet sind.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,4 2 bis 5 mal je nach Größe des Eierstocks und der Anzahl der Eier.
   Anmerkung: Die Zugabe von CO ₂ Hinweis: Ältere Eier sind wahrscheinlich leicht von ovarian Bindegewebe zu trennen.
6. Wenn keine reifen Eizellen außerhalb des Ovars sichtbar sind, weiterhin vorsichtig mit dem Sezieren Sonde necken.
7. Sobald die reifen Eier auf dem Deckglas außerhalb des Ovars sichtbar sind, manövrieren 3 bis 5 in einer Linie in der Mitte des Deckglases.
   Hinweis: Die besten Ergebnisse erzielen, die Sonde sanft an der Seite der Eier laufen.
   Hinweis: Vermeiden Sie auf die Rückenanhänge ziehen, da dies das Ei beschädigen können.
   Hinweis: Abhängig von der künftigen Abbildungsaufbau, richten Sie die Eier etwa 200 & mgr; m Abstand senkrecht zur Deck für maximale Abbildungsbereich.
8. Einmal ausgerichtet, entfernen Sie den Rest des Ovargewebe indem sie sie weg von den ausgerichteten Eier Ziehen der f mitorceps.
9. Entfernen Sie überschüssiges Öl von der Ecke eines medizinischen wischen Abtupfen. Achten Sie darauf, nicht die reifen Eier zu berühren mit der medizinischen wischen als reife Eier, die verloren werden, sind in Kontakt gebracht.
10. Zeichnen Sie ein Fadenkreuz auf dem Deckglas mit einem Marker unter dem Mikroskop Auffinden der Probe zu vereinfachen.
11. Legen Sie das Deckglas an einem sicheren Ort und lassen Sie die vorbereiteten Eikammern auf dem Deckglas für 5 ruhen - 10 min. Dies ermöglicht das Ei im Öl zu begleichen. Die Proben können bis zu 1 h nach Präparation verwendet werden.
12. Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,11 für den Rest der Deckgläser mit Ovarien auf ihnen.

4. Vorbereitung für Imaging

1. Bringen bereit Aktivierungspuffer ¹⁵ auf Raumtemperatur.
   Hinweis: Der Aktivierungspuffer ist ein hypotonischen Puffer: 3,3 mM NaH ₂ PO _4, 16,6 mM KH ₂ PO _4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% Polyethylenglykol 8000, 2 mM CaCl _2, auf pH 6,4 mit einer 1: 5-Verhältnis von NaOH: KOH.Für weitere Informationen siehe Mahowald 1983 ^15. Aliquots Aktivierungspuffer kann über Monate bei -20 ° C gelagert werden und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
2. Transport sorgfältig vorbereitete Deck, Aktivierungspuffer und Glaspipetten auf die Abbildungsmöglichkeiten.
   Hinweis: Ein Weitfeld, konfokale kann sich drehende Scheibe oder Lichtblatt-Mikroskop verwendet werden. Wir empfehlen ein umgekehrtes Mikroskop. Unsere repräsentative Ergebnisse wurden mit einem konfokalen Mikroskop erhalten.
3. Ein Ziel für die gesamte reife Eizelle Bildgebung sollte (20x 0,7 NA hier) gewählt werden.
4. Montieren Sie die erste vorbereitete Deckglas auf den Mikroskoptisch. Achten Sie darauf, nicht die Deckgläser auf der Bühne zu brechen.
5. Qualitativ wählen ein Sichtfeld mit einer reifen Eizelle Kammer zur Aktivierung. Nicht Bild durchstochen Eikammern oder solche mit blebbing in der Membran.
   Hinweis: Für die Schritte 4,6-4,7, Software-Befehle in Abhängigkeit von Mikroskop und Hersteller unterschiedlich.
6. Set Imaging paraMeter für Standard-GFP-Anregung (488 nm) und Emission (500-580 nm). Auch eine Hellfeld-Ansicht, um die reife Eizelle und verdrängte Öl zu visualisieren und zu orientieren einzurichten.
7. Wählen Sie den niedrigsten Z-Ebene, wo reife Eier sind sichtbar und stellen einen vollen Z-Stapel werden für 40 & mgr; m bei etwa 2 & mgr; m pro Schritt getan. Stellen Sie die Parameter so gibt es keine Verzögerung zwischen den Z-Stack-Übernahme ist. Stellen Sie die Zeitreihen für ca. 30 min zu erfassen.

5. Imaging Ex Vivo Eiaktivierung

1. Starten der Bildaufnahme.
2. Warten Sie mit 1 - 2 Badezimmer mit Z-Stapel erworben werden. Dies zeigt die reife Eizelle vor der Aktivierung.
3. Ziehen Sie etwa 300 ul Aktivierungspuffer in einer Glaspipette.
4. Positionierung der Spitze der Glaspipette enthält Aktivierungspuffer bei einem Winkel von 45 ° über dem Deckglas, bewegen sich langsam die Pipette in den Strahlengang, bis er direkt über die reife Eizelle ist abgebildet wird. Die Glaspipette solltesein, 1 bis 2 cm über dem Öl.
5. Hinzufügen von 1 bis 2 Tropfen Aktivierungspuffer in weniger als 5 Sekunden von der Glaspipette. Dies sollte das Öl verdrängen. Vermeiden Zugabe von überschüssigem Aktivierungspuffer oder berühren Sie das Ei mit der Glaspipette, wie es Verschiebung des reifen Eizelle verursachen kann. Achten Sie darauf, nicht das Deckglas mit der Pipette zu berühren, da dies eine Änderung in der Brennebene oder Luftblasen verursachen können im Tauchöl zwischen Objektiv und Deckglas zu bilden.
6. Während das Hinzufügen Aktivierungspuffer während der Bildaufnahme, überprüfen Sie das Hellfeld-Kanal, um sicherzustellen, dass das Öl durch den Aktivierungspuffer verschoben wurde.
   Anmerkung: Dieser wird zunächst als Schatten erscheinen aufgrund der Pipette den Strahlengang zu brechen, sondern auch in dem Auftreten von kleinen Öltröpfchen führen. Einige Öltröpfchen können mit dem reifen Ei verbunden bleiben, die experimentellen Ergebnisse und die Bildqualität beeinflussen.
7. Wenn das Öl nicht aus der anfänglichen Zugabe von Aktivierungspuffer Wiederholung verschoben Schritte 5,4-50,6.
8. Sobald das Öl erfolgreich verschoben wird, damit die Serie der Zeit bis zum Abschluss zu führen.
   Hinweis: Aufgrund bei Aktivierung von Eizellen zu Schwellungen, einige Eikammern der Fokusebene oder Feld dramatisch aus Sicht bei der Zugabe von Aktivierungspuffer bewegen wird. In dieser Situation, die Übernahme zu stoppen und die nächste Deck montieren.
9. Nachdem die Bildfolgeerfassung abgeschlossen ist, speichern Daten.

6. Nach der Akquisition Bildverarbeitung

1. Öffnen Sie den Datensatz mit Fidschi (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) oder eine gleichwertige Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie die entsprechenden Dateien für die Analyse.
2. Um eine Projektion der erfassten Daten bauen wählen: Bild> Stacks> Z-Projekt.
3. Wählen Sie eine Start Z-Scheibe und einen Anschlag Z-Scheibe, in der Regel den ganzen Abschnitt. Wählen Sie eine Projektionstyp, in der Regel auf "Max Intensity". Überprüfen Sie Kontrollkästchen "All Time Frames", um die gewählten Einstellungen für die gesamte Serie zu übernehmen.
4. Obmehr als ein fluoreszierendes Kanal abgebildet worden ist, die Kanäle Tool Bewegung zwischen den Farben zu ermöglichen, einen Verbund zu machen, oder das Bild Graustufen zu machen. Wählen Sie Bild> Farben> Kanäle Werkzeug.
5. Um die Bildhelligkeit ein und wählen Sie den Bildkontrast> Anpassen> Helligkeit / Kontrast.
6. Um ein einzelnes Bild exportieren, bewegen Zeitplan Regler nach relevanten Rahmen und wählen Sie Datei> Speichern unter> JPEG oder in einem bevorzugten Format.
7. Wählen Sie einen Ort und Titel für die exportierte Datei, dann speichern.
   Hinweis: Die Bildrate von der Imaging-Software wird benötigt, mit einem Zeitstempel auf dem Bild zu geben.
8. Um die Zeitreihe als Film exportieren wählen: Datei> Speichern unter> AVI, dann Frame-Rate wählen (~ 7 Bilder pro Sekunde).
9. Wählen Sie einen Ort und Titel für die exportierte Datei, dann speichern.
10. Um die eingestellte Datei in Fidschi-Format, wählen Sie Datei> Speichern.

Hier haben wir gezeigt , wie reif Drosophila Eier für ex vivo Aktivierung vorzubereiten. Eier Exprimieren eines GECI ermöglichen Abbildung von Ca 2+ Dynamik bei Ei - Aktivierung und den Beginn der Embryonalentwicklung (Abbildung 1). Es sollte , daß auf der GCaMP je bemerkt werden , verwendet, und zwar das Vorhandensein einer Myristoylgruppe, Ergebnisse haben kann leichte qualitative Unterschiede 13 14. Wir haben auch eine Rolle für die funktionelle Aktin während Ei Aktivierung durch die Zugabe eines Inhibitors der Aktin - Polymerisation nachgewiesen, Cytochalasin D, auf den Aktivierungspuffer (Abbildung 2) 14.

Eine Voraussetzung für das Zytoskelett bei Eiaktivierung konserviert. In C. elegans, nach der Befruchtung werden Zytoskelett - Komponenten neu organisiert 21,22 die Ein-Zellen Embryo zum ersten asymmetrischen Teilung vorzubereiten. In Seeigel, Störung der cytoskeletal Umorganisation nach Aktivierung wurde durch Verhindern kontraktilen Ringbildung 23 in den Zellzyklus zu beeinflussen , gezeigt. Die Rolle von Aktin in vermittelnde bleibt ein Ca 2+ Welle und ihrem stromabwärtigen Funktion bei Eiaktivierung in Drosophila vollständig aufgeklärt werden.

In Drosophila, Co-Visualisierung der Ca 2+ Wellen- und Aktin - Zytoskelett können mit dieser ex vivo - Aktivierungs - Assay erreicht werden. Zeitreihen von mehreren Kanälen kann der intrazellulären Ca erworben und Dynamik werden 2+ kann mit Änderungen in Actin - Organisation in der Eizelle (Abbildung 3) angepasst werden.

Abb . 1: A Single Ca 2+ Welle von Drosophila Eiaktivierung Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 nach dem einddition der Aktivierungspuffer (AH). Der Anstieg der cytoplasmatischen Ca 2+ entsteht am hinteren Pol (B) und pflanzt (BF) mit einer mittleren Geschwindigkeit von ungefähr 1,5 & mgr; m / sec. Initiierung der Welle wird in der Regel innerhalb von 3 min von der Zugabe von Aktivierungspuffer beobachtet. Nach der Aktivierung liefert die intrazellulären Calciumspiegel des reifen Eizelle Voraktivierung Ebenen (G, H). Siehe ergänzende Film 1 (Gesamtzeit 33 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Die Zugabe von Cytochalasin D zu Activation Buffer stört Ca2+ Wellenausbreitung. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei UASt- myrGCaMP5 exprimierenden Puffer nach Zugabe von Aktivierungs 10 ug / ml Cytochalasin D Endkonzentration (AH) enthält. Während der Ca 2+ Welle am hinteren Pol (A) eingeleitet wird, beeinträchtigt wird , und erreicht nicht die anteriore des Eies (F) (weiße Pfeilspitzen bezeichnen die Vorderseite der Welle). Keine weiteren Änderungen Ca 2+ wurden über 30 min beobachtet). Siehe ergänzende Film 2 (Gesamtzeit 30 min). Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Die gleichzeitige Visualisierung von Actin und Ca 2+ bei Egg Aktivierung in Drosophila. Zeitreihe von ex vivo reifen Drosophila Ei exprimierenden UASt- myrGCaMP5 (Cyan) und UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) nach Zugabe von Aktivierungspuffer (AH). Die Ca 2+ Welle von dem hinteren Pol initiiert und stellt , wie in Fig . 1 erscheint Actin im Laufe der Zeit zu ändern, weiße Pfeilspitzen (A vs H). Der Mangel an Ca 2+ Signaldetektion in der Mitte des reifen Eizelle ist auf die Bewegung der Probe während der Bildaufnahme durch. Maßstabsbalken = 50 um. Max Projektion = 40 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.