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Methodenartikel

In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

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DOI:

10.3791/54329

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20. August 2016

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1Department of Ophthalmology, Far Eastern Memorial Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, National Taiwan University, 3Department of Ophthalmology, National Taiwan University Hospital, 4College of Medicine, National Taiwan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine Primärkultur von Rinder Endothelzellen wurde verwendet, um den Mechanismus der Cornea-Endothelzellen-mesenchymale Transition zu untersuchen. Weiterhin wurde eine Ratte Hornhautendothel cryoinjury Modell kornealen Endothel-mesenchymale Transition in vivo zu demonstrieren.

Zusammenfassung

Hornhaut-Endothelzellen (CECs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit der Hornhaut durch aktives Pumpen. Eine verminderte KEK-Zahl kann zu Hornhautödemen und verminderter Sehschärfe führen. Humane KEK sind jedoch anfällig für ein beeinträchtigtes proliferatives Potenzial. Darüber hinaus wird die Stimulation des Zellwachstums oft durch einen allmählichen endothelial-mesenchymalen Übergang (EnMT) erschwert. Daher ist das Verständnis des Mechanismus von EnMT notwendig, um die Regeneration von CECs mit kompetenter Funktion zu erleichtern. In dieser Studie stellten wir eine Primärkultur von Rinder-CECs her, indem wir die CECs mit Descemet-Membran vom Hornhautknopf schälten und zeigten, dass bovine CECs in der In-vitro-Kultur den EnMT-Prozess zeigten, einschließlich phänotypischer Veränderung, nukleärer Translokation von β-Catenin und EMT-Regulatoren Schnecke und Schnecke. Darüber hinaus verwendeten wir ein Kryoverletzungsmodell für Hornhautendothel von Ratten, um den EnMT-Prozess in vivo zu demonstrieren. Insgesamt bietet die in vitro Primärkultur von Rinder-CECs und in vivo Kryoverletzungsmodelle für das Hornhautendothel von Ratten nützliche Plattformen für die Untersuchung des Mechanismus von EnMT.

Einleitung

Hornhaut-Endothelzellen (CECs) spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Klarheit der Hornhaut und damit der Sehschärfe, indem sie den Hydratationsstatus des Hornhautstromas durch aktives Pumpen regulieren1. Aufgrund des begrenzten proliferativen Potenzials menschlicher CECs nimmt die Zellzahl mit zunehmendem Alter ab, und die Reparatur von Hornhautendothelwunden nach einer Verletzung wird in der Regel durch Zellvergrößerung und -migration und nicht durch Zellmitose erreicht2. Wenn die CEC-Zahl unter einen Schwellenwert von etwa 500 Zellen/mmsinkt 2, kann der Dehydratisierungsstatus des Hornhautstromas nicht aufrechterhalten werden, was zu einer bullösen Keratopathie und einer Beeinträchtigung des Sehvermögens führt3,4.

Das begrenzte proliferative Potenzial menschlicher CECs wurde auf mehrere Faktoren zurückgeführt, einschließlich der verminderten Expression des epidermalen Wachstumsfaktors und seines Rezeptors in alternden Zellen5, des antiproliferativen TGFβ2 im Kammerwasser6 und der Kontakthemmung2,7. Obwohl einige Wachstumsfaktoren, wie z. B. der basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), die Proliferation in einem kultivierten menschlichen Hornhautendothel erhöhen können, bleibt die Kultureffizienz begrenzt8,9. Darüber hinaus können CECs während der ex vivo-Expansion eine phänotypische Veränderung erfahren, die der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) ähnelt10-13. Die endothelial-mesenchymale Transition (EnMT) ist gekennzeichnet durch die Destabilisierung der Zellübergänge, den Verlust der apikal-basalen Polarität, die Umlagerung des Zytoskeletts, die Expression von Alpha-Aktinen der glatten Muskulatur und die Kollagensekretion vom Typ I14. All diese Merkmale können die normale Funktion von KEK beeinträchtigen und die Verwendung von ex vivo kultivierten KEK in der Gewebezüchtung behindern. Darüber hinaus wurde EnMT mit der Pathogenese mehrerer Hornhautendothelerkrankungen in Verbindung gebracht, einschließlich der Fuchs-Endotheldystrophie und der retrokornealen Membranbildung15,16. Daher kann das Verständnis des Mechanismus von EnMT bei der Manipulation des EnMT-Prozesses helfen und die Regeneration von CECs erleichtern, um eine kompetente Funktion zu ermöglichen.

In dieser Studie haben wir eine Methode zur Isolierung von Rinder-CECs aus dem Hornhautknopf beschrieben. In der Primärkultur in vitro wurde der EnMT-Prozess, einschließlich einer phänotypischen Veränderung, der nukleären Translokation von β-Catenin und der EMT-Regulatoren Schnecke und Schnecke, beobachtet. Des Weiteren haben wir eine Methode zum Nachweis von EnMT in vivo unter Verwendung eines Kryoverletzungsmodells für Hornhautendothel bei Ratten beschrieben. Anhand dieser 2 Modelle konnten wir zeigen, dass Marimastat, ein Breitspektrum-Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Inhibitor, den EnMT-Prozess unterdrücken kann. Die beschriebenen Protokolle erleichtern die detaillierte Analyse des EnMT-Mechanismus und die Entwicklung von Strategien zur Manipulation des EnMT-Prozesses für die weitere klinische Anwendung.

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Protokoll

Alle folgten die Verfahren in dieser Studie mit der Association for Research gewährt in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der National Taiwan University Hospital genehmigt.

1. Isolierung, Primärkultur Vorbereitung, und Immunfärbung von Bovine MEL

  1. Erwerben Sie frische Rinderaugen von einem lokalen Schlachthof.
  2. Desinfizieren der Augen in einer 10% w / v Povidon-Iod-Lösung für 3 min. Wasche sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) -Lösung.
  3. Ernten Sie die Hornhaut-Taste mit einem Skalpell und Schere unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie die Descemet-Membran mit einer Pinzette unter einem Binokular (beachten Sie, dass in dieser Studie wurden die Rinderaugen von einem örtlichen Schlachthof entkernte, daher ist die erste Studie Verfahren war die Desinfektion der preenucleated Augen im Labor).
  4. Inkubieren der Membran Descemet in 1 ml tryPSIN bei 37 ° C für 30 min. Sammeln Sie die Rinder MEL durch Zentrifugation bei 112 × g für 5 min. Resuspendieren der Zellen in 1 ml supplementiert hormonellen epithelial Medium (SHEM) gleiche Volumina von HEPES-gepufferter Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium und Ham-F12-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 0,5% Dimethylsulfoxid, 2 ng / ml des humanen epidermalen Wachstumsfaktor, 5 mg / ml Insulin, 5 mg / ml Transferrin, 5 ng / ml Selen, 1 nmol / l des Choleratoxins, 50 mg / ml Gentamicin und 1,25 mg / ml Amphotericin B.
  5. Seed die Zellen (etwa 1 x 10 5 Zellen pro Auge) in eine 6 cm Schale. Kultur sie in der SHEM. Inkubiere die Schale bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 in Luft. Ändern Sie das Kulturmedium alle 3 Tage.
  6. Wenn die Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie sie in PBS und Inkubation sie in 1 ml Trypsin bei 37 ° C für 5 min. Sammeln Sie sie durch Zentrifugation bei 112 × g für 5 min. Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml des SHEM.
    1. Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer. Seed die Zellen auf Deckgläser mit einer Dichte von 1 x 10 4 pro Well in einer 24-Well - Platte und Kultur die Zellen in der SHEM. die ENMT Unterdrückungseffekt von Marimastat zur Untersuchung, inkubiere die Zellen in SHEM mit 10 uM Marimastat in das Kulturmedium gegeben, und das Kulturmedium alle 3 Tage.
  7. Fixieren Sie die Zellen in einem angegebenen Zeitpunkt mit 250 ul 4% Paraformaldehyd, pH 7,4, für 30 min bei Raumtemperatur. Permeabilisieren mit 250 ul 0,5% Triton X-100 5 min. Block mit 10% Rinderserumalbumin für 30 min.
  8. Inkubieren Sie die Zellen mit primären Antikörpern gegen aktive Beta-Catenin (ABC), Schnecke und Schnecke über Nacht bei 4 ° C. Die Verdünnung der primären Antikörpern verwendet wird, ist 1: 200. Die Antikörper werden in Antikörperverdünnungslösung, bestehend aus 10 mM PBS, 1% w / v Rinderserumalbumin und 0,09% w / v Natriumazid verdünnt.
  9. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 15 min und Inkubation derm mit dem Alexa Fluor-konjugiertem sekundärem Antikörper (1: 100 in Antikörperverdünnungsmittel) bei Raumtemperatur für 1 Std.
  10. Counterstain den Zellkern, indem die Zellen mit 2 & mgr; g / ml 4 abdeckt ', 6-diamidino-2-phenylindole, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS für 15 Minuten, und montieren sie mit Anti-Fading-Montagelösung.
  11. Erhalten Immunofluoreszenz Bilder bei den Anregungswellenlängen von 405 und 488 nm durch ein Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop mit 20X Objektivvergrößerung verwendet.

2. Rat Korneaendothelium cryoinjury Modell und intrakamerale Injection

  1. Anästhesieren 12 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley Ratten mit intramuskulären Injektionen von 2% Xylazin (5,6 mg / kg) und Tiletamin und Zolazepam (18 mg / kg). kneifen sanft die Haut der Tiere geeignete Anästhesie in Abwesenheit von Haut Zucken zu bestätigen.
  2. Flößen Sie einen Tropfen von 0,5% Proparacainhydrochlorid dem rechten Auge jeder Ratte Augenschmerzen und Blinzelreflex zu minimieren. einflößenTetracyclin-Salbe auf das linke Auge kornealen Trockenheit zu verhindern.
  3. Kühlen Sie eine Sonde aus rostfreiem Stahl (Durchmesser = 3 mm) in flüssigem Stickstoff. Tragen Sie die Sonde aus rostfreiem Stahl an die zentrale Hornhaut des rechten Auges für 30 Sekunden. Häufig PBS für das rechte Auge während des Verfahrens zu vermitteln kornealen Trockenheit zu verhindern.
  4. Instill 0,1% Atropin und 0,3% Gentamicinsulfat unmittelbar nach cryoinjury und einmal täglich Augenschmerzen zu lindern von Ziliarspasmus ergeb und Infektion zu verhindern.
    1. Nach dem Eingriff halten die Ratten mit einer Heizlampe erwärmen und ihre Genesung alle 15 Minuten nach der Narkose zu beobachten, bis sie Motor wieder die Kontrolle. Zusätzlich Tetracyclin-Salbe auf das rechte Auge gelten für Hornhauttrockenheit während der Erholungsphase zu verhindern.
  5. Wiederholen Sie die Hornhaut cryoinjury für 3 aufeinander folgenden Tagen.
  6. Für die Bereitstellung von Marimastat oder bFGF in die vordere Kammer des Rattenaugen, anästhesieren die Ratten, wie vorher beschrieben. Flößen Sie einen Tropfenvon 0,5% Proparacainhydrochlorid in das rechte Auge Augenschmerzen und Blinzelreflex zu minimieren.
  7. Spülen Sie die Augenoberfläche mit sterilem PBS. Führen Vorderkammer Parazentese unter einem Operationsmikroskop mit einer 30 G-Nadel in eine 1 ml Spritze am paralimbal klare Hornhaut in einer Ebene oberhalb und parallel zu der Iris befestigt Einsetzen.
  8. Drehen Sie die Nadel Schräge nach oben, und drücken Sie leicht die Hornhautwunde etwas wässrigen Humor und reduzieren den intraokularen Druck abzulassen. Injizieren 0,02 ml des intrakameral Droge. Vorsichtig komprimieren während der Nadel Rückzug der Nadel-Darm-Trakt mit einem Wattestäbchen.
  9. Fotografieren Sie das äußere Auge bei einer angegebenen Zeitpunkt unter dem Operationsmikroskop.

3. Ernten der Ratte Corneal Knopf und Immunostaining

  1. Um die Ratten einschläfern, legen Sie sie in einer Euthanasie Kammer und ziehen lassen 100% CO 2 bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute. Pflegen CO 2 Infusion für eineweitere Minute nach mangelnder Atmung und verblasste Augenfarbe.
  2. Dringen die Ratte Auge am Limbus mit einer scharfen Klinge. Schneiden Sie die Hornhaut mit Hornhaut-Schere entlang des Limbus. Flatten die Cornea auf einer Folie. Nehmen Sie zusätzliche radiale Einschnitte, wenn die Cornea einrollen.
  3. Fix die Cornea mit 250 ul 4% Paraformaldehyd, pH 7,4, für 30 min bei Raumtemperatur. Permeabilisieren mit 250 ul 0,5% Triton X-100 für 5 min, und der Block mit 10% Rinderserumalbumin für 30 min.
  4. Inkubieren der Kornea mit primären Antikörpern gegen ABC über Nacht bei 4 ° C mit einer Verdünnung von 1: 200 in Antikörperverdünnungsmittel. Waschen Sie die Cornea zweimal mit PBS für 15 min, und inkubieren sie mit dem sekundären Antikörper (1: 100 in Antikörperverdünnungsmittel) bei Raumtemperatur für 1 Std. Counterstain den Zellkern, indem die Zellen mit 2 & mgr; g / ml 4 abdeckt ', 6-Diamidino-2-phenylindol und die Zellen zweimal waschen mit PBS für 15 min.
  5. Montieren Sie die Cornea in der Anti-Fading-Montagelösung. ObTain die Immunfluoreszenz-Bilder bei Anregungswellenlängen von 405 und 561 nm mit einem Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop bei 20facher Objektivvergrößerung.

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Ergebnisse

Nach der Isolierung von Rinder-MEL wurden die Zellen in vitro kultiviert. Abbildung 1 zeigt die Phasenkontrastbilder der Rinder-MEL. Die hexagonale Form der Zellen bei Konfluenz angedeutet , dass die Zellen durch Fibroblasten während der Zellisolierung Hornhaut Stroma nicht kontaminiert wurden. Abbildung 2 zeigt die Immunfärbung , die Antikörper gegen ABC, Schnecke und Schnecke mit in einem angegebenen Zeitpunkt durchgeführt wurde. Abgesehen von...

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Diskussion

CECs sind für ihre Neigung bekannt ENMT während der Zellproliferation zu unterziehen. Entwicklung von Strategien zur Unterdrückung des ENMT Prozess zu therapeutischen Zwecken, ein gründliches Verständnis der ENMT Mechanismus notwendig. Wir 2 beschriebenen Modelle ENMT, nämlich die Rinder-CEC in - vitro - Kulturmodell und Ratte Korneaendothelium cryoinjury Modell zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten die ENMT Prozess in beiden Modellen. Darüber hinaus wurde die ENMT Unterdrückungseffekt von Marimast...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu deklarieren.

Danksagungen

Wir danken den Mitarbeitern des Second Core Lab, Department of Medical Research, National Taiwan University Hospital für ihre technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
TrypsinThermoFisher Scientific12604-013
Dulbecco' s modifiziertes Eagle-Medium und Ham's F12-MediumThermoFisher Scientific11330
fötales RinderserumThermoFisher Scientific26140-079
DimethylsulfoxidSigmaD2650
humaner epidermaler WachstumsfaktorThermoFisher ScientificPHG0311
Insulin, Transferrin, Selen & nbsp;ThermoFisher Scientific41400-045
CholeratoxinSigmaC8052-1MG
GentamicinThermoFisher Scientific15750-060
Amphotericin BThermoFisher Scientific15290-026
ParaformaldehydElektronenmikroskopie Sciences111219
Triton X-100SigmaT8787 
RinderserumalbuminSigmaA7906
MarimastatSigmaM2699-25MG
antiaktiver Beta-Catenin-AntikörperMillpore05-665
Anti-Schnecken-AntikörperSanta cruzsc28199
Anti-Schnecken-AntikörperSanta cruzsc15391
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) sekundär AntikörperThermoFisher ScientificA-11001für die Färbung von ABC von Rindern,
Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L), SekundärantikörperThermoFisher ScientificA-11003für die Färbung von ABC von Ratten, Hornhautendothel
, Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H+L), SekundärantikörperThermoFisher ScientificA-11008für die Färbung von Schnecken und Nacktschnecken von Rindern, CECs,
AntikörperverdünnungsmittelGenemed Biotechnologies10-0001
4',6-Diamidino-2-phenylindolThermoFisher ScientificD1306
EinbettmediumVector LaboratoriesH-1000
konfokales Laser-Scanning-MikroskopZEISSLSM510
Xylazin &BayerN/A
Tiletamin plus ZolazepamVirbacN/ATierarzneimittel
Proparacainhydrochlorid ophthalmische LösungAlconN/ATierarzneimittel
0,1% AtropinWu-Fu Laboratories Co., LtdN/Aklinisches Medikament 
0,3% GentamicinsulfatSinphar GroupN/Aklinisches Medikament 
basischer Fibroblasten-WachstumsfaktorThermoFisher ScientificPHG0024klinisches Medikament 
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Referenzen

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